转基因大豆

转基因大豆

一、国外转基因大豆新品种培育研发的基本流程

以现有大豆品种作为受体材料，利用基因工程手段，构建重组植物表达载体，用农杆菌介导法和基因枪法两种方法将目的基因导入大豆，获得转基因植株，分析其对疫霉根腐病的抗病性，筛选出抗病大豆新株(品)系。

由于根癌农杆菌介导的转基因技术体系具有插入基因拷贝数低、遗传稳定、转化过程相对简单、成本相对低廉等诸多优点，一直是植物转基因研究的首选技术，在大豆中亦是如此。自Hinchee 等于1988年建立根癌农杆菌介导的大豆子叶节器官发生转化系统之后，许多实验室以此为基础开展了优化、改进工作和转基因材料创制研究，也使该技术体系成为了最为重要的大豆转基因手段。

在根癌农杆菌介导的大豆转基因技术体系建立的同时，基因枪介导的大豆转基因技术体系也获得了成功。尽管基因枪介导的转基因技术体系存在多拷贝插入频率高、断裂的DNA 片段插入难以避免、转基因后代遗传稳定性较差等缺点，但由于其受基因型限制较小，操作流程相对简单、遗传转化相对较易实现等优点，仍是植物转基因研究的重要手段之一。在大豆遗传转化较为困难的现实条件下，其在大豆中的使用依然较为普遍，特别是在利用转基因大豆材料进行基因功能分析的研究中更为常见。

二、如何有效减少转基因后代材料中目的基因沉默或丢失的现象

1、避免基因间的同源性

由于重复或同源序列是基因沉默的普遍诱因，因此，在构建表达载体时，尽量降低所设计的序列与内源基因的同源性，以减少或避免配对。应尽量使外源DNA碱基组成与植物DNA 碱基组成相一致，以避免被植物限制修饰机制所识别。同时，也可以采用定点插入方法，将外源基因插入到具有与其相似碱基组成的染色体区

域。另外，在育种过程中要选择外源基因表达稳定的株系。

2、避免重复序列的出现

基因枪法以及电激法等直接DNA导入法易引起多个拷贝基因整合，使用根癌农杆菌介导法转化植物可在一定程度上避免这一问题。因此在进行植物转化时，应优先考虑使用后一方法。同时，在筛选作为育种材料的转基因植株时，应尽量选择单拷贝插入的个体，来减少重复序列的存在。

3、消除甲基化的影响

鉴于转基因甲基化程度与转基因沉默的程度成正相关，即甲基化是基因沉默的直接原因。在载体上加上有去甲基化功能的序列以防止甲基化。如目前已知用5-氮胞嘧啶处理植株具有很好的抑制甲基化和脱甲基化作用。但由于其价格昂贵，兼有致癌性，因此实用价值不高。

4、MAR的使用

使用核基质结合区（matrix attachment region, MAR）序列是克服外源基因沉默的有效方法。MAR是染色质上的一段DNA序列，又称之为核骨架结合区( scafford attachment

region)。把MAR构建到外源基因的两侧，使它们在转基因植物的染色质中形成独立的区域，这样不但可以避免外源基因表达位置效应的影响，而且还可以提高外源基因在转化细胞中的稳定性和表达水平。

5、使用诱导型启动子

大多数的科研工作都是使用组成型强启动子，不过诱导型的启动子迄今仅在少数植物中获得了转基因植株。如用于双子叶植物转化的花椰菜花叶病毒（CaMV）35S启动子或胭脂氨酸合成酶nos启动子。

三、目前国内外研发机构主要采用的大豆遗传转化方法及其优缺点

目前大豆遗传转化的方法较多，主要有农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法、PEG 法、显微注射法、电激法、超声波辅助农杆菌转化法等，其中常用的方法有农杆菌介导法、基因枪法和花粉管通道法。

1、农杆菌介导法

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，该细菌能够在自然条件下有趋化性的感染大多数双子叶植物的伤口部位，并能够诱导

其产生冠瘿瘤或发状根。农杆菌介导法(Agrobacterium-mediated) 中应用的主要有根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 和发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes) ，这两种菌的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段转移DNA (T-DNA)，在病原菌致病过程中，即农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，植物微伤口分泌的乙酞丁香酮(AS) 作为信号因子诱导农杆菌中的vir基因的表达，使农杆菌附着在植物细胞上，但此时只留在细胞间隙中，而后启动T-DNA的进一步加工、剪切、复制，最终进入植物细胞并整合到植物核基因组上，并稳定表达。

农杆菌介导的遗传转化具有以下优点: 技术操作简单、经济成本低#可靠性高，外源基因通常以单拷贝或者低拷贝的形式插入到植物基因，其转化率相对较高，可以转化的外源基因片段较大( >50kb) ，并且没有明显的基因重排现象，但大豆转化的效率受到农杆菌菌株感染转化能力、大豆基因型、组织培养条件和转化后的筛选模式等因素影响，目前仍需要突破性改进。2、基因枪法

基因枪转化法(Particle bombardment) 主要是通过物理介导的方法将外源的DNA分子导入植物细胞、组织、器官或原生质体中，并实现在植物基因组中的整合。该方法利用低压气体加速以包被着DNA的金粉颗粒或其他惰性金属颗粒轰击植物组织细胞，广泛应用于对农杆菌侵染不敏感的植物的遗传转化中。

与农杆菌转化法相比，其优点在于该方法对外植体的基因型没有依赖性，具有相对高的转化率，而且可转移多拷贝的重组DNA或者DNA 片段; 而缺点则是该方法耗资较大，转移的外源基因片段相对较小( >10kb) ，易发生基因重组，转基因植株还容易出现嵌合体等。

3、花粉管通道法

花粉管通道法(Pollen-tube pathway) 的原理主要是当植物授粉后开花、受精过程中会形成花粉管通道，此时将含有目的基因的DNA溶液注射进该部位，使得外源DNA可经过珠心通道进入胚囊，对尚未发育完全的胚胎细胞进行转化，通过观察后代的变异，最终筛选出转基因植株。

花粉管通道法的优点是操作简单、不依赖于