[课件]PCR仪和凝胶成像系统PPT
合集下载
实验PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳课件高二下学期生物人教版选择性必修3
凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下 被检测出来。
DNA分子电泳
琼脂糖凝 胶电泳
二、材料用具
（一）仪器：
PCR仪
自动控温， 实现DNA 的扩增
微量离心管
实际上是进 行PCR反应 的场所
微量移液器
用于向微量离 心管转移PCR 配方中的液体
电泳装置
包括电泳仪、 电泳槽等
二、材料用具
PCR 的产物一般通 过琼脂糖凝胶电泳
来鉴定。
PCR仪
一、实验原理 （二）DNA片段电泳鉴定原理：
电泳鉴 定原理
DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带 上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它 所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。
在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小 和构象等有关。
离心
待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子，将微量离 心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离 心管的底部（提高反应速率）
扩增
参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有 反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。
循环程序 变性
复性
延伸
预变性 94℃,5min
/
/
30次 94℃,30s 55℃,30s 72℃,1min
电泳
接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为 1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳
观察记录
取出凝胶置于紫外灯下观察和照相
注意事项
探究.实验 DNA片段的扩增及电泳鉴定
为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头 和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。
PCR仪 凝胶成像仪使用说明
ABI Veriti 梯度PCR仪使用说明(简版)操作步骤：1、打开PCR仪的热盖，放入0.2ml的样品管（热盖平稳），盖好热盖。
2、打开PCR仪的电源，仪器程序开始初始化，需等待几分钟（此步可提前）。
3、初始化完成后，显示主菜单。
4、点“Browse/New Methods”，进入PCR程序列表：5、可以直接点一个PCR程序，选择“Start Run”运行；点右边的“文件夹”符号，可以选择不同的文件夹。
如要新建一个PCR程序，点“New”，出现PCR程序。
6、添加一段程序：点上方的“Stage”，该位置变红；再点“Add”，软件将加入一段新的程序。
7、修改循环数、温度、时间：点中循环次数、温度或时间位置，下方出现数字键。
依次点数字键，出现合适数字后，点“Done”确定。
8、增加一个步骤：点“Step”位置，该位置变红；再点“Add”，软件将加入一个新的步骤。
9、删除一个步骤：点“Step”位置，在点“Delete”，软件将该步骤删除。
8、建立梯度模式：点中一个步骤，再点“Option”键，出现选项。
点“VeriFlex step”，出现梯度创建窗口：输入6个梯度温度，温度下方的“1－2”是指对应的1、2两行加热孔，全部输好后，点“Done”确定。
注意：相邻的两个梯度温度之差最大不能超过5℃！11、建立渐变模式(如需要请参考使用说明详版)。
12、增加暂停步骤(如需要请参考使用说明详版)。
13、编辑PCR程序完成后，点“Save”保存。
14、回到PCR程序列表界面，选择新建的PCR程序。
15、点“Start Run”，设置参数（反应体积和热盖温度），点“Start Run Now”运行PCR程序。
16、仪器运行选中的PCR程序，显示运行监视窗口。
17、暂停运行：点“Pause Run”，仪器暂停，出现暂停选项栏。
18、终止运行：点“Stop”可以终止整个PCR程序。
19、反应报告：PCR程序结束后，仪器会自动生成反应报告，显示当次反应的各项指数。
PCR详细讲解 ppt课件
2
PCR的基本原理
① DNA半保留复制的机理；
② 体外DNA分子于不同温度下可变 性和复性的性质。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
3
PCR扩增体系
➢模板（Template）：基因组、质粒DNA、cDNA，也可
以是细菌、组织样品等。
➢引物（Primer）：确定扩增目的序列的特异性；确定
1、避免重复碱基，尤其是G。
2、引物退火温度在58-60℃之间。
3、G+C为30-80%。
4、3’端最后5个碱基内不能有多于2个
的G或C。
5、引物的产物大小一般在80-250bp之
间；80-150 bp最为合适（可以延长至
300 bp）。 2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
38
Real-Time PCR引物设计原则
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
35
引物设计的基本原则
9、引物的3’端不可以A结尾。
引物3’端错配时，不同碱基引发效率存 在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即 使在错配的情况下，也能有引发链的合成， 而当末位链为T时，错配的引发效率大大降 低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所 以3’端最好选择T。
引物设计的最重要的原则：最大限度 地提高扩增效率和特异性；同时尽可 能减少非特异性扩增。
2021/3/26
PCR详细讲解 ppt课件
26
引物设计的基本原则
1、引物应具有足够的特异性。
如果需要从基因组等较复杂的模板中扩 增特定的DNA序列，则需要考虑目的DNA序列 的保守性，尽量避免所选引物设计区域序列 的非特异性。
30
引物设计的基本原则
PCR核酸扩增仪2解析课件
8
9
30次循环后靶序列扩增的数量 ---（10亿）
10
二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式
❖ 在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一 个循环，因此，设计PCR基因扩增仪就要能精确控 制温度，这对PCR反应十分关键。
❖ Taq DNA聚合酶的应用大大提高了PCR的效率，无 需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚 合酶酶促反应最适温度为70～75℃。
PCR仪温度控制，有：
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气加热控温 12
水浴锅控温
❖ 以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。 ❖ 样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均
一性好，无边缘效应。 ❖ 体积大，自动化程度不高，需人为干预，更
换水浴锅时控温不稳定。
13
压缩机控温
❖ 由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便， 一台机器便可完成整个PCR流程。但 压缩机故障率 高，边缘效应及温度overshooting现象严重。
❖ overshooting：升温过程中，由于一些加热元件， 比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探 头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量仍 然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温 度的现象。
14
半导体控温
❖ 由半导体自动控温，金属导热，控温方便， 体积小，相对稳定性好。
❖ 缺点：仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺， 各孔扩增效率可能不一致，也存在温度 overshooting现象。
1
第一节 PCR基因扩增仪工作原理
一、PCR技术的历史发展及原理 ❖ 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一
种体外DNA扩增技术。在它发明以前，对于检测对象浓 度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述 了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。它推动了现代医学由细胞水 平向分子水平、基因水平发展，是DNA测序的基础，它 成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。
9
30次循环后靶序列扩增的数量 ---（10亿）
10
二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式
❖ 在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一 个循环，因此，设计PCR基因扩增仪就要能精确控 制温度，这对PCR反应十分关键。
❖ Taq DNA聚合酶的应用大大提高了PCR的效率，无 需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚 合酶酶促反应最适温度为70～75℃。
PCR仪温度控制，有：
水浴锅控温
压缩机控温
半导体控温
离心式空气加热控温 12
水浴锅控温
❖ 以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。 ❖ 样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均
一性好，无边缘效应。 ❖ 体积大，自动化程度不高，需人为干预，更
换水浴锅时控温不稳定。
13
压缩机控温
❖ 由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便， 一台机器便可完成整个PCR流程。但 压缩机故障率 高，边缘效应及温度overshooting现象严重。
❖ overshooting：升温过程中，由于一些加热元件， 比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探 头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量仍 然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温 度的现象。
14
半导体控温
❖ 由半导体自动控温，金属导热，控温方便， 体积小，相对稳定性好。
❖ 缺点：仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺， 各孔扩增效率可能不一致，也存在温度 overshooting现象。
1
第一节 PCR基因扩增仪工作原理
一、PCR技术的历史发展及原理 ❖ 聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是一
种体外DNA扩增技术。在它发明以前，对于检测对象浓 度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述 了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。它推动了现代医学由细胞水 平向分子水平、基因水平发展，是DNA测序的基础，它 成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。
bio-rad产品培训--PCR仪 PPT课件
医学课件
25
垂直电泳
医学课件
26
蛋白转印槽
Mini Trans-Blot
Trans-Blot SD
Trans-Blot Turbo
医学课件 27
测序电泳
Sequi-Gen GT测序电泳槽
医学课件
28
脉冲场电泳
CHEF Mapper XA
CHEF–DR II
CHEF–DR III
医学课件
29
双向电泳
Maximizer 80： 最大流速：80ml/min 最大压力：1,000psi 254/280nm紫外检测 缓冲液自动配制
Pathfinder 80： 最大流速：80ml/min 最大压力：1,000psi 4波长同步检测 缓冲液自动配制
医学课件
20
Profinia 蛋白质纯化系统
各种 buffer
成像系统---2D成像
GS800
医学课件
17
层析/蛋白纯化--低压系统
医学课件
18
DuoFlow中高压层析系统
医学课件
19
DuoFlow中高压层析系统
DuoFlow 10： 最大流速：10ml/min 最大压力：3,500psi 254/280nm紫外检测 DuoFlow 40： 最大流速：40ml/min 最大压力：1,000psi 254/280nm紫外检测 Maximizer 20 ： 最大流速：20ml/min 最大压力：3,500psi 254/280nm紫外检测 缓冲液自动配制 QuadTec 10： 最大流速：10ml/min 最大压力：3,500psi 4波长同步检测 QuadTec 40： 最大流速：10ml/min 最大压力：3,500psi 4波长同步检测 Pathfinder 20： 最大流速：20ml/min 最大压力：3,500psi 4波长同步检测 缓冲液自动配制
pcr技术ppt课件
在适中温度下进行延伸，完成一个DNA的复制循环。
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
通过连续循环，DNA片段数量呈指数增长。
PCR技术的发明和发展
1985年，Mullis和Cetus公司的 合作者Michael Smith在《科学 》杂志上首次公开描述了PCR方 法。
1987年，Innis、Gelfand、 White等人建立了PCR技术的标 准化方案。
退火
将温度降至50℃左右，引物 与单链DNA结合，形成局部
双链。
延伸
温度上升至72℃，DNA聚合 酶从引物起始合成新的DNA
链。
降温及终止反应
每个循环结束后降低温度以终 止反应，准备进入下一个循环
。
03
PCR技术的操作步骤
准备PCR反应所需的试剂和设备
01
准备PCR仪、离心机、移液器等 设备，确保其正常工作。
按照设定的程序进行PCR扩增，记录 扩增曲线和数据。
分析扩增产物
将PCR产物进行电泳或荧光检测 ，观察扩增结果。
利用凝胶成像系统或荧光检测仪 对产物进行分析，确定产物的大
小和浓度。
根据需要，可以进行克隆、测序 等后续操作，进一步验证PCR产
物的准确性和特异性。
04
PCR技术的优缺点
优点
高灵敏度
PCR技术PPT课件
目录
• PCR技术简介 • PCR技术的基本原理 • PCR技术的操作步骤 • PCR技术的优缺点 • PCR技术的应用实例 • PCR技术的未来展望
01
PCR技术简介
什么是PCR技术
聚合酶链式反应（PCR）是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生 物学技术。
它利用耐高温的DNA聚合酶（通常为Taq酶）在高温下将双链DNA分子 变性解旋为单链，然后通过低温退火使引物与单链DNA分子结合，最后
赛智凝胶成像使用说明2022年精选ppt
送入Excel中的数据， 粗红的数值就是各条带的分子量与光密度值
H:\¸ßÎÄÇ«\20051118-2.tif
Lanes: Rows r1 r2 r3 r4
r5 r6 Sum In Lane
Lane 1 (mol.w.) (IOD)
2000 93186 1000 114000
750 213000 500 106000
各泳道宽度也可不一致。 设置完成后点确定关闭泳道窗口。
泳道 设置窗口
可以用鼠标拖边界， 也可以移动泳道位置
泳道上的光密度分布曲线 当前泳道的图像
Lane profile
可以选多个marke这r条带是。 显示泳道上光密度分布曲线的窗口。
这两个原则经常不能同时满足，只能根据情况满足其中一条。
曲线下方显示了当前选中泳道的图像。 一张照片上只能输入一种Marker参数，如果使用了两种Marker,则只能用一个来定标。
当Mark条不在左边时，一定要重新手 动指定Mark条的位置
点reset清除。点select按纽，再点照片上 marker所在的条带。该条带就被定为marker 了。
可以选多个marker条带。 指定了Mark位置后，就要输入各条带的分子
量数据。一张照片上只能输入一种Marker参数， 如果使用了两种Marker,则只能用一个来定标。
将凝胶边上多余的部分裁切掉，既可美化图片画 面，也可减少电脑处理数据时的工作量。
用鼠标拖此箭 头旋转图片
旋转工具 旋转工具窗口
旋转并裁切后的照片
设置泳道
1. 点泳道调出泳道设置工具栏及泳道窗口。 2.删除多选上的泳道，增加未选上的泳道。 3.调整泳道位置 4.调整泳道选择宽度及上下边界。 泳道不规则时可以调整泳道为不规则形状的。
PCR仪器的使用及注意事项-PPT课件
绝对定量&相对定量：
绝对定量的目的是测定目的基因在样本中的分子数目,
即通常所说的拷贝数.相对定量的目的是测定目的基因在两个
或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样 本中的拷贝数. 绝对定量实验必须使用已知拷贝数的绝对标准品,必须 做标准曲线.相对定量可以做标准曲线,也可以不做标准曲线.
10、分析之后的结果，可以利用菜单中的 File>Export 功
能，导出 Excel 格式的结果。或者
布局选中所需孔位右击Copy，粘贴。
视图板
若想存储图片结果，可直接在图片上单击鼠标右键，选择
Save as，存成 JPEG 格式的图片。
基线、阈值线、 Ct值
自动设置基线：
每个样品都设置独立的基线，如果背景信号过高，软 件可能会将背景信号误认为扩增信号，这时，基线的范围会 被设置的很小，因此自动设置基线失败，需要手动设置基线。
2.2 确认仪器型号
2.3 在实验类型中，选择 Quantitation-Standard Curve
2.4 选择试剂种类
2.5 确认运行模式
TaqMan探针法（寡核苷酸探针）：
5′ 端 荧光报告基团 与靶基因特异性结合的序列 3′ 端 淬灭基团
完整的探针：检测不到报告荧光 切断的探针：检测到报告荧光
4. 在 Setup 下的 Run Method 界面中，设定反应条件。
5、点击
文件储存成 Experiment Document Single
Files（ *.eds）格式， 然后在
钮，反应即开始进行。
按下
按
6、实验结束后，点击界面右上角的 Analyze 按钮，软件将
会显示实验结果：
3.2.3实验PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳课件-高二下学期生物人教版选择性必修3
D.两种限制酶在载体上识别的序列可能相同
跟踪训练
根据图示可知，200 bp的DNA分子量小， 800 bp的DNA分子量较大，200 bp的 DNA移动速度快，所以在电泳时，核酸 的移动方向是从负极到正极的，A错误； 当仅用一种限制酶切割载体时，仅产生 一种长度的DNA片段，因此该载体最有 可能为环状DNA分子，B正确；
蒸馏水和移液器等在使用前都必须进行高压灭菌处理 D.电泳时，电泳缓冲液不能没过凝胶，以免凝胶加样孔中的电泳样液流
PCR反应体系中需加入耐高温的DNA聚合酶，该酶主要在延伸过程 中起作用，B错误； 为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪 头、蒸馏水等在使用前都必须进行高压灭菌处理，移液器不需要高 压灭菌，C错误； 电泳时，电泳缓冲液以没过凝胶1 mm为宜，D错误。
跟踪训练
例7. 为优 化目 的 基因(700 bp)的 PCR条件，研究者设计不同的复 性温度进行实验，产物的琼脂糖 凝胶电泳结果如图。据图分析， 下列有关说法错误的是 A.对照组可用无菌蒸馏水代替模板，其他成分相同
√B.电泳条带的宽度、亮度与扩增产物大小呈正相关
C.复性温度的高低会影响PCR扩增产物的纯度 D.58 ℃是本实验中扩增该基因的最佳复性温度
跟踪训练
例6.下列有关电泳的叙述，不正确的是 A.电泳是指带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 B.待测样品中DNA分子的大小和构象、凝胶的浓度等都会影响DNA在电
泳中的迁移速率
√C.进行电泳时，带电分子会向着与其所带电荷相同的电极移动
D.PCR的产物一般通过琼脂糖凝胶电泳来鉴定
由于同性相斥、异性相吸，带电分子会向着与其所带电荷相反的电 极移动，C错误。
例2 用PCR方法检测转基因植株是否成功导入目的基因时，得到以下电 泳图谱，其中1号为DNA标准样液(Marker)，10号为蒸馏水，PCR时加入 的模板DNA如图所示。据此作出的分析，不合理的是
生物技术实验室仪器操作简介PPT课件
第13页/共45页
FR-980生物电泳图像分析系统
第14页/共45页
系统简介：
系统可以通过紫外/可见光分析装置及透光扫描仪直接 获得核酸、蛋白质凝胶电泳图像。系统配置有 SmartView生物电泳图像分析软件，可以进行密度扫 描、密度定量、分子量计算等电泳分析。此外，该系统 含有多种图像滤波器，可降低图像的噪音，从而获得较 清晰的图像。
第26页/共45页
操作程序：
台面清洁消毒 紫外灯灭菌30分钟
进行无菌操作 清理工作台面
紫外消毒30分钟 关闭紫外灯、电源
注意事项：
1）工作台面上，不要存 放不必要的物品，以 保持工作区内的洁净 气流不受干扰。
2）操作时一定注意关掉 紫外，防止对实验人 员造细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的
第34页/共45页
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外 照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EBDNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB 发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与 DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
第35页/共45页
附 注：
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
第21页/共45页
注意事项
1、电泳仪工作时，禁止人体接触电极、电泳物及其它 可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，以免触电， 同时要求仪器有良好接地端，以防漏电。
2、仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头， 以防短路。
3、由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳所通过的 电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同， 故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
备及核酸检测
第31页/共45页
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电 泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界 面电泳不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区 带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支 持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶 性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常 用的是琼脂糖凝胶电泳其优点主要在于操作简单、快 速、灵敏。
FR-980生物电泳图像分析系统
第14页/共45页
系统简介：
系统可以通过紫外/可见光分析装置及透光扫描仪直接 获得核酸、蛋白质凝胶电泳图像。系统配置有 SmartView生物电泳图像分析软件，可以进行密度扫 描、密度定量、分子量计算等电泳分析。此外，该系统 含有多种图像滤波器，可降低图像的噪音，从而获得较 清晰的图像。
第26页/共45页
操作程序：
台面清洁消毒 紫外灯灭菌30分钟
进行无菌操作 清理工作台面
紫外消毒30分钟 关闭紫外灯、电源
注意事项：
1）工作台面上，不要存 放不必要的物品，以 保持工作区内的洁净 气流不受干扰。
2）操作时一定注意关掉 紫外，防止对实验人 员造细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的
第34页/共45页
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外 照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EBDNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB 发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与 DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
第35页/共45页
附 注：
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
第21页/共45页
注意事项
1、电泳仪工作时，禁止人体接触电极、电泳物及其它 可能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，以免触电， 同时要求仪器有良好接地端，以防漏电。
2、仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头， 以防短路。
3、由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳所通过的 电流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同， 故不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
备及核酸检测
第31页/共45页
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电 泳一般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界 面电泳不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区 带电泳则需用各种类型的物质作为支持物，常用的支 持物有滤纸、醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶 性支持物及硅胶-G薄层等，分子生物学领域中最常 用的是琼脂糖凝胶电泳其优点主要在于操作简单、快 速、灵敏。
[课件]PCR仪和凝胶成像系统PPT
![[课件]PCR仪和凝胶成像系统PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/e808c626cc1755270622081f.png)
泸州医学院药理毒理研究室
EB染色应用于双Marker DNA琼脂糖凝胶电泳成像
泸州医学院药理毒理研究室
SYBR Green荧光染料应用于NA琼脂糖凝胶电泳的成像
泸州医学院药理毒理研究室
考马斯亮蓝染色玉米种 子蛋白质SDS-PAGE电 泳的凝胶成像
微孔板荧光成像
泸州医学院药理毒理研究室
ECL发光底物检测小鼠BSA 蛋白的蛋白免疫印迹 （Western Blot）的成像
10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 2.0μL 1.0 μL 1.0 μL
10μmol/L引物2
质粒DNA Taq 水补充至
1.0μL
1.0 μL 0.1 μL(5U) 25.0 μL
泸州医学院药理毒理研究室
2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 25-35 个循环 ⑶45-65℃ 30’’-1’ ⑷72℃ n’ ⑹72℃ ⑺4-10℃ 3-7’ 保存 ⑵94℃ 30’’ 预变性（使模板充分变性） 变性 复性（使引物与模板充分退火） 延伸 (按1’扩增1kb计算） 总的延伸（使产物延伸完整）
泸州医学院药理毒理研究室
原位PCR(In situ PCR)
原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR ，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团 直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为 直接法和间接法。 基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原 位PCR扩增→冲洗→产物检测 优点：灵敏度高，可进行细胞内定位
英国Techne多功能型 PCR仪TC-412
泸州医学院药理毒理研究室
EB染色应用于双Marker DNA琼脂糖凝胶电泳成像
泸州医学院药理毒理研究室
SYBR Green荧光染料应用于NA琼脂糖凝胶电泳的成像
泸州医学院药理毒理研究室
考马斯亮蓝染色玉米种 子蛋白质SDS-PAGE电 泳的凝胶成像
微孔板荧光成像
泸州医学院药理毒理研究室
ECL发光底物检测小鼠BSA 蛋白的蛋白免疫印迹 （Western Blot）的成像
10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 2.0μL 1.0 μL 1.0 μL
10μmol/L引物2
质粒DNA Taq 水补充至
1.0μL
1.0 μL 0.1 μL(5U) 25.0 μL
泸州医学院药理毒理研究室
2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 25-35 个循环 ⑶45-65℃ 30’’-1’ ⑷72℃ n’ ⑹72℃ ⑺4-10℃ 3-7’ 保存 ⑵94℃ 30’’ 预变性（使模板充分变性） 变性 复性（使引物与模板充分退火） 延伸 (按1’扩增1kb计算） 总的延伸（使产物延伸完整）
泸州医学院药理毒理研究室
原位PCR(In situ PCR)
原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR ，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团 直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为 直接法和间接法。 基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原 位PCR扩增→冲洗→产物检测 优点：灵敏度高，可进行细胞内定位
英国Techne多功能型 PCR仪TC-412
泸州医学院药理毒理研究室
Bio-Rad凝胶成像分析仪PPT课件
2021
显
更
示
改
将分 将分 将分
数
分
析表ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ析表 析表
据
析
复制 导出 导出
选
表
到剪 到文 到EXCEL
项
方
切板 件
向
3.3.2.4 分子量分析
点击“分析工具箱”中的“MW分析工具”，在标准项下，点击“更改”，选择 所需的“分子量标准”，选择“标准泳道”，点击“分析表”，即可查看所要检测的 蛋白的分子量，通过“主窗口工具栏”的“标准曲线”查看标准曲线、“报告栏”查 看报告。
2021
3.2.2 此时可以点击主窗口工具栏的“快照”或“保存”，分别保存照片和软件格式，一边
日后查看或分析。
2021
3.3 图像分析
3.3.1 自动分析
点击左侧“分析工具箱”下方的“自动分析”，进行“检测设置”和“分子量分析设置” 点击“确定”，完成对图像的自动分析。
2021
3.3.2 手动分析 3.3.2.1 点击左侧“分析工具箱”下方的“图 像工具”，可以对图像进行“水平”和“垂直” 的翻转，“向左90°”、“向右90°”和“自定 义”的旋转，以及“裁切”、“逆变数据”、 “合并”等操作。
2021
3.3.2.5 定量工具
定量工具包括“相对定量”和 “绝对定量” 。在“相 对定量”里我们选用泳道5的1号条带为参考条带，其被定 义为“1”，其余条带依次得出相对结果。
2021
3.3.2.5 定量工具——“绝对定量”
通过选择已知标准品浓度的条带（至少两个以上，以R表示），并设定合适 的回归参数计算所得之标准曲线来推算目标条带的绝对浓度，具体数据可以查看 分析表。
背景扣除方法里的“局部”是通过我们所圈选的未知 条带和标准条带的像素密度总和来进行背景值的扣抵； “全局”是通过整张胶（膜）的背景平均的密度来进行背 景值的扣抵。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
10 X PCR反应缓冲液 2.5 μL 25mmol/L MgCl2 10mmol/L dNTP 10μmol/L 引物1 2.0μL 1.0 μL 1.0 μL
10μmol/L引物2
质粒DNA Taq 水补充至
1.0μL
1.0 μL 0.1 μL(5U) 25.0 μL
泸州医学院药理毒理研究室
2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 25-35 个循环 ⑶45-65℃ 30’’-1’ ⑷72℃ n’ ⑹72℃ ⑺4-10℃ 3-7’ 保存 ⑵94℃ 30’’ 预变性（使模板充分变性） 变性 复性（使引物与模板充分退火） 延伸 (按1’扩增1kb计算） 总的延伸（使产物延伸完整）
泸州医学院药理毒理研究室
荧光定量PCR(FQ-PCR)
融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和 荧光多重PCR (multiplex PCR)
多重PCR技术的难点在于其多对引物的设计，必需保 证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板 区域具有高度特异性
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70
(%)
80 90
100
温度(℃)
反应体系中：浓度0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。
泸州医学院药理毒理研究室
PCR反应体系
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 辅助因子：Mg2+
1988年Saiki 等从温 泉（ Hot spring）中 分离的一株水生嗜热 杆菌(thermus aquaticus) 中提取到
一种耐热DNA聚合酶
。
thermus aquaticus
泸州医学院药理毒理研究室
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100 耐高温
此酶的发现, 被PCR广泛应用 。在 1989 年，Science 将 PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分 子 (Molecule of the year)
Taq
P1 Mg2+ dCTP
反应条件
dATP dGTP
P2
dTTP
泸州医学院药理毒理研究室
PCR反应条件
温度、时间和循环次数。
温度三点法
94℃
变性
55℃
退火
72℃
延伸
PCR循环
泸州医学院药理毒理研究室
PCR反应条件
(1)变性
(2)
使双链DNA解链为单链
94℃， 20-30秒
PCR仪
(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 ; 降低温度可增加反应的灵敏性。 一般为45～65℃, 30秒
二、实验材料、仪器和试剂 1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体 Pmd18-T 质粒DNA 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及 PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂： 10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 泸州医学院药理毒理研究室 10mmol/L dNTP
三、操作步骤
1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试 剂 并混匀：
PCR三步曲
变性 退火 90～97℃ 45～65℃ 延伸 70～75 ℃
PCR过程
一生二，二生四，四生万物
泸州医学院药理毒理研究室
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
用 途 广 泛
生命学科 肿瘤 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学
泸州医学院药理毒理研究室
PCR示例
一、实验目的 学习PCR分析的原理与技术。
泸州医学院药理毒理研究室
（3）延伸
70-75℃,一般为72℃
延伸时间由扩增片段长度决定，1分钟扩增1Kbp
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
泸州医学院药理毒理研究室
PCR的基本原理
泸州医学院药理毒理研究室
PCR的基本原理小结
变性、复性、半保留复制
它最大的特点就是能不断推出新形式。
—— 摘自[Making PCR: A Story of
Paul Rabinow]
泸州医学院药理毒理研究室
Biotechnology by
以PCR为基础的相关技术
逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)
实时荧光定量PCR (quantitative PCR )
泸州医学院药理毒理研究室
原位PCR(In situ PCR)
原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR ，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团 直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为 直接法和间接法。 基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原 位PCR扩增→冲洗→产物检测 优点：灵敏度高，可进行细胞内定位
体内DNA的复制体系
5’
3’
模板 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB DNA聚合酶（I II III） 引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 模板
DNA聚合酶 Mg2+
dNTP
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
英国Techne多功能型 PCR仪TC-412
泸州医学院药理毒理研究室
3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比
例混匀,上样电泳。
琼脂糖凝胶电泳
泸州医学院药理毒理研究室
PCR?
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
——凯利· 穆利斯（Kary Mullis)
PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可 操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为 新的概念。 …
多重PCR (multiplex PCR)
免疫PCR
差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR)
PCR诱导定点突变
原位PCR (in situ PCR)
泸州医学院药理毒理研究室
逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)
PCR仪和凝 胶成像系统
内 容
PCR的反应原理及反应体系
PCR示例 凝胶成像系统
多聚酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出
的一种在体外简化条件下模拟DNA体
内复制的DNA快速扩增的方法，此技
术获得1993年诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis
10μmol/L引物2
质粒DNA Taq 水补充至
1.0μL
1.0 μL 0.1 μL(5U) 25.0 μL
泸州医学院药理毒理研究室
2.将反应体系放到PCR仪中扩增，PCR反应程序设置为 ⑴94~96℃ 30’’-3’ 25-35 个循环 ⑶45-65℃ 30’’-1’ ⑷72℃ n’ ⑹72℃ ⑺4-10℃ 3-7’ 保存 ⑵94℃ 30’’ 预变性（使模板充分变性） 变性 复性（使引物与模板充分退火） 延伸 (按1’扩增1kb计算） 总的延伸（使产物延伸完整）
泸州医学院药理毒理研究室
荧光定量PCR(FQ-PCR)
融汇PCR技术、DNA探针杂交技术(标记有荧光报告基团和 荧光多重PCR (multiplex PCR)
多重PCR技术的难点在于其多对引物的设计，必需保 证多对引物之间不形成引物二聚体，引物与目标模板 区域具有高度特异性
酶 80 活 性 60
40
20
40 50 60 70
(%)
80 90
100
温度(℃)
反应体系中：浓度0.5-2.5 U/50 l 酶量增加使反应特异性下降; 酶量过少影响反应产量。
泸州医学院药理毒理研究室
PCR反应体系
模板：DNA 引物：P1 P2 DNA聚合酶：Taq 原料：dNTP 辅助因子：Mg2+
1988年Saiki 等从温 泉（ Hot spring）中 分离的一株水生嗜热 杆菌(thermus aquaticus) 中提取到
一种耐热DNA聚合酶
。
thermus aquaticus
泸州医学院药理毒理研究室
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100 耐高温
此酶的发现, 被PCR广泛应用 。在 1989 年，Science 将 PCR中的Taq DNA多聚酶命 名为当年的风云分 子 (Molecule of the year)
Taq
P1 Mg2+ dCTP
反应条件
dATP dGTP
P2
dTTP
泸州医学院药理毒理研究室
PCR反应条件
温度、时间和循环次数。
温度三点法
94℃
变性
55℃
退火
72℃
延伸
PCR循环
泸州医学院药理毒理研究室
PCR反应条件
(1)变性
(2)
使双链DNA解链为单链
94℃， 20-30秒
PCR仪
(2) 退火 温度由引物长度和GC含量决定。 增加温度能减少引物与模板的非特异性结合 ; 降低温度可增加反应的灵敏性。 一般为45～65℃, 30秒
二、实验材料、仪器和试剂 1、材料：含1Kb插入片段的克隆载体 Pmd18-T 质粒DNA 2、仪器：微量移液器及吸头、PCR仪及 PCR管 琼脂糖凝胶电泳设备 3、试剂： 10XPCR 反应缓冲液 25mmol/L MgCl2 泸州医学院药理毒理研究室 10mmol/L dNTP
三、操作步骤
1.按照如下体积向PCR管中按顺序加入各试 剂 并混匀：
PCR三步曲
变性 退火 90～97℃ 45～65℃ 延伸 70～75 ℃
PCR过程
一生二，二生四，四生万物
泸州医学院药理毒理研究室
梯度PCR仪
实时荧光定量PCR仪
普通PCR仪
用 途 广 泛
生命学科 肿瘤 遗传工程 疾病诊断 法医学 考古学
泸州医学院药理毒理研究室
PCR示例
一、实验目的 学习PCR分析的原理与技术。
泸州医学院药理毒理研究室
（3）延伸
70-75℃,一般为72℃
延伸时间由扩增片段长度决定，1分钟扩增1Kbp
（4）循环次数 主要取决于模版DNA的浓度 一般为25-35次 次数过多：扩增效率降低 错误掺入率增加
泸州医学院药理毒理研究室
PCR的基本原理
泸州医学院药理毒理研究室
PCR的基本原理小结
变性、复性、半保留复制
它最大的特点就是能不断推出新形式。
—— 摘自[Making PCR: A Story of
Paul Rabinow]
泸州医学院药理毒理研究室
Biotechnology by
以PCR为基础的相关技术
逆转录PCR (reverse transcription PCR, RT-PCR)
实时荧光定量PCR (quantitative PCR )
泸州医学院药理毒理研究室
原位PCR(In situ PCR)
原位PCR是指在组织或细胞标本片上直接进行PCR ，对细胞中的靶DNA进行扩增，通过掺入标记基团 直接显色或结合原位杂交进行检测的方法。可分为 直接法和间接法。 基本步骤：组织切片或细胞固定→蛋白酶消化→原 位PCR扩增→冲洗→产物检测 优点：灵敏度高，可进行细胞内定位
体内DNA的复制体系
5’
3’
模板 拓扑异构酶 解旋酶类 SSB DNA聚合酶（I II III） 引物 dNTP Mg2+
Mullis的PCR构思
引物 模板
DNA聚合酶 Mg2+
dNTP
DNA聚合酶
引物
特定DNA片段
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
英国Techne多功能型 PCR仪TC-412
泸州医学院药理毒理研究室
3.反应完成后,将反应液与凝胶电泳缓冲液按比
例混匀,上样电泳。
琼脂糖凝胶电泳
泸州医学院药理毒理研究室
PCR?
PCR只是一个简单的不起眼玩艺
——凯利· 穆利斯（Kary Mullis)
PCR只是一个概念，所发生的奇迹是：PCR概念变成了可 操作的实验系统，变成了一项成熟的技术，后者又上升成为 新的概念。 …
多重PCR (multiplex PCR)
免疫PCR
差异显示PCR (differential display PCR, DD-PCR)
PCR诱导定点突变
原位PCR (in situ PCR)
泸州医学院药理毒理研究室
逆转录PCR(reverse transcription PCR,RT-PCR)
PCR仪和凝 胶成像系统
内 容
PCR的反应原理及反应体系
PCR示例 凝胶成像系统
多聚酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆利斯提出
的一种在体外简化条件下模拟DNA体
内复制的DNA快速扩增的方法，此技
术获得1993年诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis