FISH技术在血液疾病诊断中的应用PPT课件
FISH实验ppt课件
生物多样性等研究领域被广泛采用。近几年, 应用FISH 技术
研究自然环境微生物群落的报道较多, 如海水沉积物的群落, 海水、河水和高山湖雪水的浮游菌体、土壤和根系表面的寄 居群落等。
食品检测方面：传统的食品微生物检测大多采用培养 分离的方法，食品中菌落总数测定采用平板计数法获得结 果需要1-2 d，致病位杂交应用最成功的是基因定位。基因定位研 究是构建基因图谱的基本要素, 基因位置的确定有助于了 解基因的功能, 利用FISH 技术, 可以直接确定某一DNA 序
列在染色体上的位置。
二、FISH实验及图例展示
• 1、样本的准备与处理
• 2、实验操作及注意事项
• 3、实验结果的检测 • 4、实验图例的展示
间有互补的碱基序列，在已有的放射性原位杂交技
术的基础上发展起来的一种非放射性DNA分子原位
杂交技术。它利用荧光标记的核酸片段为探针与组
织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合 成专一的核酸杂交分子，通过荧光检测系统将待测 核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。
2、FISH的发展
• 1969年Gall和Pardue利用放射性同位素标记的 DNA探针检测细胞制片上非洲爪蟾细胞核内的rDNA获 得成功。
现今越来越多的学者趋向于FISH与IF的结合实验，通 俗一点讲，就是在同一个样本上既进行FISH实验，又同时
进行IF实验检测。这方面实验一般适用于检测一个目的基
因以及该目的基因所相对应的蛋白，我们公司在这方面实 验上条件已非常成熟。另外公司也提供其他方面的实验服 务，有Southern blot 、Northern blot、CHIP、COIP， QPCR等等；蛋白类实验有IHC、IF、WB等。
FISH检测在血液肿瘤中的应用-临床宣讲
指导临床用药（个体化治疗）
各细胞遗传学亚组MM患者生存期(n=351)
24.7
42.3
50.5
Fonseca R. Blood 2003;101:4569-4575.
各细胞遗传学亚组MM患者生存期（n=159）
Fonseca R. Leukemia 2006;20,2034-2040.
（二）白血病FISH产品
样本DNA变性
FISH技术的特点
操作简便，探针标记后稳定，利于回顾性分析； 方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测； 标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或未分
化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测。
FISH探针标记类型
telomere subtelomere
着色探针 着丝粒探针
111 32 79
114
133
Dö hner H, Engl J Med. 2000;43:1910-1916.
▶ 慢性粒细胞白血病（CML）
慢性粒细胞白血病（CML）检测BCR/ABL融合基因、ASS基因。
推荐样本：骨髓
适用人群： CML初诊及治疗监测的患者
BCR/ABL融合基因检测试剂盒
•探针：GLP BCR/GLP ABL
评估预后
CBFB基因断裂重组的AML患者对化疗敏感、预后较好。
▶ 急性淋巴细胞白血病(ALL)
• ALL主要是儿童疾病，75%发生在6岁以下的儿童。 • 我国l5岁以下小儿白血病的发病率为2.73/10万，ALL是儿 童中发病率最高的恶性肿瘤。
DF探针 只可检测是否有BCR/ABL融合基因，不能区分主、次 断裂点，可用于治疗效果监测及用药指导。
BCR/ABL融合基因检测意义
FISH技术在白血病中的应用~
FISH技术在白血病中的应用目前荧光原位杂交技术已被广泛用于遗传性疾病、肿瘤研究及临床诊断和治疗监测。
在临床应用中，荧光原位杂交技术凭借其较高的灵敏度和特异度，已在产前诊断、实体瘤（乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌）以及血液系统肿瘤的诊断和治疗检测中得到了迅速的发展。
血液系统肿瘤是我国十大高发肿瘤之一，随着对疾病发病机制的深入研究，发现细胞遗传学对肿瘤分型、诊断、治疗和预测预后都具有重要的意义。
但常规的细胞遗传学分析（CC）方法只能分析中期染色体，而对间期细胞、复杂核型细胞和染色体微缺失无法进行诊断。
而FISH技术弥补了CC在这方面的不足，因此被广泛用于血液肿瘤的研究、诊断等方面。
在临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在以下几个方面：①染色体异位形成的融合基因检测如慢性粒细胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）的BCR-ABL融合基因检测，急性粒细胞白血病（acute myelocytic leukemia，AML）M3中的PML-RARA融合基因检测和M2b中的AML1-ETO融合基因检测。
对融合基因的检测不但有助于对疾病的诊断，还能帮助我们估计患者预后情况以及选择有效的治疗方案。
②基因缺失的检测一些关键基因的缺失有助于我们对肿瘤进行诊断以及预后判断。
但是目前的染色体显带技术分辨率低，只有大于4.5 Mb的缺失才能检测到，而FISH分辨率高，可以弥补染色体显带技术用于检测微小缺失的不足。
在临床应用中，如通过荧光原位杂交发现慢性淋巴细胞性白血病患者的P53基因缺失提示患者的预后很差，疾病进展较早，且对联合化疗不敏感，多数生存期仅为3个月。
而同样在慢性淋巴细胞性白血病患者中，如检测到13q单一缺失则提示患者预后较好，中位生存期可达到133个月。
③对异性间造血干细胞移植的植入状态监测目前异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem celtransplantation，allo-HSCT)是治疗血液系统恶性和非恶性疾病的有效手段。
FISH检测在淋巴瘤、骨髓瘤个体化治疗中的应用 PPT
高危因素（25%） 中位生存期＜2年
FISH Del 17p FISH t(4;14) FISH t(14;16) Del 13 11q异常，+1q, -1p
标危因素（75%） 中位生存期＞2年
FISH t(11;14) FISH t(6;14)
Mayo Clin Proc. March 2007;82(3):323-341
FISH检测在淋巴瘤、骨髓瘤个体化治疗中的应用 PPT
内容
1
个体化治疗与FISH检测
2 FISH检测与淋巴瘤/骨髓瘤诊断、治疗、预后
淋巴瘤，骨髓瘤实验室诊断
MICM
➢ FAB形态学诊断（Morphology) ➢ 免疫学检查(Immunology) ➢ 细胞遗传学检查(Cytogenetics) ➢ 分子遗传学检查(Molecular)
ALK可以作为ALCLБайду номын сангаас疗靶点
Carlo Gambacorti-Passerini, et al. NEJM,2011,364,8:775~776
多发性骨髓瘤的诊断
临床表现 骨髓克隆性 骨髓浆细胞
血/尿中M 蛋白与影像 学
细胞遗传学/ 细胞免疫学/ 分子生物学
多发性骨髓瘤（MM）NCCN指南
在初始诊断的时候要采用FISH检测 del13, del 17p13, t(4;14),t(11;14), t(14;16); 1q21扩增
符合移植条件的MM患者治疗方案
不符合移植条件的MM患者治疗方案
THANK YOU!
不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同 优点
适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本； 适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。
FISH技术在血液疾病诊断中的应用ppt课件
1980-1990
CGH技术
1956 确定 染色 体 46 条
1958 应用 于血 液学
多种血 液病相 关异常 核型被 发现
多色 FISH
微阵列技术 aCGH、aSNP
非显带时期
显带时期
编辑版ppt
分子遗传 3
FISH技术的发展
1990年 FISH
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33
结果及报告
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34
编辑版ppt
35
临床应用
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36
FISH临床应用
➢检测染色体数目与结构异常 ➢疗效分析 ➢鉴定标记染色体 ➢检测早期复发 ➢鉴定移植后早期复发 ➢鉴定肿瘤细胞的细胞系列 ➢基因定位、病灶组织定位
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37
FISH常用探针的组合应用
探针种类
•双人，每人于不同区域各计数200个细胞
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28
计数规范
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29
信号判读误差
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30
分离信号误判
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31
石蜡切片误差
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32
建立阈值
➢ 选取正常样本10-20份建立针对探针的假阳性率 ➢ 统计方法
•x+3SD •β 分布（95%可信区间） ➢ 结合临床逐步建立生物参考区间
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43
探针种类
检测目的
伴嗜酸细胞增多的髓系或淋系肿瘤、MDS、MPN
FGFR1/D8Z2(8p11) (分离探针) PDGFRA（4q12） PDGFRB（5q32-q33）
t(8;13) 4q12 t(5;12)
移植排斥检测： CEPX/Y (双位点探针)
FISH技术在血液肿瘤中的应用
血因 子 稀 释 性 减 少 ， 使 凝 血 障 碍 进 一 步 加 重 。 有 文 献 报
道 “ ｊ ： 联合输注机采 血小 板和冷 沉淀 或单独 输注 冷沉 淀 ， 均
［ ６ ］ 颜颂旭 ， 王明珠 ， 林益 和 ， 等． 冷 沉 淀 制 剂 在 肿 瘤 患 者 放 疗
能 明 显 改 善 患 者 的 凝 血 指 标 。孕 产 妇 妊 娠 合 并 高 血 压 、 心 脏
４ 小 结
［ ７ ］ 饶 月丽 ， 张伟强． 冷 沉 淀 在 出 血 及 感 染 患 者 中应 用 的 探 讨
［ Ｊ ］ ． 临床 血 液 学杂 志 ， ２ ０ ０ ７ ， ４ （ １ ） ： １ ２ － １ ３ ． ［ ８ ］ 王东伟 ， 陈萍， 陈磊． Ｆ ｎ软 膏 治 疗 宫 颈 糜 烂 的 临 床 应 用 ［ Ｊ ］ ． 黑龙 江 医 药科 学 ， ２ ０ ０ ６ ， ２ ９ （ ２ ） ： １ ０ ９ — １ １ ０ ． ［ ９ ］ 朱琼 媛 ， 杨孝顺 ， 朱 妹媛． 冰 冻 单 采 血 小 板 与 冷 沉 淀 联 合 输 注 治疗 产 后 大 出 血 Ｅ Ｊ ］ ． 临 床血液学 杂志 ， ２ ０ ０ ８ ， ２ １ （ ６ ） ：
病、 糖 尿 病 在 生 产 时 可 并 发 ＤＩ Ｃ， 胎 盘 早 剥 以及 前 置 胎 盘 引 起
后 口腔 溃 疡 治 疗 中 的 应 用 ［ Ｊ ］ ． 中国输 血 杂 志， ２ ０ ０ ８ ， ２ １
（ ６）： ４４ ７ — ４ ４８ ．
的产前和产后出血可诱发 Ｄ Ｉ Ｃ， 羊 水 栓 塞 在分 娩 时 可 引 起 母 体
的冷沉淀可提高创面局部浓度 ， 利 于上 皮 扩 展 ， 加速创面愈合 。 而临床研究表 明 ， 局 部使 用 Ｆ ｎ制 剂 效 果 优 于 使 用 妇 炎 栓 治
荧光原位杂交检测ppt课件
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❖辅助血液疾病的诊断，判断预后，疗效检测及 微小残留检测
❖ 应用：
❖骨髓移植术后（性别不同的移植献者）、 性别鉴定 、CMPD和ALL初诊、CML末次化 疗结束两周 以上、AML-M3/M2等疾病
❖ 技术特点
❖ 可分析间期细胞，不需培养；操作简单、检测快速 重复性好、空间定位精确；灵敏性和特异性高
❖ 禁忌：冰冻或凝块
注意：建议做FISH的同时做常规细胞遗传学分析。若 只要求做FISH，请转交一份近期的细胞遗传学报告 。如果无细胞形态学或遗传学的检查，建议作进一 步检查！！
❖ 报告时间：周一至周五，7个工作日
❖ 报告示例：略
❖ 结果判读：每个探针检测镜下分析200个细胞核。 20例没有造血系统疾病且核型正常的骨髓标本作为 正常对照，以此计算分裂信号的平均数和标准差。 如果有异常杂交信号的细胞百分比超过正常标准差 的3倍，结果将被认为异常。
荧光原位杂交（FISH）检测
概述
FISH-目前新兴的分子遗传学技术，原理是采用
荧光标记的DNA探针，利用探针与检测样本中 DNA碱基对的互补性，在探针与标本的DNA杂交 后，通过荧光显微镜检测荧光信号而得出结果，从 而检测细胞、组织样本中的染色体和体和基因的异常
❖ 当染色体核型分析不成功或不明确时，可利用FISH 检测弥补不足，并可发现复杂易位
❖ 探针种类
❖双色单融合探针 双色分离探针
❖ ES探针
双色双融合探针
每类探针的检测和适用范围不同，决定其用处不同
❖ 标本要求
❖ 送检标本：骨髓3ml（CML和CLL患者可直接用外 周血2ml）
❖ 保存条件：肝素钠抗凝，4摄氏度，24h送检
荧光原位杂交技术(FISH)技术在疾病分型诊断中的应用
荧光原位杂交技术（FISH）技术在疾病分型诊断中的应用生命科学的发展，生物技术的进步使我们对疾病本质的认识不断地深入，也使我们拥有更多新的治疗方法和药物应对疾病的威胁。
如何准确有效地利用这些新的治疗方法和药物治愈疾病是我们迫切需要研究的内容。
如何对疾病进行正确的分型和诊断却是上述工作的基础。
只有全面地把握病情，并在此基础上进行准确的判断和分析，才能为病患制定及时有效的治疗方案。
因此我们要求疾病的诊断工作能提供更为准确和及时的结果。
而古老的“望、闻、问、切”和传统的常规手段已远远无法满足我们对疾病诊断的要求，迫切需要将新的技术引入疾病诊断领域。
荧光原位杂交技术(Florescence In-Situ Hybridization简称FISH)是一种利用非放射性的荧光信号对原位杂交样本进行检测的技术。
它将荧光信号的高灵敏度、安全性，荧光信号的直观性和原位杂交的高准确性结合起来，通过荧光标记的DNA探针与待测样本的DNA进行原位杂交，在荧光显微镜下对荧光信号进行辨别和计数，从而对染色体或基因异常的细胞、组织样本进行检测和诊断，为各种基因相关疾病的分型、预前和预后提供准确的依据。
自20世纪80年代末，Pinkel和Heiles将FISH技术引入染色体检测领域后，FISH技术就在临床诊断及科研工作中得到了广泛的运用，显示出与一些传统技术相比的明显优势。
与传统的免疫组织化学法（IHC）相比，FISH具有良好的稳定性和可重复性。
目前免疫组织化学法正广泛应用于肿瘤等多个领域的临床诊断。
免疫组化的检测对象是疾病相关的蛋白。
由于蛋白的表达和本身的构象受各种因素的影响很大（例如酸、碱和变性剂），检测条件的稳定性对检测结果至关重要。
此外，免疫组化检测结果的判断依赖于检测者对显色结果的主观判断，对于一些弱阳性的结果，不同的检测者容易产生分歧。
上述的因素都可能影响医生对病情的最终诊断。
荧光原位杂交技术检测的对象是细胞中的DNA，致密的双螺旋结构使DNA 可以历经千百万年而依然保持良好，其结构稳定，不易被环境条件影响，为荧光原位杂交技术的稳定提供了良好的基础。
FISH在血液病诊断中的新应用.
自20世纪80年代,FISH(荧光原位杂交技术一经出现,便成为众多科学家,尤其是细胞遗传学家们关注的焦点。
所谓的FISH(荧光原位杂交,它是利用已知核酸序列作为探针并直接以荧光素标记或先以生物素或地高辛等半抗原标记后再与靶DNA进行杂交,然后通过免疫细胞化学过程连接上荧光素标记物,最后在荧光显微镜下观察杂交信号,从而对标本中待测核酸进行定性、定位和定量分析的技术。
由于利用FISH技术,可在显微镜下直接观察到基因组的异常状况,因而大大地提高了染色体分析的敏感性、准确性和可靠性;随着探针的设计与制作技术的发展,再加上荧光标记手段的强化,使得FISH技术渐渐受到临床学者们的关注,越来越多临床学者们利用FISH(荧光原位杂交技术进行临床诊断或作为辅助诊断的手段。
在我国,最早引入FISH技术进行临床检验的方法的是进行白血病分析的血液学家们,他们通过利用文献上已知的各种与血液疾病相关的基因作为检测的目标,通过这类基因或特殊区段在细胞染色体上的不同表现,从而分析、判断患者的患病情况与病因,并以此作为辅助决定后续治疗方案或监控患者预后情况的依据。
由于FISH在临床诊断的应用,是基于一些已知与疾病确切关联的基因序列设计探针进行检测的,过去,由于对疾病的生理现象与基因组的异常情况的了解不足,使得以FISH为基础开展的诊断项目只能局限于一些为人所熟知的易变基因的检测中,如最常见的BCR/ ABL 两对基因易位检测常被用于作为CML白血病分型判别标准之一(见图1,随着学者们对各种临床疾症起因的研究的渐渐深入,科学家们发现,越来越多的疾病与基因组水平的变异相关,此外,由于学者们对FISH 技术的了解与普及,现时,很多临床学家们除了沿用FISH在血液病诊断中的新应用图1. Vysis血液病四种特殊探针类型Dual Color, Single Fusion,双色单融合探针用于检测细胞内发生的高百分比的特异性染色体易位,DNA杂交靶位点位于两个遗传断裂点之间。
荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
需要的主要设备
荧光显微镜 在荧光显微镜下，DNA探针上
的荧光基团在一定波长的激发光激发后会发 出一定颜色的光线。射入光激发荧光分子， 荧光分子随后发出光子，发出的光子具有较 长的波长 – 较低的能量荧光标记的探针与其 靶标结合后 – 将能检测到荧光信号
水浴箱2台、热台1个，恒温箱1台。（或 者只需1台FISH杂交仪）。
将滴好的片子放在2×SSC中，37 ℃ 1小时老化。
将玻片放到新鲜配置的胃蛋白酶溶液37 ℃杂交预处理 13 mins 。
PBS洗，后固定液固定10分钟，PBS洗，晾干后70%的酒精1 min，85%的酒精1 min，100%的酒精1 min 酒精梯度脱水 。
实验程序3 变性杂交
玻片变性，73±1 ℃ 5mins 。关键步骤！！ 20 ℃ 冷冻的70%的酒精1 min85%的酒精1 min100% 的酒精1 min 酒精梯度脱水 。在45-50 ℃热台上使 玻片完全干燥 。---保持DNA单链状态。
二、细胞间期和分裂中期相中的染色体计数
识别和确定染色体易位
单个位点或基因的缺失/扩增
中期分裂相染色体涂片识别某染色体
FISH技术优点
标本多样性：细胞涂片（绒毛、精子、卵裂
球PGD等） 脱落细胞收集制片（羊水等）。
客观判断 高灵敏性 高特异性 定量分析、重复性好 在同一标本中同时评价多个基因的改变 DNA的稳定性
荧光原位杂交(FISH)技术.ppt
CEP 18 CEP X CEP Y
LSI 21 LSI 13
产前诊断异常核型
羊水标本，未培养，XY, +18。
CEP 18 CEP X CEP Y
LSI 21 LSI 13
24色染色体涂染
比较基因组杂交(Comparative genomic hybridiation,CGH)
比较基因 组杂交 (CGH)
实验程序5 显微镜下观察
选择杂交最好的区域来观察结果 1. 用25X 的物镜扫描整个杂交区域 2. 选择分散较好的区域间期细胞重叠较少或
者分裂相较多的区域观察 3. 用40X 或者 100X物镜 开始从左到右从上到
下计数分析. 4. 计数50个细胞核。 5. 当出现10 – 60% 的嵌和体时，需要计数200
FISH杂交仪
荧光显微镜
光源
滤光片： 一定波长 的光能通 过，其余 波长的光 滤掉，保 证只有需 要的荧光 被激发。
实验程序
样品染色体DNA变性 探针变性 杂交过夜 洗涤复染 显微观察
实验程序1 样本 收集
__AneuVysion kit主要用于培养后的以及未经培养的羊水 __样本必须按照ACT手册的推荐的方法收集 __样本收集必须要保证最小程度的母体细胞污染 __羊水最小需要量为2-5ml,这个依赖与孕周龄 __从收集羊水细胞到培养之间的间隔尽量要短（最晚
__ 第二天丢弃洗液
3. 去处rubber cement以及盖玻片 4. 将第一张玻片放到0.4X SSC/ 0.3% NP-40，73±1oC，轻轻
摇动玻片3 secs. 重复剩下3张玻片，洗2 mins
__ 不要同时将4张玻片放入conplin缸中 __ 保证玻片在洗液的时间不要超过2mins
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FISH技术的特点
• 操作简便，稳定，人员培训较快 • 方法敏感，特异性好，检测效率高，能迅速得到 结果，24小时就可以完成检测 • 标本来源丰富，细胞不需培养，间期细胞，分裂 中期细胞、分化或未分化细胞及死亡或存活的细 胞皆可以被检测 • 可与多种技术结合（细胞形态学、免疫学、流式 细胞术），可回顾性分析,可确定恶性细胞的克隆 起源或鉴别良恶性细胞
nuc ish(MLL×2)[400]
nuc ish(MLL×2)(5’MLL sep 3’MLL×1)[100/200]
nuc ish(CEPX×2)[2]//(CEPX,CEPY)×1[398]
ABL BCR
ABL BCR
A
B
A: nuc ish(ABL,BCR)×2 B: nuc ish(ABL ×2,BCR ×3)
A
B
C
EGR1
A: nuc ish(D5S23/D5S721×1,EGR1×1) B: nuc ish(D5S23/D5S721×2,EGR1×1) C: nuc ish(D5S23/D5S721×3,EGR1×1)
质量控制
质量管理内容
商品探针、自配试剂验证 标准化流程及规范化操作（前处理、实验操作） 规范判读标准 建立本实验室判读阈值 建立临床生物参考区间
10-100kb
1-10 kb 2-10 Mb 2-10 Mb
FISH探针种类
着丝粒探针
位点探针
涂染探针
双色单融合探针
额外信号探针
双色双融合探针
正 常
异 常
双色分离探针
数量、位点探针
人类细胞遗传学命名
nuc ish(CEP8×2)[400] nuc ish(BCR,ABL)×2[400] nuc ish(BCR,ABL)×3,(BCR con ABL×2)[380/400]
FISH技术的局限性
异常检测取决于能否获得相应探针 三体检测敏感性高于单体或缺失 骨髓、外周血标本较实体瘤、石蜡切片好处理 不能检测全基因组异常（间期FISH）
FISH主要仪器
FISH分析工作站（荧光显微镜、分析照相软件） 荧光原位杂交仪 恒温水浴槽 高速离心机 培养箱 微量加样器
A
TEL
B
TEL/AML1
TEL
C
A: nuc ish(TEL×2,AML1×3)(TEL con AML1×1) B: nuc ish(TEL×1,AML1×4)(TEL con AML1×1) C: nuc ish(TEL×2,AML1×5)
D5S721 D5S721 EGR1 D5S721
EGR1
（SKY、M-FISH、RX-FISH）
2001年
array CGH
技术原理
Specimen DNA
G C C C G T A A T
T A
F
COVALENT BOND
A T
G
F
FISH Probe DNA
操作步骤
FISH样本的制备（染色体制备、细胞滴片制备） 探针制备（体系：杂交缓冲液、蒸馏水、探针） 探针标记 杂交（76℃变性10min、37℃杂交10h） 洗脱 DAPIⅡ复染 荧光显微镜检测 结果分析
荧光原位杂交（FISH）技术
——血液肿瘤诊疗中的应用
一、技术 二、质控 三、 临床应用 四、多技术结合应用案例
技术理论
细胞遗传学发展简史
1888 提出 染色 体 1914 染 色 体 畸 变 导 致 肿 瘤
1950-1960
196
FISH 中期/间期
CGH技术
1960-1970
1970-1980
1980-1990
1956 确定 染色 体 46 条
1958 应用 于血 液学
多种血 液病相 关异常 核型被 发现
多色 FISH
微阵列技术 aCGH、aSNP
非显带时期
显带时期
分子遗传
FISH技术的发展
1990年 FISH
1992年
CGH
1996年
24色FISH
pH仪
FISH技术比较
FISH 全染色体扫描 平衡易位 不平衡易位 倒位 缺失 扩增 非整倍体 分辨率 SKY M- RX-FISH FISH CGH aCGH
× √ √ √ √ √ √
√ √ √ × × 部分 √
√ 部分 部分 部分 部分 √ √
√ × √ × √ √ ×
3 Mb
√ × √ × √ √ ×
FISH常用探针的组合应用
探针种类 慢性粒细胞白血病（CML）： BCR/ABL (融合探针) BCR/ABL/ASS1 t(9;22) t(9;22)伴ASS1基因缺失 检测目的
计数规范
信号判读误差
分离信号误判
石蜡切片误差
建立阈值
选取正常样本10-20份建立针对探针的假阳性率 统计方法 •x+3SD •β 分布（95%可信区间） 结合临床逐步建立生物参考区间
结果及报告
临床应用
FISH临床应用
检测染色体数目与结构异常 疗效分析 鉴定标记染色体 检测早期复发 鉴定移植后早期复发 鉴定肿瘤细胞的细胞系列 基因定位、病灶组织定位
FISH技术要点
样本浓度、切片厚度、细胞状态 充分低渗与固定 制片环境温度与湿度 探针充分混匀 变性液pH与温度 橡皮泥严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂
规范判读
• 规范正常和异常信号 • 杂交成功率>75% • 计数数量、方法： •单人，分别于不同区域各连续计数200个细胞 •双人，每人于不同区域各计数200个细胞
FISH操作流程
• 样本制备：细胞、骨髓、外周血、组织等 • 制片： • 预处理： • 酶消化： 细胞悬液滴片或石蜡组织切片 2×SSC，固定液，NaSCN 胃蛋白酶，蛋白酶K
• 变性：
• 杂交： • 洗涤： • 复染： • 读片：
温度
互补结合，温度 无附离子溶液，PH，温度 DAPI II 荧光显微镜，滤镜
ABL
BCR
ABL
BCR ABL BCR
A
B
C
A: nuc ish(ABL,BCR)×3(ABL con BCR×2) B: nuc ish(ABL,BCR)×4 (ABL con BCR×3) C: nuc ish(ABL ×3,BCR ×2) (ABL con BCR×1)
AML1
AML1
AML1