显微操作技术 荧光显微镜技术的特点和应用

2.细胞壁研究
荧光显微技术在植物细胞学中应用的一个突出 方面,是用于鉴定细胞壁成分,研究壁形成和再生, 以及壁在植物发育过程中和环境影响下性质的变化 观察细胞壁的方法很多,如用专一的染料染色 或利用纤维素的偏振光性质等。现在国外常用的方 法是荧光增白剂染色,在4QOnm左右的激发光照射下 观察细胞壁(纤维素)所产生的绿色荧光来判断细胞 壁的有无
2.温度的影响
温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度下降 时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的碰撞也随 之减少，去活化过程也减少，则荧光强度增加。相 反，随着温度上升，荧光物质与分子的碰撞频率增 加，使去活化几率增加，则荧光强度下降。
3.荧光强度与溶液浓度的关系
在稀溶液中： F＝Kc F 为荧光强度 K-检 测效率（由仪器决定） c 为液体的浓度高浓度时， 荧光物质发生熄灭和自吸收现象，使F与c不呈线 性关系
1.DNA研究
• 用细胞荧光测定技术测量DNA,是荧光显微技术和 细胞光度技术相结合的产物,标志着前者由定性向 定量测定发展.
吖啶橙
• 3，6－（二甲胺基）吖啶盐酸盐，分子式 C17H19N3 ·HCl ·ZnCl₂, 分子量438.12g/mol,是 一种荧光色素，其检测激发滤光片波长488nm,阻 断滤光片波长515nm。
• 活体染色 vital staining 将无毒或毒性较小 的某种染料注入动物体内,可被机体内某些 组织或细胞所摄取,称为活体...
影响荧光的因素 1. pH的影响 带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化合物 的荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在pH=7-12 的溶液中苯胺以分子形式存在，会发出蓝色荧光； 而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以离子形式存在， 都不会发出荧光。 同时所用酸的种类也影响荧光的强度，例如： 奎宁在硫酸溶液中的荧光比在盐酸中的要强。
可见含DNA的细胞核显示黄绿色荧光，含RNA的细胞质显示橘红色荧光
DAPI
• DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6diamidino-2-phenylindole)，是一种能够与DNA 强力结合的荧光染料，最大吸收波长为358nm，最 大发射波长为461nm。
DAPI
染色原理：
DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细 胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产 生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链 DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到 显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效 率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。
• 它与细胞中DNA和RNA结合量存在差别，可发出不 同颜色的荧光，与DNA结合量少发绿色荧光，与 RNA结合量多发桔黄色或桔红色荧光。该染料具有 膜通透性，能透过细胞膜，使核DNA和RNA染色。 因此，在荧光显微镜下观察，吖啶橙可透过正常 细胞膜，使细胞核呈绿色或黄绿色均匀荧光。
体外培养的肝癌细胞吖啶橙荧光染色
2.诱发荧光
材料中的某些物质经一定的化学处理后，可 转化为荧光色团，由此被诱发产生荧光。最常见 的是甲醛诱发蛋白质中所含的芳香乙胺基团转化 为荧光色团。戊二醛也能诱发荧光
• 3荧光染料染色：
应用含荧光色团的物质作为染料，使与生物 组织中和该物质有特殊亲和力的成分相结合，即 可被激发荧光。这类染料称为荧光染料或荧色素。 许多常规染色剂(如刚果红、曙红、碱性品红、水 溶性苯胺蓝等)兼有荧光染料的性能
荧光显微镜技术的特点和应用
荧光显微镜的种类
• 透射式 ●落射式
• 和传统显微技术相比,荧光显微技术具有以下优点:
(1)荧光显微镜所用光源的波长比传统显微镜光源的 波长短1/2,因此荧光显微镜的分辨能力超出了传 统显微镜的分辨率的极限 (2)荧光显微镜技术具Biblioteka Baidu高度灵敏性和专一性.它所 用染料的量是极其微小的,只相当于传统显微技术 中染料消耗量的几千分之一.
• (3)荧光显微镜能够直接显示细胞内的生物化学成 分,并且显示的彩色效果很明亮,极易观察,极易进 行定量分析,而且能以极低浓度的染料检测出含量 极微的物质.
• (4) 随着新的荧光染料的发明,可不断扩大被测物 质的范围.
• 生物学材料，有各种产生荧光: 1.自发荧光:或原发荧光 细胞组织中自然存在的某些物质可被激发产 生荧光
4猝灭剂
何为猝灭? 由于某些原因使发光材料发生非辐射跃迁，从 而降低了发光效率的现象叫做猝灭 在荧光物质溶液中,加入某种化合物,使溶液的 荧光强度显著降低,这种化合物称为猝灭剂
• 猝灭作用可能是由于一部分荧光物质分子M与猝灭 剂Q作用而生成了配合物MQ,如配合物MQ的形成是 由于微弱的范德华引力的作用,则所形成的配合物 并不发生荧光.在这种情况下,荧光物质分子M和配 合物MQ相对都吸收光,但配合物吸收光后不发生荧 光,而将所吸收的光降解为热,唯有荧光物质M在吸 收光之后发生荧光,因此猝灭剂的加入将使荧光强 度大大降低.
荧光增白剂染色
• 荧光增白剂和细胞壁成分有强烈亲和力,当前常用 的荧光增白剂有ST,M2R,VBL.ST开始被用于显示细 菌,放线菌与真菌的细胞壁,在粘菌材料中,它被证 明与纤维素和几丁质有亲和力
• 胼胝质是一种以β-1,3键结合的葡聚糖。在植物 的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重 要的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常 的生长代谢过程。
吖啶橙
• 染色原理:吖啶橙可对细胞中的DNA和RNA同时染
色而显示不同颜色的荧光。其激发峰为492nm，荧 光发射峰为530nm（DNA）、640（RNA），它与双 链DNA的结合方式是嵌入双链之间，而与单链DNA 和RNA则由静电吸引堆积在其磷酸根上。在蓝光 （502nm）激发下，细胞核发亮绿色荧光（约 530nm），胞质RNA发橘红色荧光（>580nm）。
• 胼胝质是一种以β-1,3键结合的葡聚糖。在植物 的筛管代谢、配子体发育等生命活动中发挥着重 要的调节作用，其合成、分解直接关系植物正常 的生长代谢过程。
3细胞生活力测定
• 荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以 及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料，其染色机理也利 用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光，也 无极性，能自由渗透出入完整的细胞膜。当FDA进入活细 胞后，被细胞内的脂酶分解，生成有极性的、能产生荧光 的物质——荧光素，该物质不能自由透过活的细胞膜，积 累在细胞膜内，因而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无 活力的细胞因不能使FDA分解，而无法产生荧光