RT-qPCR技术的原理及应用 ppt课件

HBx DNA/ RNA 检测均为阳性, 其中HBeAg ( + ) 者fRNA 检
出率较HBeAg( - ) 者高; 22 例HBsAg ( - ) 肝组织, 有16 例可
检测到HBx DNA 或RNA,HBsAg( - ) 的隐匿性感染在中国人
终末期肝病中有较高的检出率72. 7%; HBV 病毒转录体
纵 轴 ： 荧 光 信 号 量
横轴：PCR反映循环数
Ct值的特点：
相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定；
Ct值则极具重现性
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实时荧光定量PCR 原理 --------- 定量原理
•理想的PCR反应：
•
X=X0*2n
•非理想的PCR反应：
•
X=X0 (1+Ex)n
• n：扩增反应的循环次数
实时原理
常 规 PCR技术：
对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每
一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析
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实时荧光定量PCR 原理 -------Ct值的重现性
摘要目的: 探讨肝组织中HBV DNA 和病毒转录体与终
末期肝病的关系. 方法: 用TRIzol 从肝组织中提取组织核酸,
PCR 及RT������ PCR 扩增HBV XDNA, XRNA, fRNA 和
trRNA, 琼脂糖凝胶电泳显示产物, Southern������ blot 杂交验
证PCR 扩增的可靠性. 结果: 27 例HBsAg ( + ) 肝组织, 19 例
trRNA 在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏
疾病( P < 0. 05) . 结论: HBV隐匿性感染与中国人终末期肝
病的发生密切相关, 肝组织中HBV trRNA 也与终末期肝病关
系密切.
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实时荧光定量PCR 原理
应用
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实时荧光定量PCR 原理
应用
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实时荧光定量PCR 原理
•绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究
•相对定量(Relative Quantification，RQ) 高通量基因检测方法的验证 药物疗效考核 耐药性研究
应用
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实时荧光定量PCR 原理
应用
中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测
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SYBR Green 法
应用范围
起始模板的测定
基因型的分析
融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规 PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一 引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。
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实时荧光定量PCR法
标准样品
绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA
实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR)
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实时荧光定量PCR定义
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实时荧光定量PCR定义
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法
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实时荧光定量PCR 原理
相对定量中的内标 • 内标通常是β-actin、GAPDH、18S rRNA基因等看家基因
• 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小
•内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量
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SYBR Green
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SYBR Green 法
工作机理
SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位
SYBR Green
SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在 此阶段采集荧光信号。
融解曲线分析，出现杂峰
其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
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SYBR Green 法 ------------PCR反应的建立
反应体系的建立及优化: 1. SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不
易检测 2. Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 3. MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 4. 反应Buffer 体系的优化 5. 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 6. 其他与常规PCR相同
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实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理
Excitation Excitation
SG
5’
SG
SG
3’
3’
No Emission
SG
5’
SG
SG
SG SG
Emission
5’
3’
3’
SG
SG
SG
5’
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SYBR Green 法
非特异性产物
融解曲线分析
融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确
• X：第n次循环后的产物量
• X0：初始模板量 • Ex：扩增效率
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实时荧光定量PCR 原理 --------- DNA 产物的荧光标记
非特异性荧光标记：
1、 SYBR Green
特异性荧光标记：
2、TaqMan
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实时荧光定量PCR 方法 1 ---------SYBR Green 法