植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定
过氧化氢酶的活性测定
过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法（滴定法、比色法）【原理】过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)R(Fe+3OH－)2+ H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5 H2O2+2 KMnO4+4H2SO4-------- 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。
【试剂】10% H2SO4；0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8；0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，用0.1mol/L草酸溶液标定；0.1mol/L H2O2：市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4•2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1L。
【方法】1.酶液提取取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2.取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入高温灭活酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。
过氧化氢酶活力的测定实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：实验35过氧化氢酶的活性测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使h2o2发生累积。
h2o2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。
过氧化氢酶可以清除h2o2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。
因此，植物组织中h2o2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。
本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。
一、过氧化氢含量的测定【原理】h2o2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被h２so4溶解后，在415nm波长下比色测定。
在一定范围内，其颜色深浅与h2o2浓度呈线性关系。
【仪器和用具】研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。
【试剂】100μmol/Lh2o2丙酮试剂：取30%分析纯h2o257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（w/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。
【方法】1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表40-1加入试剂。
待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml 刻度，415nm波长下比色。
2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视h2o2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。
(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。
沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。
(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。
过氧化氢酶(CAT)活性的测定
过氧化氢酶（CAT）活性的测定：紫外吸收法一、目的与要求过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
二、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
过氧化氢在240nm 波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液的吸光度（A240）随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
三、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦或其它叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2.紫外分光光度计；3. 离心机；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液（pH7.8: 0.2mol/L Na2HP04 91.5 ml; 0.2mol/LNaH2P048.5 ml）；2．0.1 mol/LH2O2 (30%的H2O2溶液5.68ml稀释至1000ml)二、实验步骤：1、酶液提取称取新鲜植物叶片或其它组织0.5g，置于研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨匀浆后，转入25ml 容量瓶中，并用缓冲液冲研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀，将容量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上清液在4000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢粗提液，5℃下保存备用。
2、测定10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表1-1顺序加入试剂。
25℃预热后，逐管加入0.6ml0.1mol/l的H2O2,每加完1管立即记时，并迅速倒入石英比色杯中，260nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测完后，按式（1-1）计算酶活性。
3、结果计算以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（μ）。
过氧化物酶、过氧化氢酶活性测定方法及试剂配制
过氧化物酶（POD ）活性测定【实验原理】过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中，在有H 202存在条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色的4-邻甲氧基苯酚，可用分光光度计测生成物的含量来测定活性。
【实验试剂】 愈创木酚、30%过氧化氢、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L 磷酸缓冲液（pH6.0）、反应混合液[100mmol/L 磷酸缓冲液（Ph6.0）50mL ，加入愈创木酚28uL,加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液溶解冷却后，加入30%过氧化氢19uL ，混合均匀保存在冰箱中]【方法步骤】（1）、粗酶液的提取 称取小麦叶片0.25g ，加20mmol/LKH2PO4 2.5mL ，于研钵中研成匀浆，以4000r/min 离心10分钟，收集上清液保存在冷处，所得残渣再用20mmol/LKH2PO4 2.5mL 提取一次，全并两次上清液，所得的即为粗酶提取液(酶活性过高，稀释10倍)。
（2）、酶活性的测定 取试管3只，于一只中加入反应混合液3mL ，KH2PO41mL ，作为校零对照，另外三只中加入反应混合液3mL ，稀释后的酶液1mL （如表1），立即开启秒表，于分光光度计470nm 波长下测量OD 值，每隔1min 读数一次（4min ）。
以每分钟表示酶活性大小，将每分钟OD 值增加0.01定义为一个活力单位。
表1 紫外吸收法测定POD 酶活性配置表4.结果计算以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ]表示之。
也可以用每 min内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
POD 总活性[u/g(FW)]=式中：POD 总活性以酶单位每克鲜重表示。
其中 △470=ACK-AE比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。
ACK ——照光对照管的吸光度。
AE ——样品管的吸光度。
Vt ——样品液总体积，mL 。
过氧化氢酶(CAT)活性测定
过氧化氢酶(CAT)活性测定高锰酸钾滴定法(李合生．植物生理生化实验原理和技术[M]．北京：高等教育出版社．2000．165-167)一、原理过氧化氢酶(catalase，CA T)普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，它属于血红蛋白酶，含有铁，能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
22R(Fe OH3+－) R(Fe2+2 2)2+2 H O2＋O2因此，可以根据H2O2的消耗量或者O2的生成量测定该酶活力的大小。
在该体系中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2，即可求出消耗的H2O2的量。
5H2O2+2KMnO4+4H2SO45O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4二、材料、仪器设备及试剂(一)材料植物器官(花瓣、叶片等)(二)仪器设备冰箱、离心机、微量加样器(1ml、20μl、100μl)、移液管、精密电子天平、试管、研钵、剪刀、镊子、三角瓶、恒温水浴、容量瓶、酸式滴定管(三)试剂(1)10% H2SO4(2)0.2mol/L PH7.8磷酸缓冲液(3)0.1mol/L高锰酸钾标准液：称取KMnO4(AR)3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000mL，再用0.1mol/L草酸溶液标定(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2(大约等于17.6 mol/L)5.68mL，稀释至1000mL，用0.1mol/L高锰酸钾标准液(在酸性条件下)进行标定(5) 0.1mol/L草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定溶1000mL。
三、试验步骤(一)酶液提取取植物材料2.5g，加入PH7.8的磷酸缓冲液少量，研磨成匀浆，转移至25mL容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定溶，4000r/min离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定
【高中生物】高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定高中生物实验：过氧化氢酶活性的测定原理过氧化氢酶广泛存在于所有植物组织中。
它能将过氧化氢分解为氧气和水，保护生物体免受过氧化氢的毒性影响。
测定过氧化氢酶的方法包括测压法、滴定法和分光光度法。
氧电极法是一种灵敏、快速的氧释放速率测量方法。
氧释放速率与过氧化氢酶活性成正比。
仪器药品氧电极记录仪电磁搅拌器超级恒温水浴注射器、微量注射器和容量瓶反应杯亚硫酸钠过氧化氢酶50mmol/l磷酸缓冲液，ph7.0(见附表2)。
50mmol/L过氧化氢溶液：取30%过氧化氢1.4ml，用磷酸缓冲液稀释至250ml。
标准过氧化氢酶溶液：称取过氧化氢酶(sigma)1.0mg(110u/mg)，溶于50mmol/l磷酸缓冲液(ph7.0)11ml中，使酶浓度为10u/ml。
操作步骤1.仪器的标定按照实验步骤88校准仪器，以获得记录纸上每个小网格的等效氧含量。
2.绘制酶活性标准曲线（1）在反应杯中加入过氧化氢磷酸缓冲液，打开电磁搅拌器搅拌10分钟，插入电极，吸收电极外溢出的溶液，调整换档旋钮，使记录笔约满刻度的10-20%，使记录纸四处移动，温度在1-2分钟后达到平衡，记录笔画出一条直线。
(2)用微量注射器从电极塞小孔中注入10μ110u/ml过氧化氢酶，立即记录最初90秒钟内的氧释放曲线。
（3）按照上述相同步骤，注入不同浓度的过氧化氢酶10μL（例如，浓度为20、30、40、50U/ml），并记录氧释放曲线。
(4)取放氧曲线的直线部分，根据其斜率及走纸速度，计算每分钟氧的释放量。
（5）以过氧化氢酶活性单位为横坐标，以每分钟释放的氧气量为纵坐标绘制标准曲线。
3.样品测定（1）将50mmol/L过氧化氢磷酸缓冲液注入反应室，搅拌10分钟，插入电极，记录10分钟后，以直线μL注入适当浓度的待测酶溶液样品，立即记录前90秒内的析氧曲线。
(2)根据样品的放氧曲线，计算得到每分钟的放氧量，在标准曲线上查得酶活性大小。
植物组织中SOD活性、MDA含量的测定方法
植物组织中SOD活性的测定超氧物歧化酶（SOD）是需氧生物中普遍存在的一种含金属酶。
它与过氧化物酶、过氧化氢酶等酶协同作用防御活性氧或其他过氧化物自由基对细胞系统的伤害；SOD可以催化氧自由基的歧化反应，生成过氧化氢、过氧化氢又可以被过氧化氢酶转化成无害的分子氧和水。
【原理】依据SOD抑制NBT在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧的条件下极易再氧化而产生02-，02- 可将NBT还原为蓝色的甲，后者在560 nm 处有最大吸收。
而SOD作为氧自由基的清除剂可抑制此反应。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性越低，反正酶活性越高。
一个酶活单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50%）时所需的酶量。
【仪器与用具】离心机；分光光度计；进样器；紫光灯（4000 Lx）；15 mm×150 mm试管；黑色硬质套。
【试剂】①0.05mol/L 磷酸缓冲液PBS（pH=7.8）提取介质50mmol/L PBS（pH=7.8）内含1% 聚乙烯吡咯烷酮② 130mmol/L 甲硫氨酸溶液：称1.9397g Met，用PBS 7.8 进行溶解并定容至100ml；③ 750umol/L NBT：称0.06132g NBT，用PBS 7.8进行溶解并定容至100ml，避光保存；④20umol/核黄素溶液：称0.0075g核黄素，用蒸馏水溶解定容至1000ml，避光保存，现用现配；⑤ 100umol/L的EDTA-Na2溶液：称0.0372g EDTA-Na2 ，用PBS 7.8定容至1000ml。
【方法】1.酶液提取称取植物叶片0.2g（去叶脉）于预冷的研钵中，加1ml预冷的提取介质在冰浴下研磨成匀浆，加入提取介质冲洗研钵，并使最终体积为2ml，于4℃、10000r/min离心15min，上清液即为SOD粗提液。
2.显示反应取透明度好、质地相同的15mm×150mm试管4支，2支为测定，2支为对照，按下表加入试剂。
过氧化氢酶活力的测定实验报告doc
过氧化氢酶活力的测定实验报告doc过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：过氧化氢酶活性测定实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4.0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
过氧化氢酶活力测定CAT
过氧化氢酶活力测定碘量法目的意义过氧化氢酶(Catalase，CAT)普遍存在于植物所有组织中，其活性与植物的代谢强度、抗衰老、抗寒、抗病能力有一定关系，在生产实践中常进行测定。
学习几种测定CAT活性的方法，理解其测定原理。
一、实验原理过氧化氢酶能把过氧化氢分解为水和氧，其活性大小，可以一定时间内分解的过氧化氢量或生成氧气的量来表示。
H202的测定常采用氧化还原滴定法，碘量法是其经典方法。
其原理是在有催化剂钼酸铵存在时，过氧化氢与碘化钾反应，放出游离碘，再用硫代硫酸钠滴定碘，以淀粉指示剂指示滴定终点。
根据空白和测定二者滴定值之差，即可算出酶分解的过氧化氢量。
其反应为：H2O2十2KI十H2S04→I2十K2S04十2H20I2+2Na2S2O3→2NaI+NaS406二、材料、设备与试剂1．植物材料小麦或其他植物新鲜叶片。
2．主要设备天平、研钵、100ml容量瓶、50ml酸滴定管、移液管(1、5、10ml)、100ml 三角瓶。
3．试剂(1)碳酸钙粉末(2)1.8mol/L的硫酸取1000ml烧杯1只，加入约500ml蒸馏水，边搅拌边加入100ml 浓硫酸，冷却后用量瓶定容到1000ml。
(3)10％的钼酸铵溶液：称取钼酸10g，溶于蒸馏水中使成100ml。
(4)1％淀粉溶液：取1g可溶性淀粉于小烧杯中加约20ml水调匀，慢慢倾入约80m1沸水中，在搅拌下加热至重新沸腾冷却后贮于滴瓶中(可加少量HgCl2防腐)。
(5)0.05mol/L硫代硫酸钠称取Na2S2O3·5H2O 25g，溶于新沸腾并冷却过的蒸馏水中，加入约0.1gNa2CO3，，并稀释至1升，保存于棕色试剂瓶中，放置暗处。
一天后进行标定。
标定方法：精确称取分析纯K2Cr207约0．15g于500ml三角瓶中，加30ml蒸馏水溶解，加入2gKI和5ml 6mol/L盐酸，在暗处放置5min，然后用水稀释至200ml，用0.05mol/L 硫代硫酸钠溶液滴定，当溶液由棕红色变为浅黄色时，加入1ml淀粉溶液，继续滴至溶液由蓝色变为亮绿色(Cr3+离子的颜色)为止。
过氧化氢酶活性测定
过氧化氢酶活性测定过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
紫外吸收法一、原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。
根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与设备与试剂】1、材料小麦叶片等。
2、仪器设备研钵；离心机；250ml容量瓶；移液管（、2ml各2支）；10ml试管3支；恒温水浴；紫外分光光度计；3、试剂L 磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；L H2O2（用L高锰酸钾标定）。
【方法】1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷的磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。
混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
5℃下保存备用。
2.酶活性测定取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表2-14-1顺序加入试剂。
表2-14-1 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表将S0号管在沸水浴煮1min 以杀死酶液，冷却。
然后将所有试管在25℃预热后,逐管加入 L 的H 2O 2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比色皿中，240nm 下测定吸光度，每隔1min 读数1次，共测4min ，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：以每分钟A 240减少的酶量为1个酶活单位（U ）。
过氧化氢酶活性U/=Wt V V A S T ⨯⨯⨯⨯∆1.0240 ∆A 240= A S0－2)(21S S A A + 式中 A S0—加入煮死酶液的对照管吸光值；A S1, A S2—样品管吸光值；Vt —粗酶提取液总体积（ml ）；V 1—测定用粗酶液体积（ml ）；FW —样品鲜重（g ）；—A 240每下降为1个酶活单位（u ）；t —加过氧化氢到最后一次读数时间（min ）。
植物体内氧自由基含量,过氧化氢,丙二醛,脯氨酸的测定
植物体内氧自由基含量的测定一、目的生物体内的一部分氧分子，在参与酶促或非酶促反应时，若只接受一个电子，会转变为超氧阴离子自由基（O2－）。
O2－既能与体内的蛋白质和核酸等活性物质直接作用，又能衍生为H2O2羟自由基（·OH）、单线态氧（1O2）等。
·OH可以引发不饱和脂肪酸脂质（RH）过氧化反应，产生一系列自由基，如：脂质自由基（·R）、脂氧自由基（RO·）、脂过氧自由基（ROO·）和脂过氧化物（ROOH），自由基积累过多时会对细胞膜及许多生物大分子产生破坏作用。
本实验主要掌握植物体内氧自由基的测定原理及方法。
二、原理在生物体中，氧作为电子传递的受体，得到单电子时，生成超氧阴离子自由基（O2－）。
利用羟胺氧化的方法可以测定生物系统中O2－含量。
O2－与羟胺反应生成NO2－，NO2－在对氨基苯磺酸和α－萘胺的作用下，生成粉红色的偶氮染料（对－苯磺酸－偶氮－α－萘胺）。
取生成物在530nm波长处测定吸光度（A）值，根据A530值可以算出样品中O2－含量。
反应式如下：NH2OH + 2O2－＋ H＋→ NO2－＋ H2O2 ＋ H2O三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：花生、绿豆、大豆黄化幼苗的下胚轴及其他植物叶片。
2. 仪器设备：高速冷冻离心机；分光光度计；恒温水浴锅；研钵；试管；移液管；试管架；移液管架；洗耳球等。
3. 试剂配制：50 mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）1 mmol·L－1盐酸羟胺17 mmol·L－1对氨基苯磺酸（以冰醋酸：水 = 3 ：1配制）7 mmol·L－1α－萘胺（以冰醋酸：水 = 3 ：1配制）50nmol·ml－1NaNO2母液四、实验步骤1. 提取液制备称取1g植物叶片放入冰浴的研钵中，加入50mmol·L－1磷酸缓冲液（pH7.8）5ml, 研磨成匀浆，在1000r/min，4℃下离心10min，取上清液再以15000r/min，4℃下离心20min，第二次上清液即为样品提取液。
过氧化氢酶活力的测定实验报告doc
过氧化氢酶活力的测定实验报告篇一：过氧化氢酶活性测定实验29 过氧化氢酶活性测定（高锰酸钾滴定法）过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。
一、原理过氧化氢酶（catalase）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量。
二、材料、仪器设备及试剂（一）材料：小麦叶片（二）仪器设备：1. 研钵；2. 三角瓶；3. 酸式滴定管；4. 恒温水浴；5. 容量瓶。
（三）试剂：1. 10%H2SO4；2. 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液；3. 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4（AR）3.1605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；4. 0.1mol/L H2O2市售30%H2O2大约等于17.6mol/L，取30%H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/L KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；5.0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4.2H2O 12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1000ml。
三、实验步骤（一）酶液提取：取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
（二）取50ml三角瓶4个（两个测定，另两个为对照），测定瓶加入酶液2.5ml，对照加煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
酶活性测定
实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶〔SOD〕、过氧化氢酶〔CAT〕、过氧化物酶〔POD〕等。
它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反响。
所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。
一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶〔SOD〕普遍存在于动、植物体内，是一种去除超氧阴离子自由基〔〕的酶，它催化以下反响：2反响产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。
此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑〔NBT〕在光下的复原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下，核黄素可被光复原，被复原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑复原为蓝色的甲。
后者在560nm处有最大吸收，而SOD可去除从而抑制了甲的形成。
于是光复原反响后，反响液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
一个酶活性单位定义为将NBT的复原抑制到对照一半〔50％〕时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯〔反响试管处光照强度为4000lx〕；试管数支；黑色硬纸套。
【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液〔〕。
2．提取介质磷酸缓冲液〔内含1％聚乙烯吡咯烷酮〕。
3．130mmol/L甲硫氨酸〔Met〕溶液：称取 9g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
4．750μmol/L氮蓝四唑〔NBT〕溶液：称取61.33mg NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。
5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21mg EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1 000ml。
6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53mg核黄素定容至1 000ml避光保存。
紫外分光光度法测定植物过氧化氢酶活性
过氧化氢酶是植物体内清除过氧化氢的主要 酶 类[1]，植 物代谢过程会产生活性氧自由基，再转化成过氧化氢，而过 氧化氢对植物细胞具有损伤作用[2]。过氧化氢酶的主要功 能 即清除植物代谢过程产生的过氧化氢，从而对植物细胞具有 保 护 作 用[3]。植 物 过 氧 化 氢 酶 还 与 环 境 污 染 与 胁 迫 、 [1，4] 营 养 元 素 缺 乏 、 [5，6] 病 虫 害 危 害 有 关 。 [1，7] 研 究 植 物 过 氧 化 氢 酶 ，可 以认识植物的生长状况、了解植物是否受到损伤、揭示植物 与不良环境的关系以及为植物营养诊断提供依据。因此，探 索一种简便快速的测定植物过氧化氢酶活性的方法，具有 重要的科学和实用价值。当前对植物过氧化氢酶活性的测定 方法，有的需要特殊仪器装置，有的操作和人为误差大，有 的需要昂贵试剂，有的操作繁琐，都不利于批量样品分析和 快速测定。本试验探索利用紫外分光光度法直接测定植物过 氧化氢酶活性，具有简便、快速和不需要特殊试剂和仪器的 特点， 对植物过氧化氢酶的研究具有重要实践意义和运用 价值。 1 材料与方法 1.1 材料
（College of Resources and Environmental Science，Hubei University，Wuhan Hubei 430062） Abstract A new measuring method by ultraviolet spectrophotometry was conducted in order to analyze the activity of catalase in plants.The results showed this method was suitable for analyzing samples in batches as its simple convenient operation ，high reproducibility，little errors, no special and expensive reagents，equipments.The usage of sulfuric acid to prevent and stop the reaction not only simplified the operation ，but also reduced the source of errors.With a very significant linear correlation between the ultraviolet spectrophotometry and potassium permanganate titration ，it proved that ultraviolet spectrophotometry was a valuable method and worth popularizing in determination of catalase activity in plants. Key words catalase；ultraviolet spectrophotometry；plant； sulfuric acid；potassium permanganate titration
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
的余多
�
e2
) HO+3+eF(R==2O2H+)2+eF(R
� �
e2
�氧子分和水为解分氢化氧过化催能它�铁有含�酶白蛋红血于属�TAC�酶氢化氧过
。剂原还是又剂化氧是既则氢化氧过�用作的子电递传起中程过此在 】理原【
�
。性活的酶氢化氧过出测可即度速化变的率光吸量测据根。低降而间时应反随
法收吸外紫——定测性活的酶氢化氧过、三
。定标新重过经要前用临液溶 2O2H 及液溶 4OnMK 用所 】意注【 。2O2H gm7.1 于当相 4OnMK 的 L/lom1.0 lm1—7.1 � �g�重鲜品样—W
;�lm�量液酶用所应反—1V �数升毫定滴 4OnMK 后应反酶—B
�算计果结.3 待�lm5 酸硫 lom2 入加中淀沉的后涤洗向)3(。素色物植除去到直�次 5�3 涤洗复反酮丙用 。色比并容定法方的样同线曲准标与�后解溶全完
表按�lm1 液取提品样取吸管液移用)2(。液取提品样为即液清上�渣残去弃�nim01 心离下 提与料材按� �定而少多量含 2O2H 视�g5~2 织组物植鲜新取称)1(�定测和取提品样.2
物植�此因。一之统系御防促酶的要重内体物植是�2O2H 除清以可酶氢化氧过。体解和老 接直以可 2O2H。积累生发 2O2H 使而强加谢代氧性活内体于由�时老衰或下境逆在物植 衰的胞细速加而从�害损受遭膜胞细使并�子分大物生等质白蛋�酸核内胞细化氧地接间或
定测性活酶氢化氧过及量含氢化氧过中织组物植 04 验实
� �lm�积体液酶粗用定测—1V � �lm�积体总液取提酶粗—tV �值光吸管品样—2SA ,1SA
�值光吸管照对的液酶死煮入加—0SA
WF � t � 1 V � 1. 0 =)nim/WFg/u(性活酶氢化氧过
T V � 042 A
)2 S A � 1S A (
2
�0SA = 042A �
中式
�管心离洗冲次多量少水馏蒸用并�中瓶量容 lm01 入转心小其将�后解溶全完淀沉待
0.5 淀沉留�夜清上去弃�nim01 心离 nim/r0003 2.0 1.0 2.0 8.0 6 2.0 1.0 4.0 6.0 5 2.0 6.0 4.0 4 1.0 2 .0 1 .0 8 .0 2 .0 3 0.5 0.5 0.5
7.1 � T V � ) B � A ( t � 1 V � WF
� �lm�量总液酶—TV
�数升毫定滴 4OnMK 照对—A
=)nim·WFg/2O2Hgm(活酶
中式
�示表数克毫的 2O2H 解分内 nim1 品样重鲜克每用性活酶
?关有程过化生些哪与酶氢化氧过.2 ?些哪有素因的定测性活酶氢化氧过响影.1 】题考思【 。扰干有验实本对质物的收吸强有下 mn042 在凡 】项事意注【 。 �nim�间时数读次一后最到氢化氧过加—t � �u�位单活酶个 1 为 1.0 降下每 042A—1.0 � �g�重鲜品样—WF
2.0 1.0 0.1 7 0
2.0 1.0 9.0 1.0 2
2.0 1.0 0.1 1 0
水氨浓 酮丙冷预下℃4 L/lom μ001 钛酸硫%5
2O2H
号 管 心 离
�lm�剂试
表置配线曲准标度浓 2O2H 定测
1-04 表
。剂试入加 1-04 表按并�号编序顺�支 7 管心离 lm01 取�线曲准标作制.1 】法方【 �倍 001 释稀再�lm001 于溶�l μ75 2O2H 纯析分%03 取�剂试酮丙 2O2H L/lom μ001 】剂试【 心离�支 8×lm5 管心离�个 7×lm01 瓶量容�支 1×lm5�支 2×lm2.0 管液移�钵研 。计度光光分�机 。水氨浓�酮丙�钛酸硫�V/W�%5�酸硫 L/lom2
�后完定测部全管支 3 待 �nim4 测共 �次 1 数读 nim1 隔每 �度光吸定测下 mn042 �中杯色比 英石入倒速迅并�时记即立管一完加每�2O2H 的 L/lom1.0 lm3.0 入加管逐,后热预℃52
0.1 5.1 2.0 3S 0 .1 5 .1 2 .0 2S 0.1 0.0 1S 2-04 表 5.1 )lm(酸磷 8.7Hp )lm(液酶粗 号 管 )lm(水馏蒸
。点终为 �失消不内 nim03 在� 色红粉现出至 �2O2H 定滴液溶准标 4�nMK L/lom1.0 用.3
�算计果结.4
入加中瓶照对�lm5.2 液酶入加中瓶定测� �照对个两定测个两�个 4 瓶角三 lm05 取.2
�nim01 温保中浴水温恒℃03 于�时计时同�2O2H L/lom1.0 lm5.2 入加再�lm5.2 液酶死煮 。液提粗的酶氢化氧过为即液清上�nim51 心离 mpr0004 取提液酶.1 】法方【 。L1 至容定�后解溶水馏蒸用�g706.21 O2H2· 4O2C2H 纯级优取称�酸草 L/lom1.0 �定标行进�下件条性酸在�液溶 4OnMK /lom1.0 准标用�lm0001 �定标液溶酸草 L/lom1.0 用�lm0001
部上取�nim01 置静中箱冰℃5 置瓶量将匀均合混。度刻保下℃5。液提粗酶氢化氧过为即液清上�nim51 心离下 mpr0004 在液清澄
�浴水温恒�支 3 管试 lm01�支 1 管吸 】具用与器仪【
)042A(度光吸液溶应反使 �氢化氧过解分能酶氢化氧过 �收吸烈强有下长波 mn042 在 2O2H 】理原【
法定滴钾酸锰高——定测性活的酶氢化氧过、二
� �lm�积体液取提品样用时定测—1V � �lm�积体总液取提品样—tV � �lom μ�度浓 2O2H 中品样得查上线曲准标—C
1
。 �g�重鲜织组物植—WF
V � W F =)wF g/lom μ(量含 2O2H 中织组物植 tV � C
中式
。 �u�位单活酶个 1 为量酶的 1.0 少减 042A 内 nim1 以 �算计果结.3 。性活酶算计式下按
】具用和器仪【
4OSnM2+O2H8+4OSHK2+2O5 4OS2H4+4OnMK2+2O2H5
。量的 2O2H 的耗消出求可即
2O2H
定滴�下件条性酸在�液溶钾酸锰高准标用�后应反促酶经�液溶 2O2H 的�量过应反�量 �此据 定一入加中统系应反在 。小大力活酶该定测量成生的 2O 或量耗消的 2O2H 据根可
表置配液品样 2O2H 定测法收吸外紫
加序顺 2-04 表按�管白空为支 1�管定测品样为支 2 中其�支 3 管试 lm01 取�定测.2
。剂试入
洗冲液冲缓用并�中瓶量容 lm52 入转�后浆匀成磨研砂英石量少和液冲缓酸磷 0.7Hp 的冷 预下℃4 lm3�2 入加�中钵研置 g5.0 织组物植它其或片叶麦小鲜新取称�取提液酶.1 】法方【 � �酮烷咯吡烯乙聚%1 含内�液冲缓酸磷 8.7Hp L/lom2.0 】剂试【 度刻 lm2�支 2 管吸度刻 lm5.0�个 1 瓶量容 lm052�钵研�机心离�计度光光分外紫 。 �定标钾酸锰高 L/lom1.0 用�2O2H L/lom1.0
。lm5.2 4OS2H %01 入加即立
至移转�浆匀成磨研�量少液溶冲缓酸磷的 8.7Hp 入加 g5.2 片叶麦小取
�容定液冲缓一同用�中瓶量容入转液洗冲将并�钵研洗冲液冲缓该用�中瓶量容 lm52
至释稀�lm86.5 液溶 2O2H %03 取�L/lom6.71 于等约大 2O2H %03 售市�2O2H L/lom1.0 成制配水馏蒸却冷沸煮新用�g5061.3�RA�4OnMK 取称�液准标钾酸锰高 L/lom1.0 �8.7Hp 液冲缓酸磷 L/lom2.0�4OS2H %01 】剂试【 。1×lm52 瓶量容�浴水温恒� �lm01�管定滴式酸�4×lm05 瓶角三�钵研
】具用和器仪【 �后解溶 4OS�H 被可�淀沉色黄物合复钛—物化氧过成生�钛化氯或�钛酸硫与 2O2H 】理原【 。系关性线呈度浓 2O2H 与浅深色颜其�内围范定一在。定测色比下长波 mn514 在
定测的量含氢化氧过、一
过定测法度光光分用验实本。关相切密性逆抗的物植与性活酶氢化氧过和量含 2O2H 中织组 。性活酶氢化氧过定测法收吸外紫和法定滴钾酸锰高用利�量含氢化氧
淀沉。液清上去弃�nim01 心离 nim/mpr0003 后成形淀沉待�水氨浓和钛酸硫%5 入加 1-53 nim/r 0003 管心离入转 �后浆匀成磨研砂英石许少和酮丙的冷预下℃4 入加例比的 1∶1 剂取 。色比下长波 mn514�度刻 lm01 至容定后并合液涤洗将
0 .5 0.5 0.5 酸硫 lom2