制备小鼠骨髓来源巨噬细胞

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巨噬细胞的培养方法

巨噬细胞的培养方法
巨噬细胞的培养方法如下：
1. 获取巨噬细胞：常用的来源包括小鼠、人类等。

可以通过小鼠或者人类的骨髓、外周血或者器官（例如脾脏、肺）中分离巨噬细胞。

2. 细胞培养基的准备：常用的细胞培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）等。

细胞培养基需要加入适量的无菌胎牛血清（FBS）或者人工合成的替代物，例如脂质体。

3. 细胞的分离：将获得的组织样本经过适当的处理，例如组织碎片化、酶消化等，使细胞释放出来。

4. 细胞的培养：将分离得到的巨噬细胞悬浮于细胞培养基中，通过离心将巨噬细胞沉淀在培养皿的底部。

5. 进一步培养：将巨噬细胞培养在37C的恒温培养箱中，提供合适的氧气和二氧化碳浓度，适当转移和补充新鲜的培养基。

6. 细胞的检测和分离：通过显微镜观察巨噬细胞的形态和数量，也可以使用流式细胞仪等方法对细胞进行检测和分析。

这些是常规的巨噬细胞培养方法，具体操作细节可能根据实验目的和细胞来源的不同而有所变化。

bmdc培养方法

bmdc培养方法BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞(Dendritic Cell, DC)培养方法，主要用于研究DC的功能和调控机制。

以下是关于BMDC 培养方法的详细介绍：1. 实验材料准备：小鼠骨髓细胞RPMI-1640培养基小鼠GM-CSF(粒细胞巨噬细胞集落刺激因子)和IL-4(白细胞介素-4)无菌培养箱、离心机、显微镜等实验设备2. BMDC的获取：从小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓细胞，用RPMI-1640培养基洗涤并悬浮。

将骨髓细胞以1×10^6/mL的密度接种到无菌的培养瓶中，加入GM-CSF和IL-4，使其终浓度分别为50ng/mL和20ng/mL。

将培养瓶置于37℃，5%CO2的培养箱中，每两天更换一次培养基。

3. BMDC的成熟：在BMDC培养的第5天，用GM-CSF和IL-4继续诱导BMDC的成熟。

此时，GM-CSF的浓度可以降低至25ng/mL，而IL-4的浓度可以维持在20ng/mL。

在BMDC培养的第7天，观察BMDC的形态变化，成熟的BMDC 呈树突状，表面有丰富的毛刺状突起。

此时，可以收集成熟的BMDC 进行后续实验。

4. BMDC的功能检测：将成熟的BMDC与抗原提呈细胞(如B细胞、T细胞等)共培养，观察BMDC对抗原提呈细胞的激活作用。

将成熟的BMDC与特异性抗体结合，观察BMDC对抗原的识别和摄取能力。

将成熟的BMDC与免疫细胞(如T细胞、NK细胞等)共培养，观察BMDC对免疫细胞的调节作用。

5. BMDC的应用：用于研究DC的功能和调控机制，如DC的抗原提呈、共刺激信号传导、凋亡抑制等。

用于制备疫苗，通过激活T细胞和B细胞，提高机体对病原体的免疫力。

用于研究免疫耐受、自身免疫性疾病等疾病模型。

总之，BMDC培养方法是一种常用的小鼠树突状细胞培养方法，通过诱导骨髓细胞分化为成熟的树突状细胞，可以用于研究DC的功能和调控机制，以及制备疫苗等应用。

棕榈酸诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化

doi:10.3969/j.issn.1000⁃484X.2020.20.001㊃基础免疫学㊃棕榈酸诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化①张焱皓　刘芊伊　冯继红②　李　茂　刘利萍　秦　欢　罗军敏(遵义医科大学免疫学教研室,贵州省免疫分子应用研究工程中心,遵义563003) 中图分类号　R392.9 文献标志码　A 文章编号　1000⁃484X (2020)20⁃2433⁃05①本文为国家自然科学基金地区项目(No.81860291)和浙江省中医药管理局课题项目(2020ZB292)㊂②丽水市人民医院肿瘤科,丽水323000㊂作者简介:张焱皓,男,在读硕士,主要从事感染免疫学方面的研究,E⁃mail:zyh_777163@㊂通讯作者及指导教师:罗军敏,女,硕士,教授,硕士生导师,主要从事感染免疫学方面的研究,E⁃mail:luojm 16128@㊂[摘　要]　目的:探讨棕榈酸(PA)对小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)极化的影响及机制㊂方法:提取BALB /c 小鼠骨髓细胞,于含有10%胎牛血清和20ng /ml GM⁃CSF 的DMEM 低糖培养基中诱导7d 后得到BMDM,给予不同浓度PA,CCK8检测巨噬细胞活性变化,确定最佳诱导浓度㊂倒置显微镜观察诱导后巨噬细胞形态㊂RT⁃PCR 检测TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃12㊁诱导型一氧化氮合酶(iNOS)㊁转化生长因子⁃β(TGF⁃β)㊁IL⁃10㊁Fizz1及YM⁃1mRNA 表达,流式细胞术检测NOS2㊁CD206表达,Western blot 检测MAPK 信号通路相关蛋白表达㊂结果:PA 诱导巨噬细胞的最佳浓度为400μmol /ml,巨噬细胞呈现M1型极化样的长梭形,与未处理组相比,PA 诱导组炎症细胞因子TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃12及iNOS mRNA 水平在诱导后12~72h 表达升高,而抑炎细胞因子TGF⁃β㊁IL⁃10㊁Fizz1及YM⁃1的转录水平受到抑制,48h 时,巨噬细胞高表达NOS2,而CD206表达一直处于较低水平㊂PA 诱导巨噬细胞MAPK 信号通路相关蛋白p⁃ERK㊁p⁃JNK 及p⁃p38高表达,p⁃65入核㊂结论:PA 可诱导小鼠BMDM M1型极化,可能通过MAPK 信号通路传导信号给NF⁃κB 影响巨噬细胞极化㊂[关键词]　巨噬细胞;棕榈酸;极化;MAPK 信号通路Palmitic acid induces mouse bone marrow⁃derived macrophages M1polarizationZHANG Yan⁃Hao ,LIU Qian⁃Yi ,FENG Ji⁃Hong ,LI Mao ,LIU Li⁃Ping ,QIN Huan ,LUO Jun⁃Min .Department of Im⁃munology ,Zunyi Medical University ,Immune Molecules Application Research Center of Guizhou Province ,Zunyi 563003,China[Abstract ]　Objective :To investigate effect of palmitic acid(PA)on polarization of mouse bone marrow⁃derived macrophages (BMDM)and its mechanism.Methods :Mouse BMDM were harvested and cultured in DMEM low glucose medium containing 10%fetal bovine serum with 20ng /ml GM⁃CSF for 7d to obtain BMDM.BMDMs were treated with different concentrations of PA and CCK8was used to detect cell viability of macrophages and determined optimal concentration for induction.Morphology of macrophages was observed after induction by inverted microscope.Relative mRNA expression levels of TNF⁃α,IL⁃6,IL⁃12,inducible nitric oxide synthase (iNOS),transforming growth factor⁃β(TGF⁃β),IL⁃10,Fizz1,YM⁃1were determined by RT⁃PCR.Expression levels of NOS2and CD206were determined by flow cytometry.MAPK signaling pathway⁃related proteins were detected by Western blot.Results :Optimal concentration of PA⁃induced macrophages was 400μmol /ml.Macrophages showed a long fusiform shape like pared with untreated group,PA induced groups mRNA expression levels of flammatory cytokines TNF⁃α,IL⁃6,IL⁃12and iNOS were increased at 12-72h,while transcription levels of anti⁃inflammatory cytokines TGF⁃β,IL⁃10,Fizz1,YM⁃1were inhibited;macrophage incubated with PA expressed NOS2at 48h,while expression of CD206was always at a low level.PA induced high expressions of p⁃ERK,p⁃JNK,p⁃p38that related to JNK /P38MAPK signaling pathway,and p⁃65was transferred to nucleus.Conclusion :PA induces expressions of macrophage inflammatory cytokines and signals to NF⁃κB via MAPK signaling pathway,which induces M1polarization of BMDM.[Key words ]　Macrophages;Palmitic acid;Polarization;MAPK signaling pathway 巨噬细胞是组织动态平衡和炎症反应中的关键细胞,发挥基本的组织特异性功能并保护机体免受感染㊂巨噬细胞因所处微环境中细胞因子㊁微生物及其产物和其他刺激物极化为特定表型,根据刺激物的不同,IFN⁃γ激活的巨噬细胞被定义为经典激活型巨噬细胞(M1),IL⁃4激活为替代激活型巨噬细胞(M2),且M2型巨噬细胞可细分为M2a㊁b㊁c [1⁃3]㊂M1型巨噬细胞具有促炎特性,高表达炎症细胞因子如TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃12㊁诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase2,iNOS或NOS2)等,具有杀灭病原体及抗肿瘤功能;而M2型巨噬细胞膜表面高表达CD206,分泌大量转化生长因子⁃β(transforming growth factor⁃β,TGF⁃β)㊁IL⁃10㊁炎症区域分子1(found in inflammatory zone1,Fizz1)㊁类几丁质酶3样分子3(chitinase3⁃like3,Chi3L3或YM⁃1)等细胞因子,可促进细胞增殖和组织修复[4]㊂受病原体及肿瘤微环境影响,巨噬细胞以M2型为主,分泌抑炎细胞因子,发挥免疫抑制作用,导致病原菌感染或肿瘤进展㊂因此,调控免疫抑制状态下巨噬细胞的极化表型尤其重要㊂棕榈酸(palmitic acid, PA)是脂肪生成过程中产生的脂肪酸㊂研究表明中草药中也含有PA,在昆仑雪菊花中PA占比达9.71%,在黄蜀葵子中占比约为5.88%,在猫爪草中占比为2.64%[5⁃7]㊂陈冬梅等[8]发现党参中提取的PA具有免疫活性,作用于TNF及IL⁃10发挥免疫调节作用㊂大量研究表明,PA是一种致炎能力极强的脂肪酸,常用于构建体外脂毒性损伤模型[9⁃11]㊂因此作为中草药中常见的单体成分,有必要了解PA 对机体免疫细胞的功能影响,明确其作用机制㊂本研究通过将PA配制为水溶液,将其直接加入细胞培养基中,检测巨噬细胞极化相关标志物的动态变化,观察BMDM受诱导后的极化表型,并探讨PA诱导巨噬细胞M1型极化的机制㊂1　材料与方法1.1　材料　6~10周龄雌性BALB/c小鼠购于重庆市第三军医大学医学实验动物中心,并饲养于本实验室清洁级动物房㊂PA购于Sigma公司,纯度≥99%㊂小鼠重组GM⁃CSF购于NOVUS㊂RNAiso TM Plus㊁PrimeScript TM RT Reagent Kit(RR037A)㊁SYBR Premix Ex Taq Real⁃time PCR购于TaKaRa㊂Cell Counting Kit⁃8购于东仁化学科技(上海)有限公司㊂分析纯氯仿㊁异丙醇㊁无水乙醇等购于重庆川东化工公司㊂DMEM低糖培养基购于Gibco,胎牛血清购于MRC㊂引物购于上海生物工程有限公司㊂APC 标记的抗小鼠CD11b抗体(cat.no.17⁃0112⁃82, eBioscience)㊁FITC标记的抗小鼠F4/80抗体(cat.no.11⁃4801⁃82,eBioscience)㊁APC标记的抗小鼠CD206抗体(cat.no.17⁃2061⁃82,eBioscience)和PE标记的抗小鼠Nos2抗体(cat.no.25⁃5920⁃82, eBioscience)购于赛默飞㊂Anti⁃JNK(No.9252s)㊁Anti⁃p⁃JNK(No.4668s)㊁Anti⁃NF⁃κB(No.8242s)㊁Anti⁃p⁃NF⁃κB(No.3033s)一抗购于CST㊂anti⁃p38 MAPK(No.ab197348)㊁anti⁃ERK(No.196883)㊁anti⁃AKT(No.ab8805)㊁anti⁃phospho ERK(No. ab50011)㊁anti⁃phospho AKT(No.ab81283)㊁anti⁃phospho p38⁃MAPK(No.ab47363)㊁anti⁃GAPDH(No. ab181602)㊁Anti⁃Lamin B1(No.ab16048)及anti⁃IKBα(No.ab32518)一抗购于Abcam㊂Anti⁃rabbit Ab conjugated to HRP(No.7074s)二抗购于CST㊂1.2　方法1.2.1　小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDM)的获取　无菌条件下取BALB/c小鼠胫骨和腓骨细胞置于含有10%胎牛血清㊁20ng/ml GM⁃CSF的DMEM低糖培养基中,37℃㊁5%CO2条件下培养7d,流式细胞术检测骨髓细胞F4/80和CD11b双阳性比率㊂1.2.2　PA脂性培养基配置　称取0.04g NaOH溶于10ml ddH2O配置成浓度为0.1mol/ml的NaOH 溶液用于后续实验,称取0.1g PA置于9ml NaOH溶液中,75℃水浴加热30min㊂称取1.2g BSA于55℃预热的3ml PBS中,8000r/min离心20min㊂向75℃的PA㊁NaOH混合液中加入BSA溶液,摇匀后55℃助溶30min㊂细菌过滤器过滤后紫外照射30min灭菌㊂1.2.3　CCK8检测巨噬细胞活性　将PA以100㊁300㊁400和500μmol/ml刺激小鼠BMDM24h后,收集培育7d的BMDM于离心管,计数,以1∶2比例依次采用DMEM等比稀释为至少3个细胞浓度梯度,接种于96孔板,每组设3~6个复孔㊂孵育箱培养24h使细胞贴壁,10μl/孔加入CCK8试剂,孵育4h 后于450nm处测定OD值,并绘制标准曲线㊂1.2.4　RT⁃PCR检测细胞因子表达　收集样品, TRIzol提取RNA,按照TaKaRa说明书构建10μl逆转录体系,反应条件为37℃15min,85℃5s,逆转录为cDNA㊂构建20μl反应体系,95℃10min,95℃15s;60℃30s,39个循环㊂引物序列见表1㊂1.2.5　流式细胞术检测巨噬细胞NOS2和CD206表达　收集细胞于EP管,加入流式抗体4℃避光孵育30min㊂洗去未结合的抗体后流式细胞术检测㊂1.2.6　Western blot检测MAPK通路相关蛋白表达　提取细胞核蛋白㊂全蛋白提取按照如下操作:加入含有蛋白酶抑制剂㊁磷酸酶抑制剂和PMSF的Lysis Buffer于细胞培养板中,细胞刮刀刮取细胞并制备蛋白;测定各组总蛋白浓度后,加入上样缓冲液制备样品,电泳㊁转膜㊁脱脂奶粉封闭㊁洗膜,加入一抗孵育过夜,加入二抗,ECL化学发光试剂曝光㊂1.3　统计学处理　采用Garphpad进行数据正态性检验,正态性分布样本行t检验,非态分布样本采用秩和检验,数据以x±s表示,以P<0.05为差异有统计学意义㊂2　结果2.1　PA对小鼠BMDM的影响　与未处理组相比,当PA浓度为400μmol/ml时,对小鼠BMDM活性无影响,且为诱导巨噬细胞的最大浓度㊂以此浓度作为诱导巨噬细胞极化的浓度进行后续实验,见图1㊂2.2　PA对小鼠BMDM形态的影响　M0细胞呈椭圆形,400μmol/L PA诱导24h后,细胞呈长梭形且伪足细长,与M1巨噬细胞形态一致㊂表明PA可能诱导巨噬细胞M1型极化,见图2㊂2.3　PA对小鼠BMDM细胞因子表达的影响　与未处理组相比,PA诱导巨噬细胞后,M1型相关细胞因子mRNA水平在0~72h上调,其中IL⁃6mRNA水平在诱导36h后达到峰值,IL⁃12mRNA水平在12h后达到峰值,iNOS mRNA水平在48h后达到峰值,而TNF⁃αmRNA水平在24h后达到峰值㊂PA诱导后M2型相关细胞因子表达下调,且YM⁃1㊁IL⁃10在被诱导后12h出现低转录状态,TGF⁃β出现于24h,而Fizz1出现于36h㊂表明在PA诱导后,小鼠BMDM 上调M1型相关细胞因子转录,同时下调M2型相关细胞因子转录,提示PA可能具有诱导巨噬细胞M1型极化的作用,见图3㊂2.4　PA对小鼠BMDM NOS2及CD206表达的影响　PA诱导后,F4/80+NOS2+细胞占比明显上升,且于36h达到峰值㊂PA诱导组F4/80+CD206+细胞比表1　引物序列Tab.1　Primer sequencesGenes Primer sequences(5′⁃3′) GAPDH F:GAGCCAAACGGGTCATCATCTR:GAGGGGCCATCCACAGTCTT TNF⁃αF:CAGGGGCCACCACG CTCTTCR:TTTGTGAGTGTGAGGGTCTGGIL⁃10F:TACAGCCGGGAAGACAATAAR:AGGAGTCGGTTAGCAGTATG TGF⁃βF:GGCGGTGCTCGCTTTGTAR:TCCCGAATGTCTGACGTATTGA iNOS F:CTGCAGCACTTGGATCAGGAACCTGR:GGAGT AGCCTGTGTGTGCACCTGGAA Arg⁃1F:CAGAAGAATGGAAGAGTCAGR:CAGATATGCAGGGAGTCACCYM⁃1F:GCAGAAGCTCTCCAATCCTGR:ATTGGCCTGTCCTTAGCCCAACTG Fizz1F:GCTGATGGTCCCAGTGAATACR:CCAGTAGCAGTCATCCCAGC 例虽然在24h时显著上升,但诱导48h后,CD206表达恢复至未处理组水平,表明在PA诱导后,巨噬细胞向M1型极化,见图4㊂图1　PA对小鼠BMDM活性的影响Fig.1　Effect of PA on mice BMDM viability Note:Compared with control group,*.P<0.05.图2　PA对小鼠BMDM形态的影响Fig.2　Effect of PA on BMDM morphology ofmice图3　PA对小鼠BMDM促炎细胞因子和抑炎细胞因子转录水平的影响Fig.3　Effect of PA on transcriptional levels of pro⁃inflammatory cytokines and anti⁃inflammatorycytokines in BMDM of miceNote:Compared with control group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.图4　PA对小鼠BMDM NOS2和CD206表达的影响Fig.4　Effect of PA on expression of NOS2and CD206in BMDM of miceNote:Compared with untreated group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.2.5　Western blot检测MAPK信号通路相关蛋白的表达　诱导后15min胞质中呈现p⁃ERK㊁p⁃JNK及p⁃p38表达,胞核中呈现p⁃NF⁃κB表达,30min时达到峰值,而IKBα相比于其15min时表达降低, 60min时p⁃ERK㊁p⁃JNK㊁p⁃p38及p⁃NF⁃κB有少量表达,而无IKBα表达㊂说明PA通过MAPK信号通路诱导巨噬细胞M1型极化,见图5㊂3　讨论巨噬细胞具有极强的可塑性,可极化为不同表型㊂M1型巨噬细胞可产生促炎细胞因子,促进炎症发展,杀伤病原体及肿瘤细胞㊂而M2型巨噬细胞释放抑炎细胞因子,抑制炎症反应,参与组织修复,介导肿瘤免疫逃逸㊂因此调控巨噬细胞极化在疾病防治中具有重要意义㊂近年大量研究报道了中草药对巨噬细胞极化的影响,中草药活性成分通过诱导巨噬细胞极化治疗疾病㊂PA是大部分中草药的主要成分㊂虽然已有研究报道PA可作为巨噬细胞TLR4的配体诱导机体产生炎症细胞因子,但其诱导巨噬细胞极化后表型的鉴定及相关机制研究尚未明确[12]㊂本研究从形态学出发观察到PA诱导后巨噬细胞形状呈梭型,形似M1型巨噬细胞㊂为验证其表型变化,检测巨噬细胞极化相关标志物的表达情况,发现相较于未处理组,PA诱导后M1型相关细胞因子TNF⁃α㊁IL⁃6㊁IL⁃12和iNOS在0~72h的转录水平升高数十倍,而M2型相关细胞因子TGF⁃β㊁IL⁃图5　PA对小鼠BMDM JNK/P38MAPK信号通路的影响Fig.5　Effect of PA on JNK/P38MAPK signaling pathway in mouse BMDMNote:Compared with0min group,*.P<0.05,**.P<0.01,***.P<0.001.10㊁Fizz1和YM⁃1的转录表达受到抑制,说明巨噬细胞转变为促炎表型㊂研究表明NOS2可作为巨噬细胞M1型极化的标志物[13]㊂本研究检测F4/80+ NOS2+巨噬细胞双阳性细胞比例结果显示,相较于未处理组,PA诱导6h后,NOS2表达上调,72h时F4/80+NOS2+双阳性细胞比例为16.3%,处于较高水平㊂为进一步验证巨噬细胞的极化表型,本研究检测了M2型极化标志物CD206表达[14]㊂结果显示,虽然F4/80+CD206+双阳性细胞比例在PA诱导24㊁36h时明显上升,但随着诱导时间推移,F4/80+ CD206+双阳性比例下降至未处理组水平,因此推测CD206表达上调的原因可能是在PA的刺激下所激活的通路引发CD206表达,但随着PA诱导时间推移,引发促炎细胞因子的正反馈刺激,巨噬细胞逐渐向M1型转化,CD206表达也随之下降,说明PA具有诱导巨噬细胞M1型极化的能力㊂巨噬细胞的极化过程涉及多种经典的信号通路,而MAPK信号通路尤其重要[15]㊂MAPK信号通路可将信号传导给核因子κB(nuclear factor⁃κB,NF⁃κB),导致巨噬细胞M1型极化[16]㊂本研究检测了PA对该信号通路的影响,加入PA后15min,检测到p⁃ERK㊁p⁃JNK,p⁃p⁃38表达,并通过提取核蛋白发现p⁃65入核㊂在诱导后30min,p⁃ERK㊁p⁃JNK及p⁃p⁃38表达明显上调,p⁃65在核蛋白中高表达㊂诱导后60min仍然可观察到MAPK信号通路的信号传递㊂大量研究表明只有当NF⁃κB和IKBα解聚后,其核定位序列暴露,才能被转运至细胞核内促进NF⁃κB依赖的基因转录,因此检测IKBα表达作为验证,结果显示IKBα的表达与NF⁃κB相反,进一步证明PA通过MAPK信号通路导致p⁃65入核,激活NF⁃κB,诱导巨噬细胞M1型极化㊂PA是中草药中的主要组成部分,但其对机体细胞功能的影响常常被忽略㊂目前研究发现,PA可通过激活库普弗细胞炎症小体导致非酒精性脂肪性肝炎进展[17]㊂此外,PA可作用于迁移抑制因子导致胰岛细胞功能紊乱和凋亡[18,19]㊂但Boubaker等[20]发现PA可阻碍可移植肿瘤发展,并提高荷瘤小鼠的脾细胞增殖率及宿主巨噬细胞溶酶体活性,发挥抗肿瘤作用㊂总之,在不同疾病中PA可能对疾病的转归发挥不同的作用㊂近年来中草药的活性成分在疾病治疗中发挥重要作用,而巨噬细胞的极化是疾病治疗的切入点,因此了解PA对巨噬细胞极化的影响将有助于中草药的开发和利用㊂参考文献:[1]　Nathan CF,Murray HW,Wiebe ME,et al.Identification of interfer⁃ongamma as the lymphokine that activates human macrophage oxi⁃dativemetabolism and antimicrobial activity[J].J Exp Med,1983, 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小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法(详细版)

小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备：超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40μm尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科镊、75％酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等。

操作步骤：（1）C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75％酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠。

（2）无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头。

然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中。

（3）移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1×PBS的另一细胞培养皿中清洗，最后再将其转移另一 75cm2细胞培养皿（含有1%双抗的DMEM的细胞培养基）中等待下一步处理。

（4）用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2ml DMEM 细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复 3 次。

（5）1500r/min，离心 8min，弃上清液。

（6）加入5ml红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置 3min。

（7）1500r/min，离心 8min，弃上清液。

（8）加入5ml DMEM 细胞培养基重悬细胞，然后用40μm尼龙过滤器过滤细胞。

（9）1500r/min，离心 8min，弃上清液，重复 3 次。

（10）a 加入含有 20%FBS/ DMEM 的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕。

b 加入含有 20ng/ml的 M-CSF 的 20%FBS/ DMEM 细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞。

细胞计数，调整细胞浓度至1×106／mL。

接种75cm2细胞培养皿中。

（11）放于37℃、5％二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。

小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定

小鼠三个不同部位巨噬细胞的分离培养与鉴定[摘要] 目的建立小鼠三种不同部位巨噬细胞体外分离培养的方法，并对其进行鉴定。

方法分别从小鼠腹腔、脾脏、骨髓中分离获取巨噬细胞，经台盼蓝染色计数后于含10%胎牛血清的DMEM培养液、1%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养；通过活细胞形态观察；HE 染色光镜观察；吞噬鸡红细胞功能检测；酸性磷酸酶及非特异性酯酶染色测定细胞内酶的表达等生物学技术鉴定培养的贴壁细胞性质。

结果获得高纯度的巨噬细胞，具有巨噬细胞的形态特征，具备良好的吞噬功能，鸡红细胞吞噬率分别为腹腔94.68%，脾脏92.47%，骨髓93.11%；酸性磷酸酶染色阳性率为腹腔89.43%，脾脏85.21%，骨髓88.55%；α-醋酸奈酚酯酶染色阳性率为腹腔85.32%，脾脏81.81%，骨髓85.76%。

结论小鼠三个不同部位均可简便实用的分离出巨噬细胞，可以满足不同的研究目的。

巨噬细胞不仅是许多病原体的宿主细胞,而且在先天性和后天性免疫应答过程中起着关键性作用[1-3],比如调节促炎和抗炎细胞因子的释放、吞噬或杀死胞内微生物和肿瘤细胞、降解和提呈抗原等。

它还可以与其他免疫细胞协同发挥更大的功能，比如树突状细胞、粒细胞、NK细胞和T细胞等。

小鼠巨噬细胞吞噬作用是反映机体非特异性免疫功能的主要指标，也是临床免疫学实验常用的方法之一。

现将已有的巨噬细胞分离方法改进，从3种不同部位分离小鼠巨噬细胞，并做以对比。

1 材料与方法1.1主要试剂和仪器DMEM培养基（Hyclone）；RPMI-1640培养基（GIBCO）；胎牛血清（GIBCO）；倒置显微镜（Olympus）；CO2培养箱（Binder，Thermo）。

1.2 从小鼠腹腔中分离巨噬细胞（1）取6~8周龄左右的小鼠，腹腔注射2mL无菌的液体石蜡。

待3~4d后收集腹腔细胞。

（2）颈椎脱臼法法处死小鼠，消毒，用注射器抽取5mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1~2 min，静置5min，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中。

制备小鼠骨髓来源巨噬细胞

制备小鼠骨髓来源巨噬细胞一、材料1.6-9周小鼠（GFP+小鼠、野生型小鼠）2.配制培养液：RPMI 1640培养液+1×GlutaMax（Gibco）+10%FBS（热失活）3.盐溶液：0.9%氯化钠溶液（无菌），储存于4度。

4.纯化的重组M-CSF（CSF-1）：到货后灭菌PCR管分装。

5.消毒后的手术器械。

6.70%乙醇溶液。

7.27G针头8.20ml注射器9.低绒纸巾10.100mm培养皿11.3个50ml离心管二、方法1.复温培养液（预添加M-CSF）至37摄氏度。

2.处死小鼠，喷洒70%乙醇溶液消毒。

拉扯双侧后腿直至听到清脆响声（提示股骨从髋骨脱臼）。

3.使用干净的剪刀、镊子沿一侧大腿环形剪开皮肤，向爪子方向剥离皮肤。

4.用镊子将腿部肌肉分开，露出股骨和胫骨（注意不要损伤骨头）。

5.切断股骨与髋骨间的韧带，切下膝关节以下的骨头。

将股骨和胫骨至于冰冷的盐溶液中。

6.同法处理另一只腿。

7.用低绒纸巾小心剥除骨骼上附着的组织，将骨头置入70%乙醇溶液中。

8.20ml无菌注射器吸满预热的培养液（无添加M-CSF），装上27G针头。

并准备好50ml离心管。

9.从膝关节处分离股骨和胫骨，丢弃膝盖骨。

一个无菌镊夹住股骨，用一把无菌剪刀剪掉股骨上端。

将针头插入骨髓腔，用培养液反复冲洗，将骨髓冲入50ml离心管。

冲洗过程中，上下移动针头刮扫骨髓腔。

每根骨头使用大约5ml培养液。

丢弃骨头。

10.同法处理胫骨（剪掉上下两端）。

11.将细胞悬液离心（150g，5分钟）。

丢弃上清，加入培养液（添加M-CSF）。

混匀细胞悬液。

12.每根骨头准备两个100mm培养皿。

将细胞悬液打入培养皿，添加预热培养液（添加M-CSF）至10ml。

13.置于37摄氏度、5%二氧化碳培养箱内培养5天。

14.第5天，使用室温盐溶液5ml冲洗培养皿（巨噬细胞为贴壁生长）。

使用细胞刮刀刮下贴壁细胞，转移入离心管，150g离心5分钟。

bmdms培养方法

bmdms培养方法
BMDMS是指骨髓来源的巨噬细胞（Bone Marrow-Derived Macrophages）。

它们是一种重要的免疫细胞，常被用于研究免疫学、生物学和疾病模型等方面。

下面我将从多个角度介绍BMDMS的培养
方法。

1. 材料准备。

常用培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）或RPMI 1640培养基，其中含有10%胎牛血清（FBS）或去
血清培养基，还有抗生素如青霉素/链霉素。

2. 培养骨髓细胞。

首先需要从小鼠或大鼠的骨髓中分离细胞。

通常使用灭菌的
方式，将小鼠或大鼠的胫骨和腓骨取出，用培养基冲洗骨髓腔，将
细胞悬浮液通过滤网筛选，得到单个的骨髓细胞。

3. 培养和分化。

将分离得到的骨髓细胞接种在培养皿中，培养基中含有巨噬细胞分化因子如M-CSF（巨噬细胞集落刺激因子）。

细胞培养在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中，每隔2-3天更换一次培养基，培养7-10天左右，即可得到成熟的BMDMS。

4. 细胞纯化。

有时为了得到更纯净的BMDMS，可以利用差速贴壁法（adherence method）或密度梯度离心分离等技术进行细胞纯化。

总之，BMDMS的培养方法是一个复杂而精细的过程，需要严格控制培养条件和培养基的配方，以确保得到高质量的巨噬细胞。

同时，培养过程中的细胞分化、纯化等步骤也需要根据具体实验的要求进行调整和优化。

希望以上信息能够对你有所帮助。

分离巨噬细胞的方法

分离巨噬细胞的方法巨噬细胞是免疫系统中重要的成分之一，其功能是吞噬和消化细菌、病毒、细胞残骸等病原体或异常细胞。

为了研究巨噬细胞的生理和病理功能，科学家需要从体内或体外分离出巨噬细胞。

下面将介绍几种常用的分离巨噬细胞的方法。

1. 腹腔巨噬细胞分离法这是一种常用的方法，适用于小鼠或大鼠的巨噬细胞分离。

首先，用适当的方法将小鼠或大鼠的腹腔打开，将腹腔洗液抽取出来。

洗液中含有大量的巨噬细胞。

然后，将洗液经过离心，将沉淀中的巨噬细胞收集起来。

最后，用适当的培养基培养巨噬细胞，使其继续生长和分化。

2. 骨髓巨噬细胞分离法这种方法适用于从小鼠或大鼠的骨髓中分离巨噬细胞。

首先，将小鼠或大鼠的骨髓从骨骼中取出，并用适当的方法将骨髓细胞洗涤干净。

然后，将洗液经过离心，将沉淀中的骨髓巨噬细胞收集起来。

最后，用适当的培养基培养骨髓巨噬细胞，使其继续生长和分化。

3. 化学法分离巨噬细胞这种方法利用化学试剂的特定性质，使巨噬细胞与其他细胞分离。

例如，可以利用巨噬细胞表面特定的受体，使用特定的抗体标记巨噬细胞，并通过离心或磁珠分离得到纯净的巨噬细胞。

此外，还可以利用化学试剂的特殊性质，如巨噬细胞对特定染料的亲和性，来分离巨噬细胞。

4. 细胞排序分离巨噬细胞细胞排序是一种高级的细胞分离技术，可以根据细胞的特定性质，如大小、形状、表面标记等，将巨噬细胞从混合细胞中分离出来。

这种方法可以高效地分离出纯净的巨噬细胞群体，但设备和技术要求较高。

总结起来，分离巨噬细胞的方法有腹腔巨噬细胞分离法、骨髓巨噬细胞分离法、化学法和细胞排序法。

这些方法各有优缺点，科学家可以根据实验需求选择适合的方法。

通过分离巨噬细胞，科学家可以更好地研究巨噬细胞的生理和病理功能，为疾病的治疗和预防提供理论基础。

分离巨噬细胞的方法

分离巨噬细胞的方法分离巨噬细胞是研究巨噬细胞功能和特性的重要步骤。

以下是十种常用的巨噬细胞分离方法，并对每种方法进行详细描述。

1. 腹腔巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠。

实验动物首先经过局部消毒，然后腹腔被切开，并用含有PBS和酶的缓冲液灌洗腹腔，酶可包括胰酶或胃蛋白酶。

灌洗液收集并离心，上清液中含有的巨噬细胞可被采集。

2. 骨髓巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠的骨髓。

动物被解剖并骨髓被收集，随后经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最后巨噬细胞被采集。

3. 足垫巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。

小鼠足垫被切下，然后用酶解液处理，最终得到含有巨噬细胞的悬液。

4. 肝巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。

小鼠肝脏被解剖切片，随后用酶解液处理使细胞解离，最后巨噬细胞被离心收集。

5. 肺巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠。

小鼠肺脏被灌洗，利用冰冷的灌洗缓冲液反复灌洗肺组织，然后收集悬液中的巨噬细胞。

6. 脾巨噬细胞分离法：此方法适用于小鼠或大鼠。

动物脾脏被解剖切片，然后用酶解液处理，经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最终得到含有巨噬细胞的悬液。

7. 血液巨噬细胞分离法：此方法适用于人或动物。

血液被抽取并用红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最后巨噬细胞被离心收集。

8. 胎盘巨噬细胞分离法：此方法适用于人或动物。

胎盘被解剖并切碎，随后用酶解液处理，经过红细胞裂解溶液处理去除红细胞，最终得到含有巨噬细胞的悬液。

9. 巨噬细胞树突状细胞混合分离法：此方法适用于人或动物。

细胞混合悬液经过抗体标记和磁珠分离，然后通过磁珠分选系统将巨噬细胞和树突状细胞分离。

10. 巨噬细胞分选细胞器结合法：此方法适用于人或动物。

细胞混合悬液经过抗体标记和细胞器结合分选，利用流式细胞术或显微镜观察巨噬细胞的特定标记，并进行分选。

以上十种方法是常用的分离巨噬细胞的方法，每种方法有其适用范围和特点。

研究人员可以选择合适的方法根据研究需求进行巨噬细胞的分离，以获得纯净的巨噬细胞用于后续的实验和研究。

原代骨髓来源的巨噬细胞BMDM提取与诱导

原代骨髓来源的巨噬细胞BMDM提取与诱导小鼠骨髓来源的巨噬细胞（Bone marrow-derived macrophages, BMDM）。

它最大的优点在于它是原代细胞，其性状和功能更贴近与小鼠机体本身的巨噬细胞，被广大研究人员充分肯定并接受。

其次每次试验先用现提，避免了实验室祖传细胞株培养变异的情况，试验结果稳定可靠。

实验所需的动物、试剂和相关器械实验动物：6-8周龄C57BL/J小鼠试剂：M-CSF（商品化的诱导因子）或L929细胞系、含10%FBS DMEM 高糖培养基、75%乙醇、无菌PBS（含双抗1%）。

实验器械：5mL注射器、剪刀、镊子、70μm细胞滤器、50ml离心管、T25细胞培养瓶或细胞培养板。

实验的具体流程1. 细胞因子M-CSF的获取M-CSF是一种诱导骨髓细胞向巨噬细胞分化的细胞因子，获取的途径有两种：1）找商业化的细胞因子产品直接购买，M-CSF的使用浓度在20-50ng/mL，不同品牌有所区别。

2）自己培养能够分泌这种细胞因子的细胞——L929细胞。

L929细胞种植在直径150mm的大皿中，第二天弃掉旧的培养基，PBS清洗3次后更换为新的培养基，放置在培养箱培养5-7天后收集培养基，将培养基1200rpm/min离心5min，取上清分装保存于-20℃待用，诱导骨髓巨噬细胞分化的培养基为含有15% L929培养基的DMEM高糖培养基。

2. 骨髓巨噬细胞的分离1）小鼠取腿骨小鼠脱臼处死，将小鼠放置在盛有足量75%乙醇的烧杯中浸泡消毒5min，移入小鼠至超净台，固定在白色泡沫板，用剪刀沿着小鼠大腿根部大转子将后肢剪下来，粗略去掉肌肉组织后放置在含有1%双抗的PBS培养皿内，再次移动到新无菌PBS精细剥离肌肉。

2）BMDM细胞提取和诱导将剥离好的股骨、胫骨分开，并用剪刀分别将股骨、胫骨两端剪断，使用5mL注射器吸取冷的诱导培养基将骨髓从股骨、胫骨中吹出，反复吹洗3次，直至腿骨内看不到明显的红色为止。

小鼠原代巨噬细胞提取

小鼠原代巨噬细胞是一种重要的免疫细胞，它们在体内发挥着重要的免疫调节作用。

在提取小鼠原代巨噬细胞的过程中，需要遵循一定的步骤和注意事项，以确保细胞的完整性和活性。

材料准备：1. 小鼠整体麻醉；2. 培养皿、培养瓶等细胞培养用具；3. 胰酶、EDTA等细胞消化试剂；4. 抗生素、血清等细胞培养基添加剂；5. 记号笔、显微镜等工具。

提取步骤：1. 小鼠整体麻醉后，打开胸腔，暴露出肺组织，剪取一定量的肺组织，放入无菌的培养瓶中；2. 向培养瓶中加入适量细胞培养基，清洗肺组织中的血液和杂质；3. 使用胰酶将肺组织中的巨噬细胞消化并转移到另一个容器中；4. 向容器中加入含有EDTA的细胞培养基，以终止胰酶的作用；5. 使用细胞刮器将细胞刮成单细胞悬液；6. 将细胞悬液转移到另一个无菌的培养瓶中，加入适量细胞培养基进行培养；7. 在培养过程中，需要定期更换培养液，并观察细胞的生长情况。

注意事项：1. 整个操作过程需要在无菌的环境中进行，以避免污染；2. 在消化和转移细胞时，要确保细胞的完整性，避免细胞损伤；3. 使用的试剂和工具需要严格消毒，避免交叉污染；4. 在观察细胞生长情况时，需要使用显微镜进行观察，并做好记录。

提取成功标志：当小鼠原代巨噬细胞成功培养后，可以看到细胞贴壁生长，并且呈现出典型的单核细胞形态，如圆形的多突起状。

同时，可以通过观察细胞密度、生长速度和活性等指标来判断提取是否成功。

如果细胞生长良好，密度适中，生长速度快，活性高，则说明提取成功。

总之，小鼠原代巨噬细胞的提取需要一定的技术和经验，但只要严格按照步骤操作，并注意细节问题，就可以成功提取出高质量的细胞。

这些细胞在免疫学研究、药物筛选等方面具有非常重要的应用价值。

小鼠骨髓巨噬细胞提取步骤条件

小鼠骨髓巨噬细胞提取步骤条件提到小鼠骨髓巨噬细胞提取，听起来是不是有点高大上？其实没那么复杂，今天咱们就来聊聊这个有趣的过程，让你在实验室里也能当个“高手”。

准备好了吗？咱们一起探讨这段神奇的旅程吧！1. 准备工作在我们正式开始之前，得先做好准备工作。

说到准备，这可不是随便说说。

首先，咱们得确保实验室干净整洁，像个新婚的小屋一样。

再来，准备一些必备的器材，像是无菌的培养皿、移液器、离心管等等。

为了不让自己搞得一团糟，记得提前检查一遍，保证每样东西都在你手边，等着派上用场。

1.1 选小鼠小鼠的选择可是一门学问，嘿嘿！一般来说，咱们选择6到8周大的小鼠比较好，这时候的小家伙正是“青春期”，骨髓里的细胞活力满满。

注意啦，选择健康的小鼠可比挑选水果还重要，生病的小鼠提取出来的细胞就像旧电池，毫无用处。

顺便提一句，实验之前得做好伦理审查，咱们得对小生命有个底线，对吧？1.2 麻醉和取样小鼠准备好后，我们就得给它们麻醉了。

说到麻醉，那可得慎重，不要用家里的香水哦，咱们得用合适的麻醉剂。

然后，用小手术刀轻轻一划，咱们就能看到骨髓啦！其实，取样的过程还是蛮刺激的，就像打游戏一样，手要稳，心要静，别一紧张把鼠标摔了。

2. 骨髓细胞提取好了，接下来就是重头戏了！小鼠的骨髓提取出来后，咱们得进行离心处理。

这个过程听起来复杂，其实就像打蛋一样。

把骨髓放到离心管里，然后送进离心机，调好转速和时间，咔嚓一声就可以开始了。

这时候，可以泡杯茶，放松一下，等着看成果。

2.1 细胞分离离心完成后，细胞会分层。

顶部的液体是我们不需要的，下面的细胞沉淀就是咱们的目标。

小心翼翼地吸取上面的液体，留住底部的细胞，这就像分开面粉和糖，讲究技巧哦！吸取完毕后，加入培养基，让这些细胞在温暖的“家”里好好待着。

2.2 培养细胞现在，细胞进入培养阶段。

要想让它们长得好，咱们可得提供个舒适的环境。

这包括恒温、恒湿，光照条件也要控制好。

别忘了定期更换培养基，就像给植物浇水一样，细胞也需要“吃饭”。

bmdm提取步骤

bmdm提取步骤
BMDM（Bone Marrow-Derived Macrophages，骨髓来源巨噬细胞）提取步骤如下：
准备小鼠：选用8~10周龄雄性C57BL/6小鼠，脱颈处死后，剔除腿部肌肉及骨盆和股骨的剩余软组织，剪开腿骨两端。

收集骨髓细胞：将小鼠的胫骨和股骨放入含有预热至37℃的DMEM培养基（含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素）的离心管中，用培养基冲洗骨髓腔，收集混合液。

分离细胞：将收集的混合液进行离心，收集骨髓细胞。

培养细胞：将收集的骨髓细胞接种于含10%胎牛血清、10% L929细胞上清的RPMI 1640培养基中，置于5% CO2、37℃的培养箱中培养。

每隔一天换液，培养7天后，用刮板收集成熟的BMDM。

以上步骤完成后，即可得到骨髓来源的巨噬细胞（BMDM）。

这些细胞可用于后续的实验，如Western blotting检测细胞上清液中Caspase-1 p20及细胞裂解液中Caspase-1 p45蛋白表达等。

请注意，实验过程中应在无菌环境下进行，以确保细胞的健康和实验的准确性。

此外，实验过程中涉及的所有试剂和器具都应经过消毒处理，以防止微生物污染。

以上信息仅供参考，如需了解更多有关BMDM提取步骤的信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。

巨噬细胞分离方法[汇总]

一、从小鼠、豚鼠或家兔腹腔中分离巨噬细胞1．取6周左右的小鼠（或600克左右的豚鼠，或3公斤左右的家兔），剃去腹部的毛并消毒。

腹腔注射1ml（豚鼠20ml，家兔200ml）无菌的液体石蜡或巯基乙酸肉汤或4％淀粉肉汤。

3～4天以后收集腹腔细胞。

2．如要收集腹腔静置巨噬细胞，不注射刺激物，直接从这一步开始。

放血处死动物，以减少腹腔中的红细胞。

消毒腹部，沿腹中线注入3～4ml（豚鼠20～40ml，家兔50～70ml）冰中预冷的无菌PBS-H（含10U/ml肝素和10％小牛血清的PBS）。

轻轻按摩腹部5分钟。

3．以下均无菌操作。

剪开腹壁，用吸管吸出渗出液，再用同样容量的预冷PBS-H冲洗腹腔2～3次。

合并渗出液于离心管中，4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

4．用预冷的RPMI-1640培养液洗涤细胞3次，每次4℃离心250×g 10分钟，去上清液。

用预冷的适量RPMI-1640培养液悬浮细胞，台盼蓝染色计数细胞并决定细胞活力。

二、家兔肺泡巨噬细胞的分离和纯化1．取2～3公斤重的家兔，耳缘静脉注射10ml空气处死动物或注射2ml（含130mg）戊巴比妥麻醉动物。

仰卧固定，消毒胸部，剪开胸壁。

以下过程注意无菌操作。

小心从环状软骨下方剪下气管，分离心脏和血管，取出肺，剪去脂肪和结缔组织。

用无菌纱布小心擦净肺表面，称重。

2．分离肺泡巨噬细胞：用夹子夹住气管，使肺悬空。

向气管中注射40ml无菌的冷生理盐水，让生理盐水进入全部肺泡。

用镊子提起气管，从夹子下面剪断气管，将肺中的液体倒入离心管中。

再用同样方法，用40ml无菌冷生理盐水冲洗肺泡，合并浸出液，置4℃。

3．分离肺组织中的巨噬细胞：取出肺泡巨噬细胞后，剪去气管，将肺组织放在有冷RPMI-1640培养液的平皿中。

平皿置冰上，用吸满冷RPMI-1640培养液的20ml注射器接23号针头，一边灌注一边用针头梳离肺组织，直到肺组织与支气管树全部分离。

小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析

小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析王通;郭嘉慧;陈智鹏;银兴峰;马文心;崔毅峙【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2012(28)6【摘要】目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象.然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题.因此,本研究以SILAC(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM.方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率.结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965.以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个.其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出.统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求.结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段.%Aim Mouse bone marrow-derived macrophages (BMM) are recognized as standard model cells of macrophages, thus serving as a key tool and objective cell type in pharmacology. Due to limited proliferation capacity of macrophages, meta-bolically labeling BMM remains as a challenge in macrophage biological investigations. Therefore, the focus of this study was to label BMM with stable isotope labeling with amino acids in cellculture (SILAC). Methods Methods include: mouse bone marrow isolation, 6-day differentiation with M-CSF to prepare BMM; meanwhile, to use SILAC to label global proteins, followed by cell lysis, SDS-PAGE separation, in-gel digestion, mass spectrometry and bioinformatics. Results On Day 6 post-differentiation, 96. 5% of total mouse bone marrow cells wereobserved to become mature BMM. 70 ku band in SDS-PAGE separation was adopted to test the labeling efficiencies. The number of heavy lysine labeled proteins were 18, 12 and 13 for the time points of Day 6, 8 10 post-differentiation. Eight proteins were repeatedly identified in all time points. Statistically, the labeling efficiencies of the three time points were (90. 62 ± 0. 03)% , (90. 23 ±0. 03)% and (90. 40 ± 0. 02)% , respectively. Conclusion These results ensure the feasibility of employing SILAC-based proteomics in macrophage-relevant pharmacological investigations.【总页数】4页(P881-884)【作者】王通;郭嘉慧;陈智鹏;银兴峰;马文心;崔毅峙【作者单位】暨南大学生命与健康工程研究院,广东,广州,510632;暨南大学生命与健康工程研究院,广东,广州,510632;暨南大学生命与健康工程研究院,广东,广州,510632;暨南大学生命与健康工程研究院,广东,广州,510632;暨南大学生命与健康工程研究院,广东,广州,510632;暨南大学生命与健康工程研究院,广东,广州,510632【正文语种】中文【中图分类】R-332;R329.24;R341;R394.2;R977.6【相关文献】1.小鼠骨髓来源巨噬细胞内多肽的分离鉴定 [J], 李阜烁;汪超;林文珍;范梦珠;Yacine Hemar;洪志骏;陈平;张少辉2.牙龈卟啉单胞菌对db/db小鼠骨髓来源巨噬细胞极化作用的初步探究 [J], 杨亚楠; 于时卉; 闫香珍; 罗礼君3.棕榈酸诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞M1型极化 [J], 张焱皓;刘芊伊;冯继红;李茂;刘利萍;秦欢;罗军敏4.巨噬细胞来源的TGF-β对小鼠骨髓成纤维细胞增殖及Ⅰ型胶原表达的影响 [J], 王胜;陈永平;吕敬龙;李颖;刘林5.磨损颗粒刺激下小鼠骨髓来源巨噬细胞调控白细胞介素-34表达的实验研究 [J], 刘子歌;今出真司;张晨;宋国瑞;陈德胜因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。