肝素钠(15版中国药典公示稿)

肝素钠GansunaHeparin Sodium■本品系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质，是由不同分子量的糖链组成的混合物，由α-D-氨基葡萄糖（N-硫酸化，O-硫酸化，或N-乙酰化）和O-硫酸化糖醛酸（α-L-艾杜糖醛酸或β-D葡萄糖醛酸）交替连接形成聚合物，具有延长血凝时间的作用。

按干燥品计算，每1mg中抗Ⅱa因子效价不得少于180 IU，抗Xa因子效价与抗IIa因子效价比为0.9～1.1。

■[修订]■核酸取本品，加水溶解并稀释制成每1ml中含4mg的溶液，照紫外-可见分光光度法（附录ⅣA）测定，在260nm的波长处，吸光度不得大于0.10。

■[增订]■蛋白质取本品适量，精密称定，加水溶解并稀释制成每1ml中约含30mg的溶液，作为供试品溶液；另取牛血清白蛋白对照品适量，分别加水制成每1ml中各含0、10μg、20μg、30μg、40μg与50μg的溶液，作为对照品溶液，照蛋白质含量测定法（附录ⅦM 第二法）测定。

按干燥品计，含蛋白质不得过0.5%。

■[增订]■有关物质取本品适量，精密称定，加水溶解并定量稀释制成每1ml中约含100mg的溶液，涡旋混合至完全溶解，取0.5ml，加入1 mol/L盐酸溶液0.25ml和25%亚硝酸钠溶液0.05ml，振摇混匀，反应40分钟，加入1mol/L氢氧化钠溶液0.2ml终止反应，作为供试品溶液；取肝素对照品250mg，加水2ml，涡旋混匀至完全溶解，作为对照品溶液（1）；取对照品溶液（1）1.2ml，加2%硫酸皮肤素对照品0.15ml与2%多硫酸软骨素对照品0.15ml，作为对照品溶液（2）；取对照品溶液（2）0.1ml，加水稀释至1ml，作为对照品溶液（3）；取对照品溶液（1）0.4ml，加水0.1ml，混匀，加1 mol/L盐酸溶液0.25ml和25%亚硝酸钠溶液0.05ml，振摇混匀，反应40分钟，加1mol/L氢氧化钠溶液0.2ml终止反应，作为对照品溶液（4）；取对照品溶液（2）0.5ml，加1 mol/L盐酸溶液0.25ml和25%亚硝酸钠溶液0.05ml，振摇混匀，反应40分钟，加1mol/L氢氧化钠溶液0.2ml终止反应，作为对照品溶液（5）。

照高效液相色谱法（附录V D）测定，以烷醇季铵为功能基的乙基乙烯基苯-二乙烯基苯聚合物树脂为填充剂（如AS11-HC阴离子交换柱，2mm×250mm,与AG11-HC保护柱，2mm，用]μg均应符合规定。

干燥失重取本品，置五氧化二磷干燥器内，在60℃减压干燥至恒重，减失重量不得过5.0%（附录ⅧL）。

炽灼残渣取本品0.50g，依法检查（附录ⅧN），遗留残渣应为28.0%～41.0%。

钠精密称取本品约50mg，置100ml量瓶中，加0.1ml/L盐酸溶液（每1ml中含氯化铯1.27mg）溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

精密量取钠单元素标准溶液（每1ml中含Na+200μg），用上述盐酸溶液分别定量稀释制成每1ml中含Na+25μg，50μg，75μg 的对照品溶液。

取对照品溶液与供试品溶液，照原子吸收分光光度法（附录IV D第一法），在330.0nm的波长处测定。

按干燥品计算，含钠应为■10.5%~13.5%。

■[修订]重金属取炽灼残渣项下遗留的残渣，依法检查（附录ⅧH第二法），含重金属不得过百万分之三十。

■分子量与分子量分布取本品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含5mg的供试品溶液；取肝素分子量对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含5mg的对照品溶液；取肝素分子量系统适用性对照品适量，加流动相溶解并稀释制成每1ml中约含5mg 的系统适用性溶液。

照分子排阻色谱法（附录V H）测定，以亲水性键合硅胶为填充剂（如TSK预柱，6mm×40mm，TSK 4000 SW xl，7.8mm×300mm，TSK 3000 SW xl，7.8mm×300mm，串联使用）；以0.1 mol/L醋酸铵溶液为流动相；流速为每分钟0.6ml；柱温为35℃；示差折光检测器。

取肝素分子量对照品溶液25μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。

准确计算对照品溶液色谱图中肝素峰的总面积（不包括盐峰）及每个点的累积峰面积百分比，确定与肝素分子量对照品附带的宽分布标样表中累积峰面积百分比最接近点的保留时间及对应的分子量，以保留时间为横坐标，分子量的对数值为纵坐标，使用GPC软件，拟合三次方程，建立校正曲线，相关系数应不小于0.990。

量取系统适用性溶液和供试品溶液各25μl，分别注入液相色谱仪，记录示差色谱图（主峰和溶剂峰应能彻底洗脱），按下式计算重均分子量：Mw=∑(RI i M i)/ ∑RI i式中RI i为洗脱的i级分的物质量，即示差色谱图的峰高；M i为由校正曲线计算得出的i级分的分子量。

肝素分子量系统适用性对照品的重均分子量应在标示值±500范围内。

本品重均分子量应为15000～19000，分子量大于24000的级分不得大于20%，分子量8000～16000的级分与分子量16000～24000的级分比应不小于1.0。

■[增订]细菌内毒素取本品，依法检查（附录ⅪE），每1单位肝素中含内毒素的量应小于0.01 EU。

【效价测定】■取本品，照抗IIa因子效价测定法（附件二）测定，抗IIa因子效价应为标示值的90%～110%。

■[修订]【类别】抗凝血药。

【贮藏】密封，在干燥处保存。

【制剂】（1）肝素钠注射液（2）肝素钠乳膏抗Ⅹa因子效价测定法本法系体外通过抗凝血酶（A TIII）与肝素或低分子肝素标准品比较以测定供试品加速抑制Xa因子（FXa）的活性。

一、溶液配制三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）取三羟甲基氨基甲烷6.06 g，氯化钠10.23g，乙二胺四醋酸二钠2.8g，聚乙二醇6000 1.0g，加水800 ml使溶解，用盐酸调节pH值至8.4，加水稀释至1000 ml。

标准品及供试品溶液的配制与稀释取标准品（S）和供试品（T）各适量，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）分别稀释制成4个不同浓度的稀释液，该浓度应在log剂量-反应的线性范围内，一般为每1 ml中含0.01 IU～0.1 IU。

抗凝血酶（A TIII）溶液取抗凝血酶（ATIII），加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）制成每1ml中含抗凝血酶1 IU的溶液。

Xa因子（FXa）溶液取Xa因子（？），加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）溶解并稀释制成每1ml中约含0.4IU（7.1nkat）的溶液，调整浓度，使其在以三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）代替肝素或低分子肝素作为空白溶液（B1、B2）的抗Xa因子实验中，在405nm波长处的吸光度值在0.8～1.0。

发色底物溶液取发色底物S-2765（或其他FXa特异性发色底物），加水制成0.003 mol/L的溶液，临用前用水稀释至1mmol/L。

二、测定法取标准品溶液及供试品溶液，按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次向小管中分别加入相同体积V（20μl-50μl）的空白（B）溶液、供试品（T）稀释液或标准品（S）稀释液，再加入相同体积V（20µl-50μl）的抗凝血酶溶液，混匀，37℃平衡2分钟，每管加Xa因子溶液2V（40µl-100μl），混匀，37℃平衡2分钟，加发色底物溶液2V（40µl-100μl），混匀，37℃准确保温2分钟后，各加50％醋酸溶液2V（40µl-100μl）终止反应。

用适宜设备在405nm的波长处测定各孔吸光度。

B1、B2两孔的吸光度不得有显著性差异。

以吸光度为纵坐标，标准品溶液（或供试品溶液）浓度的对数值为横坐标分别作线性回归，按生物检定统计法（附录XIV）中的量反应平行线原理4×4法实验设计，计算效价及实验误差。

平均可信限率（FL%）不得大于10％，抗Ⅹa 因子效价应符合规定。

抗IIa因子效价测定法本法系体外通过抗凝血酶（ATIII）与肝素或低分子肝素标准品比较以测定供试品加速抑制IIa因子（FIIa）的活性。

一、溶液配制三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）取三羟甲基氨基甲烷6.06 g，氯化钠10.23 g，乙二胺四醋酸二钠2.8g，聚乙二醇6000 1.0g，加水800 ml使溶解，用盐酸调节pH值至8.4，加水稀释至1000 ml。

标准品及供试品溶液的配制与稀释取标准品（S）和供试品（T）各适量，加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）分别稀释制成4个不同浓度的稀释液，该浓度应在log剂量-反应的线性范围内，一般为每1ml中含0.005IU～0.05IU。

抗凝血酶（ATIII）溶液取抗凝血酶（A TIII），加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）制成每1ml中含抗凝血酶0.25IU的溶液。

凝血酶（FIIa）溶液取凝血酶（FIIa），加三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）溶解并稀释成每1ml中约含5 IU的溶液，调整浓度，使其在以三羟甲基氨基甲烷-聚乙二醇6000缓冲液（pH8.4）溶液代替肝素或低分子肝素作为空白溶液（B1、B2）的抗IIa因子实验中，在405nm波长处的吸光度值在0.8～1.0。

发色底物溶液取发色底物S-2238（或其他FIIa特异性发色底物），加水制成0.003mol/L的溶液，临用前用水稀释至0.625mmol/L。

二、测定法取标准品溶液及供试品溶液，按B1、S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4、B2的顺序依次向小管中分别加入相同体积V（20μl-50μl）的空白（B）溶液、供试品（T）稀释液或标准品（S）稀释液，再加入相同体积的抗凝血酶溶液V（20µl-50μl），混匀，37℃平衡2分钟。

每管加凝血酶（FIIa）溶液2V（40µl-100μl），混匀，37℃平衡2分钟，加发色底物溶液2V（40µl-100μl），混匀，37℃准确保温2分钟后，各加50％醋酸溶液2V（40µl-100μl）终止反应。

用适宜设备在405 nm的波长处测定各孔吸光度。

B1、B2两孔的吸光度不得有显著性差异。

以吸光度为纵坐标，标准品溶液（或供试品溶液）浓度的对数值为横坐标分别作线性回归，按生物检定统计法（附录XIV）中的量反应平行线原理4×4法实验设计，计算效价及实验误差。