干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
一、技术简介
干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。
在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。
二、实验流程
1. 干细胞的分离、原代和传代培养。
2. 定向诱导干细胞分化。
3. 成长曲线测定。
4. 诱导分化后细胞鉴定。
5. 结果统计分析。
胚胎干细胞的体外诱导分化模型
胚胎干细胞的体外诱导分化模型马宗源 李祺福(厦门大学生命科学学院福建厦门361005) 胚胎干细胞是具有全能性及无限制的自我更新与分化能力的一类特殊的细胞群体,它能通过祖细胞为中介,分化为各种类型的体细胞,可重演体内干细胞的分化过程。自80年代从小鼠囊胚的内细胞团分离到胚胎干细胞并建系到现在已建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞、造血细胞等体外分化体系。将胚胎干细胞体外分化成为可利用的分化模型,无论从组织结构、细胞及分子水平都体现了体内分化过程的体外重演,再加上胚胎干细胞系具有体系简单,影响因子少,可控制,便于研究等特点,因此可用于研究早期胚胎发育和细胞分化调控;可成为器官移植和修复器官的细胞来源;还可用于新型药物筛选。 1 胚胎干细胞的生物学特性 胚胎干细胞具有与早期胚胎相似的结构特征,具有较高的核质比和整倍体核型。体外培养的细胞紧密堆积,呈克隆状生长,具有发育分化的多潜能性和无限制的自我更新能力,碱性磷酸酶染色呈阳性,具有高的端粒酶活性,早期胚胎细胞均表达胚胎阶段特异性抗原SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、T RA-1-81、T R A-1-60等;表达种系转录因子OCT-4,并且可将O CT-4基因作为细胞多能性的一个标志;白介素6型细胞因子家族参与维持调节胚胎干细胞未分化状态。 胚胎干细胞建系的过程中要解决的问题在于体外不断增殖的过程中保持未分化的状态,但是细胞如何维持其未分化状态的机理并不清楚。研究发现主要是通过膜上的特异受体蛋白gp130来发挥作用,细胞因子受体蛋白g p130可激活JA N U S、酪氨酸激酶,JA K-ST A T、M EK/M A P K等信号途径,而JAK/ST A T3和M EK/ ERK信号途径则处于相对平衡的状态。另外,一些未知的膜结合分子也参与胚胎干细胞的增殖与分化。分离纯化及鉴定调节细胞的自我更新及分化的未知分子已成为研究的热点。 2 胚胎干细胞为基础的分化模型 胚胎干细胞要维持其未分化的状态,需要在胚胎饲养层中加入分化抑制因子。一旦改变了维持胚胎干细胞未分化状态的条件,胚胎干细胞首先形成胚胎小体,胚胎小体有外中内三胚层,继续分化可形成多种类型的细胞。在体外分化培养时,可自发形成有节律性跳动的心肌细胞,同时还形成骨骼肌、神经细胞、上皮细胞等。由于体外胚胎细胞可重演体内胚胎细胞的发育过程,并且基因的表达时相与体内的胚胎发育过程是相似的,在这一过程中加入外源的诱导分化因子并与相关的调控基因结合,可使胚胎干细胞分化为各种类型的细胞。现在已初步建立了神经细胞、肌肉细胞、上皮细胞和造血细胞等体外分化模型。 2.1 神经细胞 体外培养胚胎干细胞可模拟从未定型细胞向功能性神经元转化的过程,并且其基因的表达时相与体内的胚胎发育过程相似。在分化的早期表达N FL、N F M基因,后期则表达N eur ocan基因。维甲酸及神经生长因子可诱导胚胎干细胞定向分化为神经细胞,是常用的诱导分化物,它能上调神经元特异基因的表达,同时下调中胚层基因的表达。将神经元特异的SOX2基因转进胚胎干细胞,再经维甲酸诱导,可表达90%以上的具有神经元标志的神经细胞。可能是外源基因和维甲酸同时拮抗分化抑制因子的作用,阻碍细胞向其他的方向分化,迫使其向神经元的方向分化。维甲酸能诱导胚胎干细胞分化为C-氨基丁酸能和多巴胺能神经元,而维甲酸分别结合无血清培养基和含胎牛血清的培养基培养胚胎干细胞后发现,采用无血清培养时,几乎检测不到分化的多巴胺能神经元的存在;但在有血清培养时,却能检测到大量的多巴胺神经元。这暗示血清中的某些未知的因子和维甲酸共同起到定向诱导分化 化为特定组织细胞,将这些细胞回输体内,从而达到长期治疗的目的。干细胞的医学应用还包括体外克隆人体器官,然而这比体内移植干细胞要复杂的多。相信随着研究的不断深入,来自人体干细胞的器官应用于临床治疗已为期不远。干细胞研究与应用不仅在疾病治疗方面有着极其诱人的前景,而且将对克隆动物,转基因动物生产,发育生物学,新药物的开发与药效、毒性评估等领域产生极其重要的影响。 参考文献 1 Th omson J A,Itsk ovitz-Eldor J os eph,Shapiro S S,et al. Em bryonic s tem cell lin es d erived from human b las tocysts.S cience,1998,282:1145—1147. 2 Sh amb lott M J,Axelman J,W ang S,et al.Derivation of Plurip otent stem cells from cultured human primordial germ cell.Proc Natl Acad S ci U SA,1998,95:13726—13731. 3 Jack son K A,M i T,Goodell M A.Hematopoietic potential of s tem cells isolated from murie s keletal mus cle.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96:14482— 14486. 4 裴雪涛.干细胞研究现状与展望.高技术通讯,2001, (6):93—95. (BH)
人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定
中国组织工程研究 第19卷 第32期 2015–08–06出版 Chinese Journal of Tissue Engineering Research August 6, 2015 Vol.19, No.32 ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH 5155 www. CRTER .org 肖建红，女，1980年生，四川省绵阳市人，羌族，2012年中山大学毕业，博士，主治医师，主要从事造血干细胞抑制、干细胞与组织工程，以及免疫性血小板减少性紫癜的临床研究和基础研究。 通讯作者：张阳春，硕士，主治医师，中山大学附属第一医院东院下肢骨科，广东省广州市 510700 中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2015)32-05155-07 稿件接受：2015-07-01 https://www.360docs.net/doc/1b12757019.html, Xiao Jian-hong, M.D., Attending physician, Department of Internal Medicine, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Corresponding author: Zhang Yang-chun, Master, Attending physician, Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China Accepted: 2015-07-01 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定 肖建红1，张阳春2，张常然1，杨 兴2(中山大学附属第一医院东院，1普通内科，2下肢骨科，广东省广州市 510700) 文章亮点： 1 实验通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。 2 实验发现第5代脂肪干细胞比较适合进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 3 DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 关键词： 干细胞；脂肪干细胞；人来源的脂肪干细胞；细胞分化；脂肪组织；细胞培养；细胞鉴定；国家自然科学基金 主题词： 干细胞；皮下脂肪；细胞分化；细胞，培养的 基金资助： 国家自然科学基金青年项目(81500091)；广东省自然科学基金博士启动项目(2015A030310022)；广州市黄埔区科技计划项目(201444-02) 摘要 背景：脂肪干细胞是从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的间充质干细胞，在组织工程中比骨髓间充质干细胞具有更多优势，是当今的研究热点之一。 目的：在体外建立一种分离纯化人皮下脂肪来源脂肪干细胞的方法，进行体外培养扩增及诱导其向成骨、成脂细胞分化。 方法：通过密度梯度离心和贴壁筛选法相结合，对人脂肪干细胞进行分离、体外培养及扩增。倒置显微镜下观察人脂肪干细胞的细胞形态和生长特性。选取第2代及第5代细胞，用CCK-8法检测细胞活性，绘制细胞生长曲线，用流式细胞仪检测细胞表面抗原标记。选取第5代细胞，分别进行成脂及成骨诱导分化，以确定其多向分化潜能。 结果与结论：①采用密度梯度离心和贴壁培养相结合方法，可成功从人脂肪组织中获得纯度较高的人脂肪干细胞。②人脂肪干细胞经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，符合正常细胞的生长规律，且其生长具有对数生长期，其倍增时间较短。③人脂肪干细胞表达干细胞表面抗原标记，具有低免疫原性，且具有成脂成骨多向分化潜能。④DAPI 是一种简单、有效的标记人脂肪干细胞的方法，DAPI 不损伤细胞活性，对细胞标记率高。 肖建红，张阳春，张常然，杨兴. 人皮下脂肪干细胞的成骨、成脂分化诱导及鉴定[J].中国组织工程研究，2015，19(32):5155-5161. doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2015.32.013 Human subcutaneous adipose-derived stem cells: osteoblastic/adipogenic differentiation and identification Xiao Jian-hong 1, Zhang Yang-chun 2, Zhang Chang-ran 1, Yang Xing 2 (1Department of Internal Medicine, 2Department of Lower limbs Orthopedics, Eastern Branch of the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 51000, Guangdong Province, China) Abstract BACKGROUND: Adipose-derived stem cells are a kind of mesenchyam stem cells with multipotent differentiation capacity, which have more advantages than bone marrow mesenchymal stem cells in tissue engineering research. OBJECTIVE: To establish a method to isolate and purify adipose-derived stem cells from human subcutaneous adipose tissues followed by in vitro amplification and osteoblastic/adipogenic differentiation. METHODS: Adipose-derived stem cells were isolated from human subcutaneous adipose tissue and cultured by density gradient centrifugation and adherent culture. Cell morphology and growth features were observed under inverted microscope. Adipose-derived stem cells at passages 2 and 5 were selected for viability measurement using cell counting kit-8 method, and then cell growth curves were drawn. The immunophenotype identification was analyzed by flow cytometry. Passage 5 cells underwent osteoblastic/adipogenic induction to confirm the multi-differentiation potential. RESULTS AND CONCLUSION: (1) Using density gradient centrifugation and adherent culture method, high-purity human adipose-derived stem cells can be successfully isolated from human adipose tissues. (2) The growth process of human adipose-derived stem cells includes stagnant phase, logarithmic phase and plateau phase, which meets the growth rhythm of normal cells. Moreover, the population doubling time is shorter. (3).
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项
干细胞诱导分化具体步骤及注意事项 一、技术简介 干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。 在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。 二、实验流程 1. 干细胞的分离、原代和传代培养。 2. 定向诱导干细胞分化。 3. 成长曲线测定。 4. 诱导分化后细胞鉴定。 5. 结果统计分析。
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法
干细胞向成骨细胞诱导分化染色及鉴别方法 碱性磷酸酶（ALP）是成熟成骨细胞的标志性酶之一。1 Gomori钙钴法 【染色原理】ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 （1）将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。（2）PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 （3）入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 （4）2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 （5）1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2 偶氮偶联法： 【孵育液配制】萘酚AS-BI磷酸盐20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液（PH 9.2）50ml 六偶氮副品红0.5ml 1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。 （六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合）【步骤】 （1）细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。 （2）蒸馏水冲洗。 （3）将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。 （4）流水冲洗，晾干。 （5）甘油明胶封固。 【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。 3 碱性磷酸酶染色试剂盒法： 【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。 【作用液配制】取2号储备液10ml，加3号液200ul，再加4号粉剂10mg，振摇速溶，立即过滤到细胞爬片上。 【步骤】 （1）细胞爬片滴加数滴1号液，室温固定一分钟（不可以延长），流水漂洗2分，晾干。 （2）滴加作用液数滴，置湿盒内于37℃孵育2小时，流水冲洗2分钟。 （3）滴加5号液数滴，复染5分钟，流水冲洗2分钟，晾干。 【结果】阳性结果是胞浆内出现蓝色沉淀。 1 茜素红法 【步骤】
胚胎干细胞体外诱导分化综述
胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞
胚胎干细胞的归类
胚胎干细胞的归类 干细胞按分化潜能可分为全能干细胞、多能干细胞和专能干细胞三类，对于胚胎干细胞和造血干细胞各属于哪一类，不同的教材和资料说法不同。新课标人教版必修1教师教学用书P31“胚胎干细胞分裂速度快，并且有产生多种分化细胞类型的潜力，因此，它们也被称为多能干细胞。”选修3教师教学用书P73“全能干细胞是可以发育成一个完整个体的未分化细胞，如受精卵。多能干细胞是指能分化成除胎盘之外所有其它组织细胞的未分化细胞，如ES细胞（胚胎干细胞），他的分化能力仅次于受精卵。专能干细胞是指与特定器官和特定功能相关的一类干细胞，如神经干细胞、造血干细胞等。”从中不难看出，胚胎干细胞和造血干细胞分别属于多能干细胞和专能干细胞。 而苏教版教材上是这样解释的：“专能干细胞只能分化成一种类型或功能密切相关的两种类型的细胞，如上皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌干细胞；多能干细胞具有分化成多种细胞或组织的潜能，但失去了发育成完整个体的能力，如造血干细胞等；全能干细胞可以分化为全身200多种细胞，如神经细胞，并进一步形成机体的所有组织、器官，如胚胎干细胞。” 再看中图版教材上的描述：“全能干细胞具有形成机体的任何组织或器官，直至形成完整个体的潜能。受精卵便是一个最初的全能干细胞，它可以分化出许多全能干细胞，如胚胎干细胞。提取这些细胞中的任意一个置于子宫内，就可以发育出一个完整的个体。多能干细胞具有分化出多种组织的潜能，但不能发育成完整的个体，如骨髓造血干细胞可以分化出至少12种血细胞。专能干细胞只能分化成某一类型的，如神经干细胞只可分化出各类神经细胞。” 从苏教版和中图版教材的内容中可以看出，胚胎干细胞是全能干细胞，造血干细胞是多能干细胞，这和人教版教师教学用书上的叙述相矛盾，和人
小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
细胞的原代培养 点击次数：540 作者：佚名发表于：2009-03-06 16:26转载请注明来自丁香园 一、原代细胞培养原理 原代细胞培养是将机体内的某组织取出，分散成单细胞，在人工条件下培养使其生存并不断生长、繁殖的方法。借助这种方法可以观察细胞的分裂繁殖、细胞的接触抑制以及细胞的衰老、死亡等生命现象。 ? 幼稚状态的组织和细胞，如：动物的胚胎、幼仔的脏器等更容易进行原代培养 ? 掌握无菌操作技术 ? 了解小鼠解剖操作技术 ? 了解原代细胞培养的一般方法与步骤 ?了解培养细胞的消化分散 ? 了解倒置显微镜的使用 二、实验材料 ? 实验动物：孕鼠或新生小鼠 ? 液体：细胞生长液（内含20%小牛血清） 0.25%胰蛋白酶 平衡盐溶液 70%乙醇 ?器材：灭菌镊子、剪刀若干把 灭菌培养皿、细胞培养瓶、小瓶、烧杯若干个 吸管若干支 酒精灯 原代细胞培养方法 三、胰酶消化法 （1）胰酶消化法操作步骤——取材 a. 用颈椎脱位法使孕鼠迅速死亡。
b. 把整个孕鼠浸入盛有75%乙醇的烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。 c. 用无菌的镊子和剪子在前腿下作一腹部水平切口，用无菌镊子将皮肤扯向后腿。 d. 用另一无菌的剪刀和镊子切开腹部，取出含有胚胎的子宫，置于无菌的培养皿上。 e. 剔除胚胎周围的包膜（若胚胎较大，应剪去头、爪），将胚胎放于无菌的含有平衡盐溶液的培养皿中。 f. 漂洗胚胎，去掉平衡盐溶液。继续用平衡盐溶液漂洗胚胎直至清洗液清亮为止。 （2）胰酶消化法操作步骤——切割 a. 将部分胚胎转移至一个无菌小瓶中，用平衡盐溶液漂洗。 b. 然后用眼科手术剪刀小心地绞碎胚胎，直到成1mm3左右的小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。 c. 静置，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清。 （3）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养 a. 视组织块量加入5-6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20-40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 b. 加入3-5ml细胞生长液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。 c. 静置5-10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。 d. 1000rpm，离心10分钟，弃上清液。 e. 加入平衡盐溶液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 f. 加入细胞生长液l-2ml（视细胞量），血球计数板计数。 e. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。 （4）胰酶消化法操作步骤——消化、接种培养
干细胞成骨诱导后的染色方法和步骤
碱性磷酸酶(ALP)是成熟成骨细胞的标志性酶，同时成骨细胞形成的钙结节也是成骨细胞的标记物。 以ALP为目标物的检测方法： 1 Gomori钙钴法 【染色原理】 ALP在pH值9.4的环境下，以镁离子作为激活剂，能够把β-甘油磷酸钠水解出磷酸，磷酸与高浓度的钙盐结合形成无色的磷酸钙，再与硝酸钴作用形成磷酸钴，经硫化胺处理形成黑色的硫化钴沉淀在酶活性处。 【孵育液配制】 3%β-甘油磷酸钠5ml 2%巴比妥钠5ml 蒸馏水10ml 2% CaCl2 10ml 2% MgSO4 1ml 【步骤】 (1)将无菌的玻片放入培养皿中，传代时加入适量的细胞悬液，作细胞爬片，呆细胞长满玻片后取出。 (2)PBS冲洗后用冷丙醇固定10min，蒸馏水冲洗数次。 (3)入孵育液中，37℃孵育4-6h。自来水冲洗数次。 (4)2%硝酸钴中浸3-5min，蒸馏水洗数次。 (5)1%的硫化铵中2min，自来水冲洗，自然干燥，封固。 【结果】胞质中阳性反应呈现灰黑色颗粒或块状沉淀。 2 偶氮偶联法： 【孵育液配制】 萘酚AS-BI磷酸盐 20mg DMSO 0.5ml 0.2mol/L巴比妥醋酸缓冲液(PH 9.2) 50ml 六偶氮副品红0.5ml 1mol/L NaOH调PH 9-10，混合后过滤使用。 (六偶氮副品红：副品红400mg，浓盐酸2ml，双蒸水8ml混合过滤；临用前与等体积4%亚硝酸钠混合) 【步骤】 (1)细胞爬片成功后，PBS冲洗后，置入4℃10%甲醛固定10min。 (2)蒸馏水冲洗。 (3)将过滤孵液直接滴加于玻片上，室温下作用45min。 (4)流水冲洗，晾干。 (5)甘油明胶封固。 【结果】成骨细胞胞质中可见红色ALP阳性颗粒。 3 碱性磷酸酶染色试剂盒法： 【作用原理】细胞内碱性磷酸酶在Ph9.4-9.6条件下水解磷酸萘酚AS-MX产生萘酚，后者被重氮盐捕获，生成不溶性有色沉淀。 【作用液配制】
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景
龙源期刊网 https://www.360docs.net/doc/1b12757019.html, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 作者：王士珍李雪甫陈培 来源：《科技视界》2012年第23期 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称 为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然
细胞分化和细胞全能性教学案例
《细胞分化和细胞全能性》课例分析 一教学背景 克隆生物和干细胞治疗疾病，这些都是当今生物科学的热点，学生在媒体中经常看到相关的报道，但干细胞为什么能治疗疾病？克隆生物怎样制造出来的？等等，这些都是学生感到困惑的问题。依据新的课程理念，生物教学应注重与现实生活相联系，确定本节课的教学目标是“说明细胞的分化”和“举例说明细胞的全能性”，这都是“理解水平”的要求；为增强学生理论联系实际，关注生命科学的热点问题，培养学生资料搜集和分析能力，以及表达与交流的能力，也确定开展“搜集有关克隆技术的相关资料”为教学目标。 二教材分析 多细胞生物体的生长发育与细胞的分化密切相关，细胞的分化是个体发育中重要的生理过程和生理现象，细胞分化是一种持久的、稳定的变化。分化的细胞在一定条件下又具有全能性，动物细胞核全能性的具体应用——克隆技术又是当今生命科学的热点。本节内容既是对细胞结构、功能、分裂等知识的拓展和延伸，又为学习遗传、变异打下基础。同时，本节知识与当今许多科技新进展热点问题都有紧密地联系，因此能联系实际了解或解决一些实际问题就显得很重要，也会激发学生了解科学的积极性，也是激发学生社会责任感的良好契机。三学情分析 学生在初中对“细胞分化”的知识有初步的了解，在学完“细胞的增殖”后学习本节，使学生对生物的个体发育有一个系统的理解，对于本节涉及到克隆技术、植物组织培养等知识，学生既无直观印象，也少有相关的信息储备。因此，收集与处理信息的能力、联系实际的能力是学好本节的基础。 四教学思路 细胞分化是多细胞生物体发育的基础和核心，为提高学生的学习兴趣，联系校园网上“青浦青年造血干细胞捐献志愿者”活动的通知，引导学生思考，为什么要捐献骨髓干细胞？只要平时关注媒体报道的学生，大多数能说出“是因为骨髓中有造血干细胞，能治疗白血病。”就此引入细胞分化的学习。 细胞分化的概念，内涵较深刻，也是学生较难理解的，可通过提供充分的感性材料如：图像信息，多媒体课件演示动物个体发育过程，层层设问，帮助学生理解，并且将有丝分裂与细胞分化联系起来，构建合理的知识网络。 细胞的全能性是教学的难点，引导学生从细胞有丝分裂的结果来分析。对植物细胞的全能性，用试验过程介绍，让学生了解植物组织培养的过程。最后让学生交流搜集到的有关克隆技术的知识，并对克隆技术的应用就利弊两方面展开辩论，培养他们交流表达能力以及对生物理论知识的理解、应用能力。 五教学设计方案 教学目标 1.知识和技能 1)理解细胞分化的概念、特点和意义 2)理解细胞全能性的概念 2.过程能力和方法 1)通过介绍胡萝卜根韧皮部组织培养实验，使学生理解植物细胞的全能性。 2)详细介绍“多利”羊的诞生过程，使学生了解细胞生物学实验方法； 3)通过搜集资料，课堂讨论理解克隆技术的两面性。
细胞分化与全能性
第17练细胞的分化及细胞的全能性 一、基础题 1．（2011安徽）干细胞移植现已成为治疗糖尿病的一种临床技术。自体骨髓干细胞植入胰腺组织后可分化为胰岛样细胞，以替代损伤的胰岛B细胞，达到治疗糖尿病的目的。下列叙述正确的是（） A .骨髓干细胞与胰岛样细胞的基因组成不同，基因表达产物不同 B.骨髓干细胞与胰岛样细胞的基因组成相同，基因表达产物不同 C.胰腺组织微环境造成骨髓干细胞基因丢失，分化成为胰岛样细胞 D.胰腺组织微环境对骨髓干细胞分化无影响，分化是由基因决定的 2．（2011山东）下列发生了细胞分化且能体现体细胞全能性的生物学过程是（） A．玉M种子萌发长成新植株 B．小鼠骨髓造干细胞形成各种血细胞 C．小麦花粉经离体培养发育志单倍体植株 D．胡萝卜根韧皮部细胞经组织培养发育成新植株 3．（2011上海）关于哺乳动物细胞体外培养的难易程度，下列表述正确的是（） A．乳腺癌细胞易于乳腺细胞，胚胎细胞易于脂肪细胞 B．乳腺细胞易于乳腺癌细胞，胚胎细胞易于脂肪细胞 C．乳腺细胞易于乳腺癌细胞，脂肪细胞易于胚胎细胞 D．乳腺癌细胞易于乳腺细胞，脂肪细胞易于胚胎细胞 4．（2011山东潍坊高考模拟）2010年，德国一家物技术公司申请了一项专利技术：从血管中萃取的成熟的白细胞可以转变为具有可编程特性的细胞，并进一步分化为不同功能的细胞。下列对该项技术的理解不合理的是（） A.“编程”的实质就是对遗传物质进行改造 B．该技术的操作过程类似与植物组织培养中的脱分化和再分化 C．该技术不能将人成熟的红细胞转变成可编程细胞 D．可编程细胞类似于干细胞 5.（2012天津）下列关于细胞的叙述，错误的是（） A.自体干细胞移植通常不会引起免疫排斥反应 B.胚胎干细胞在体外培养能增殖但不能被诱导分化 C.组织的细胞更新包括细胞凋亡和干细胞增殖分化等过程 D.造血干细胞具有分化出多种血细胞的能力，可用于治疗白血病 6．（2012江苏）下列事实能体现细胞全能性的是（） A．棉花根尖细胞经诱导形成幼苗 B．单细胞的DNA在体外大量扩增 C．动物杂交瘤细胞产生单克隆抗体 D．小鼠体细胞经诱导培育成小鼠 7.（原创）下列有关细胞分化的叙述中，错误的是（） A．神经元、胰岛A细胞和红细胞一般不具有分裂能力 B．细胞分化是生物界的一种普遍存在的生命现象 C．分化后的细胞只保留与其功能相关的一些遗传物质 D．细胞分化的实质是基因选择性表达
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景
胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白(cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然后复合物进入细胞核内，与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫的有机化合物，不仅能用于细胞的常规冻存，而且还是一种常用的细胞分化诱导剂，能够诱导ES细胞分化为骨骼肌细胞、心肌细胞等，其作用机制主要是影响c-myc基因表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水平。也有研究证明，DMSO能使细胞内储存的钙释放出来，而细胞内钙离子浓度升高在诱导细胞分化中可能起着重要作用。除了RA、DMSO外，还有β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，也能诱导ES细胞定向分化为特定类型细
胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展
胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展 （姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班） 摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。 关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎(桑椹胚、囊胚)或原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。ES细胞具有多向分化潜能,可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞,再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为,ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,基因表达调控,药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。1998年,T homson和Gearhart2个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系,在国际上引起了轰动。Science杂志将人类ES细胞研究成果评为1999年世界十大科技进展之首,美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域,由此掀起了ES细胞研究的高潮。 1体外诱导ES细胞的原理 在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异。这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。ES细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化[2]，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。 2体外诱导ES细胞的方法 体外诱导ES细胞的常用方法是将ES细胞进行悬浮培养或悬滴培养，使其形成类胚体(Embry-oid Bodies,EBs)，该结构的分化过程与体内胚胎的早期发育过程相似。首先将EBs消化成单细胞，然后再贴壁培养，并于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞；或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种：一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等；二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养；三是将细胞接种在适当的底物上，以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降，从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因
胚胎干细胞
1. 干细胞(stem cell)： 干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细胞。 2.干细胞分类 (1)胚胎干细胞：指胚胎早期的干细胞。这类干细胞分化潜能宽，具有分化为机体任何组织细胞的能力。如囊胚期内细胞团的细胞。 (2)成体干细胞：指成体各组织器官中的干细胞，成体干细胞具有自我更新能力，但分化潜能窄，只能分化为相应(或相邻)组织器官组成的细胞。如神经干细胞，表皮干细胞。 第一节干细胞生物学 1. 组织自体稳定性： 特定组织通过使自身细胞死亡和增生的方式保持组织细胞数量动态平衡的特征称组织自稳定性。 2. 干细胞是个体发育和组织再生的基础。 一、干细胞的形态和生化特征 1．干细胞的形态特征 ①干细胞形态共性：细胞呈圆形或卵圆形，体积小，核质比大，增殖力强。 ②干细胞的固定组织位置：有的干细胞有固定存在部位与方式。如表皮干细胞与其周围的子细胞形成增殖结构单元。但许多组织的干细胞没有这种分布特点。 2．干细胞的生化特性 ①端粒酶活性高：如造血干细胞具癌细胞的端粒酶活性，增殖能力强。随着增殖与分化，端粒酶活性下降。 ②蛋白标志分子：不同干细胞有各异的蛋白质标志分子，可作为确定干细胞位置、分离提纯干细胞的标志。如：巢素蛋白—神经干细胞；角蛋白15—表皮干细胞。 二、干细胞的增殖特征 （一）增殖缓慢性 1．干细胞增殖速度慢：细胞动力学研究表明，干细胞的增殖速度较慢，组织中快速分裂的细胞是过渡放大细胞。 如小肠干细胞的分裂速度(Tc=11小时)比过渡放大细胞(Tc≥24小时)慢一倍。 2．过渡放大细胞： 过渡放大细胞是介于干细胞和分化细胞之间的过渡细胞，过渡放大细胞经若干次分裂产生分化细胞。 通过这种方式，机体可用较少干细胞获得较多分化细胞。 3．干细胞增殖缓慢的意义： (1)利于干细胞对外界信号作出反应，以决定细胞的发展方向—增殖或分化。 (2)减少基因突变的危险。增殖缓慢使干细胞有时间发现并纠正处于增殖周期过程中的错误。（二）干细胞的自稳定性 1．自稳定性： 自稳定性是干细胞的基本特征之一。指干细胞可在个体生命过程中自我更新并维持其自身数目恒定。 干细胞的自稳定性是区别肿瘤细胞的本质特征。 干细胞通过其特有的分裂方式维持自稳定性。 2．干细胞的分裂方式 ①干细胞有对称与不对称两种分裂方式。 不对称分裂的结果使两个子细胞一个成为功能专一的分化细胞；另一个保持干细胞的特征。 3. 不对称分裂发生原因：