[课件]PCR仪和凝胶成像系统PPT

体内DNA的复制体系
5’
3’
模板 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB DNA聚合酶（I II III） 引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 模板
DNA聚合酶 Mg2+
dNTP
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
பைடு நூலகம் Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 2.0μL 1.0 μL 1.0 μL
10μmol/L引物2
质粒DNA Taq 水补充至
1.0μL
1.0 μL 0.1 μL(5U) 25.0 μL
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2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 25-35 个循环 ⑶45-65℃ 30’’-1’ ⑷72℃ n’ ⑹72℃ ⑺4-10℃ 3-7’ 保存 ⑵94℃ 30’’ 预变性（使模板充分变性） 变性 复性（使引物与模板充分退火） 延伸 (按1’扩增1kb计算） 总的延伸（使产物延伸完整）
1988年Saiki 等从温 泉（ Hot spring）中 分离的一株水生嗜热 杆菌(thermus aquaticus) 中提取到
一种耐热DNA聚合酶
。
thermus aquaticus
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Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100 耐高温
此酶的发现, 被PCR广泛应用 。在 1989 年，Science 将 PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分 子 (Molecule of the year)
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荧光定量PCR(FQ-PCR)
融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和 荧光淬灭基团)
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多重PCR (multiplex PCR)
多重PCR技术的难点在于其多对引物的设计，必需保 证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板 区域具有高度特异性
Taq
P1 Mg2+ dCTP
反应条件
dATP dGTP
P2
dTTP
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PCR反应条件
温度、时间和循环次数。
温度三点法
94℃
变性
55℃
退火
72℃
延伸
PCR循环
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PCR反应条件
(1)变性
(2)
使双链DNA解链为单链
94℃， 20-30秒
PCR仪
(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 ; 降低温度可增加反应的灵敏性。 一般为45～65℃, 30秒
PCR三步曲
变性 退火 90～97℃ 45～65℃ 延伸 70～75 ℃
PCR过程
一生二，二生四，四生万物
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梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
用 途 广 泛
生命学科 肿瘤 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学
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PCR示例
一、实验目的 学习PCR分析的原理与技术。
它最大的特点就是能不断推出新形式。
—— 摘自[Making PCR: A Story of
Paul Rabinow]
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Biotechnology by
以PCR为基础的相关技术

逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)


实时荧光定量PCR (quantitative PCR )
PCR仪和凝 胶成像系统
内 容
PCR的反应原理及反应体系
PCR示例 凝胶成像系统
多聚酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出
的一种在体外简化条件下模拟DNA体
内复制的DNA快速扩增的方法，此技
术获得1993年诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis
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（3）延伸
70-75℃,一般为72℃
延伸时间由扩增片段长度决定，1分钟扩增1Kbp
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
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PCR的基本原理
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PCR的基本原理小结
变性、复性、半保留复制
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70
(%)
80 90
100
温度(℃)
反应体系中：浓度0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。
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PCR反应体系
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 辅助因子：Mg2+
英国Techne多功能型 PCR仪TC-412
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3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比
例混匀,上样电泳。
琼脂糖凝胶电泳
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PCR?
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
——凯利· 穆利斯（Kary Mullis)
PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可 操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为 新的概念。 …
二、实验材料、仪器和试剂 1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体 Pmd18-T 质粒DNA 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及 PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂： 10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 泸州医学院药理毒理研究室 10mmol/L dNTP
三、操作步骤
1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试 剂 并混匀：
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原位PCR(In situ PCR)
原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR ，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团 直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为 直接法和间接法。 基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原 位PCR扩增→冲洗→产物检测 优点：灵敏度高，可进行细胞内定位
多重PCR (multiplex PCR)


免疫PCR
差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR)


PCR诱导定点突变
原位PCR (in situ PCR)
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逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)