实验一培养基的配制及灭菌
实验一 培养基的配制与灭菌
铁盐
有机物质 2,4-D
200倍液
100倍液 1.0 mg/ml
5 ml
10ml 1ml
——
5 ml
10ml ——
5 ml
10ml 1ml
NAA
KT 蔗糖
1.0 mg/ml
1.0 mg/ml 30 g
0.2ml
1.0ml 30 g
——
—— 30 g
0.1ml 30 g
琼脂
pH值
8g
5.8
8g
5.8
8g
五、作业要求：完成实验报告，回答下面的思考题 1、根据以下所给母液浓度、蔗糖和琼脂量，配制烟草愈伤组织诱 导和培养的培养基（MS1），按MS配方（Murashige and Skoog, 1962）计算各种母液吸取量或药品的直接称量量。 2、简述高压蒸气灭菌的步骤；培养基采用高压蒸气灭菌应注意哪 些事项？
药品名称
母液倍或母 液浓度 （mg/ml）
配制1 L培养基 配制0.25 L培养基所需母液量(ml) 所需母液量(ml) 或质量（g） 或直接称量量（g） MS 1 MS 2 MS 3
大量元素 微量元素 铁盐 有机物质 2,4-D NAA KT 蔗糖 琼脂 pH值
10倍液 100倍液 200倍液 100倍液 1.0 mg/ml 1.0 mg/ml 1.0 mg/ml 30 g 8g 5.8
5.8
——
5.8
1）在烧杯内放入一定量的蒸馏水，用量筒或移液枪按上述表 格内配方加入各种母液及激素。 2）加入蔗糖30g，待蔗糖溶解后（可搅拌）加水定容至1L。 3）调节PH值，用酸度计测量PH值至5.8，常用1mol/l的HCl或 NaOH调整。 4）在MS1和MS2中加入琼脂8g，加热溶解，溶解过程中不断 搅拌，加热时烧杯口上盖上锡箔纸，防止水分过度蒸发。 5）分装：将配好的培养基及时分装到小三角瓶中，防止凝固 ，每瓶约30ml-40ml（约覆盖瓶底），分装时不要沾壁口。 6）封口：用封口膜将将三角瓶封口。
实验一 培养基的制备消毒灭菌
(2) 装放待灭菌物品：将已包扎好的物品放入内桶。盖上锅盖，以两
两对称方式同时旋紧螺栓，勿使漏气。
(3) 加热排气：接通热源，同时打开排气阀，待见有大量水汽排出时，
维持3---5min，锅内空气排尽，关上排气阀。另外一种排气方法：先将排气 阀关闭，待加热升温内压达到5磅时再打开排气阀，等到压力表指针回到零， 关闭排气阀。
培养基的作用：微生物分离、培养、增殖、保藏及鉴定。
培养基配制原则
◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆ ◆
选择适宜的营养物质 营养物质浓度及配比合适 控制pH条件 控制氧化还原电位
原料来源的选择
根据培养目的不同调配
灭菌处理
2 消毒和灭菌的原理
★ 消毒与灭菌是确保 微生物纯培养 （由一个菌体
生长繁殖的群体）的最基本的实验技术。
高 压 蒸 汽 灭 菌 锅
a 方法：一般121℃（1kg/cm2或15磅/英寸2） 20-30min。 b 适用：耐高温物品如培养基，无菌水，培养皿。 c 注意事项：灭菌开始排净冷空气；
灭菌终了，自然缓慢降压回零；
灭菌结束，趁热取出物品。
三 实验操作步骤
分组操作：分6组，5人1组。
◆ ◆ ◆
牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（第1~2组做，每组600ml） 马铃薯糖琼脂培养基（第3~4组做，400ml） 高氏1号培养基（第5~6组做，200ml）
每组需要做的其它工作
（1）每组包1ml吸管5支（塞棉花）（示范） 。 （2）每组包培养皿2包（每包6个） （示范）。 （3）每组装9ml无菌水5管。 （4）每组装20ml无菌水2瓶（50ml三角瓶，内有玻璃珠）。
（5）装锅灭菌。
高压蒸汽灭菌
(1) 灭菌前的准备：将高压蒸汽灭菌锅的内桶取出，向外锅内加入适
实验一培养基的配制与灭菌
实验一培养基的配制与灭菌一、目的掌握培养基母液的配制方法；培养基的配制和灭菌技术；不同质地实验用品的灭菌方法。
二、方法步骤1、母液配制一般大量元素、微量元素和其它成分分别配制成100－200倍母液，使用时按比例稀释即可。
配好的母液需贮存于2～4℃的冰箱中，定期检查有无沉淀和微生物污染，如果出现沉淀或微生物污染，则不能使用。
2、植物激素配制植物激素一般配制成浓度为0.1—1.0mg/ml的溶液，贮存在2～4℃下备用。
由于多数激素难溶于水，所以配制时应按下面步骤进行：IAA：先用少量95%乙醇使之充分溶解，再加蒸馏水定容至需要浓度的体积。
NAA：可溶于热水中，也可采用与IAA同样的方法配制。
2,4-D：先用少量1mol/L的NaOH溶液充分溶解，然后缓慢加入蒸馏水定容至需要浓度体积。
细胞分裂素类：KT和BA等细胞分裂素类物质均溶于稀盐酸，应先用少量1mol/L的HCl溶解后再稀释至需要浓度。
赤霉素：赤霉素的水溶液稳定性较差，一般用95%的乙醇配制成5～10mg/ml的母液低温保存，使用时再稀释。
3、培养基配制按实际配制培养基体积，取各母液的需要量加入一适当体积的烧杯或其它配制培养基的容器中，再加入实际配制培养基体积约2/3—3/4的蒸馏水，然后以每升所用蔗糖的量称取放入培养基并使其溶化。
用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl调整pH至5.6—5.8，以0.6%—0.8%的比例加入琼脂，并搅拌加热使琼脂完全溶化，用蒸馏水定容至终体积，混合均匀后分装于培养器皿中，然后进行高压灭菌。
4、培养基灭菌分装好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌，灭菌条件为温度121℃，压力0.105MPa，灭菌时间与培养基容量的关系如下表所示。
培养基体积与灭菌时间的关系三、结果与分析1、培养基的母液配制情况。
2、培养基配制时的注意事项。
四、提交实验报告附：MS培养基配方。
植物生物技术实验一 植物培养基的配制灭菌和保存
实验一植物培养基的配制、灭菌与保存一、实验目的1、学习和了解相关仪器的操作步骤和注意事项；2、学习和了解培养基母液的配制方法；3、掌握培养基的配制方法；4、学习和了解培养基、器皿和相关设备的灭菌方法。
二、主要用具和仪器设备烧杯（1000mL 、500mL 、100mL 、50mL ）；量筒（2000mL 、1000mL 、500mL 、250mL 、100mL 、50mL 、25mL 、10mL ）；容量瓶（1000mL 、500mL 、250mL 、100mL 、50mL 、25mL ）；试剂瓶（1000mL 、500mL 、200mL 、100mL 、50mL ）；培养基瓶（三角瓶）（1000mL 、500mL 、200mL ）；玻璃棒等。
1、玻璃器皿二、主要用具和仪器设备油性标记笔、药勺、称量纸、棉塞、锡箔纸、移液枪（5mL 、1mL 、200µL 、100µL ）和对应的枪头、移液管（5mL 、2mL 、1mL 、0.5mL ）和洗耳球、电子天平（感量为0.1 mg 、10 mg ）、pH 计、灭菌锅、微波炉、磁力搅拌器、电磁炉、超净工作台、冰箱、冰柜等。
2、用具和仪器设备三、实验药品NH4NO3、KNO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、Na2EDTA、FeSO4·7H2O、甘氨酸、盐酸硫氨素（V-B1）、·4H2O、盐酸吡哆素（V-B6）、烟酸、肌醇、MnSO4ZnSO4·7H2O、H3BO3、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、NAA、6-BA、KT、2,4-D、琼脂、蔗糖、NaOH、HCl。
四、实验内容培养基配制方案MS1（500mL）：MS基本培养基+2,4-D 2 mg/L + KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L（烟草愈伤组织诱导）;MS2（800mL）：MS基本培养基+NAA 0.2 mg/L + 6-BA1 mg/L+蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L（烟草苗的微繁殖）;MS3（500mL）：MS基本培养基+NAA 1 mg/L + KT 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L（烟草细胞悬浮培养）。
实验一 培养基的制备与灭菌
实验一培养基的制备与灭菌一、实验目的1. 了解配制培养基的一般方法和步骤;掌握牛肉膏蛋白胨培养基、马铃薯葡萄糖(蔗糖)培养基的制备方法。
2. 了解灭菌的原理，掌握高压蒸气灭菌的操作方法。
二、实验器材1. 药品:牛肉膏;蛋白胨;氯化钠;葡萄糖(蔗糖);琼脂;1N NaOH;1N HCl等。
2. 仪器及其他:试管;锥形瓶;量杯;玻璃棒;漏斗;纱布;棉花;报纸;天平或台秤;马铃薯;电炉;铝锅;灭菌锅等。
三、实验方法(一)配制培养基的基本过程:(1)称量:按照培养基配方，称取各种原料放于锅中;(2)溶解:锅中加入所需水量(自来水)，加热溶解。
要不断搅拌，以免糊底烧焦，最后加水补足失去的水分;(3)调pH值:按配方要求调节;(4)过滤:用过滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求，此步可以省去。
(5)分装:按实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。
分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上而造成污染。
分装量:斜面培养基装入的培养基约为试管高度的l/5,1/4，灭菌后制成斜面。
分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。
(6)加棉塞:试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞。
制作棉塞时，应选用大小、厚薄适中的普通棉花一块，铺展于左手拇指和食指扣成的圆孔上，用右手食指将棉花从中央压入圆孔中制成棉塞，然后直接压入试管或锥形瓶口。
也可借用玻璃棒塞入，也可以用折叠卷塞法制作棉塞(见图)。
棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。
棉塞不宜过紧或过松，塞好后以手提棉塞，以瓶、管不下落为准。
棉塞的2/3应在管内，上端露出1/3，便于提拔。
如制作时不慎沾上培养基则不可再用。
(7)包扎:加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸或双层报纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。
若培养基分装于试管中，则应以7支在一起，再于棉塞外包一层牛皮纸，用绳扎好。
然后用笔注明培养基名称、组别、日期。
微生物实验
实验一、培养基的制备和消毒灭菌培养基的配制1.培养基：人工配制的供微生物生长繁殖或积累代谢产物所需的营养基质。
2.培养基的配制原则（1）目的明确：不同微生物所需营养基质不同，配制培养基的目的也有不同。
（2）营养协调：营养成分的比例和浓度要适当。
（3）理化适宜：渗透压、pH和氧化还原电位。
（4）经济节约。
实验步骤---斜面培养基的制备和灭菌计算→称量→加热溶化→调pH →过滤（可省略）→分装→加塞（附棉塞制作）→包扎(皮筋或绳子)→灭菌→摆斜面→无菌检查。
1.称量按照配方，准确称量各成份放于烧杯中。
对于不是粉状药品（如牛肉膏），应用烧杯和玻璃棒称量。
2.配制（1）向烧杯中加入适量的水，搅拌，使其溶解（可加热助溶）。
（2）如果配制固体培养基，在琼脂熔化时，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
一般要求琼脂沸腾3次，完全熔化后，补足所失水分。
3.调节pH值培养基溶解后，用pH试纸测pH，然后根据要求加酸或碱（一般用1M HCl和1M NaOH），要缓慢少量且多加搅拌。
培养基配方为自然pH时，不用调节。
4.过滤用滤纸或多层纱布，无特殊要求时可省去。
5.分装（1）将培养基分装入试管内或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。
固体培养基要趁热装。
（2）分装量①斜面：装量为管长的1/5。
②液体培养基：装量为管长的1/4。
③半固体培养基：装载量为管长的1/3。
（3）注意分装时要避免培养基粘染管（瓶）口，引起污染。
6.灭菌塞棉塞，包扎，灭菌。
培养基做完后，要求在2-4小时内灭菌，否则会被污染。
7.摆斜面灭菌完毕，冷却到60℃左右再摆斜面，以免产生过多冷凝水。
配制培养基时注意事项1.称量要准确，取药品的角匙不能混用。
2.加热融化时要不断搅拌，以免糊底和溢出,（每加热30s关掉电源，开盖看一次）。
3.蛋白胨极易吸湿，称取时动作要迅速。
5.节约药品。
实验二细菌的简单染色和革兰氏染色革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇(或丙酮)脱色，最后用复染剂(如番红)复染。
实验一无菌技术及培养基的配制
试验1 培养基制备、消毒灭菌倒平板（共6课时）一、试验目1.了解配制培养基原理, 并掌握配制培养基通常方法和步骤。
2.学习多个常见培养基配制、分装和灭菌操作方法.二、试验器材1.药品及试剂:可溶性淀粉, KNO3, K2HPO4·3H2O, MgSO4·7H2O, FeSO4·7H2O, 1mol/L NaOH, 琼脂, 牛肉膏, 蛋白胨, NaCl, 马铃薯2.仪器及其它试管、三角瓶、烧杯、量筒、玻棒、天平、药匙、高压蒸汽灭菌锅、pH 试纸(5.5-9.0) 、棉花、牛皮纸、记号笔、麻绳、纱布、干燥箱、培养皿、涂布棒、吸管（1ml）、玻璃珠、PH试纸三、试验内容1.分组配制高氏一号培养基300ml。
配方:可溶性淀粉20g NaCl 0.5g、KNO3 1g 、K2HPO4·3H2O 0.5g MgSO4·7H2O 0.5gFeSO4·7H2O 0.01g 琼脂15-25g 水1000ml pH 7.4-7.62.配制牛肉膏蛋白胨培养基100ml配方:牛肉膏3g 蛋白胨10g NaCl 5g 琼脂20g 水1000ml PH 7.4-7.63.配制马铃薯培养基100ml配方:马铃薯200g 蔗糖20g 琼脂20g 水1000ml pH自然4.包扎材料: 试管, 培养皿, 涂布棒, 吸管, 枪头盒等。
5.灭菌。
6.摆斜面, 倒平板, 放冰箱。
四、方法步骤（一）培养基制备与分装1.称量按培养基配方百分比依次正确地称取药品。
可溶性淀粉先用少许热水溶化后再加入其她成份, 补足所需水分, 混匀后加入琼脂。
2.熔化在沸水浴锅中加热熔化。
3.调pH 用1mol/L NaOH调pH至7.4-7.6。
4.过滤趁热用多层纱布过滤5.分装将溶化固体培养基趁热加至漏斗上, 装试管时, 注意管口不要沾上培养基。
液体分装装量不超出试管1/4, 固体分装装量不超出试管1/5, 分装三角瓶量不超出三角瓶容积二分之一, 半固体分装装量为试管1/3, 灭菌后垂直待凝。
微生物实验一、培养基的配制与灭菌
培养基的配制与灭菌一、实验目的1. 了解一般培养基配制原理，掌握培养基常规配制程序。
2. 了解培养基配制过程各环节的要求和注意事项，掌握实验室各种灭菌技术及玻璃器皿的包装方法。
二、基本原理培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料，主要含有微生物生长繁殖所必需的碳源、氮源、无机盐、生长因子及水分，并要求具有适宜的pH值、合适的渗透压等。
由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基的种类很多，使用的原料各有差异，但一般配制程序却大致相同。
三、实验材料1. 器皿及材料天平、称量纸、钥匙、精密pH试纸、量筒、刻度搪瓷杯、试管、橡胶塞、试管架、三角瓶、移液管、洗耳球、培养皿、玻璃棒、烧杯、剪刀、酒精灯、线绳、牛皮纸或报纸、纱布、电炉、灭菌锅等。
2. 药品试剂蛋白胨、牛肉膏、NaCl、琼脂、水、1mol/LNaOH溶液、1mol/LHCl溶液。
四、实验流程称药品→溶解→调pH值→加琼脂融化（补水，固体培养基用）→过滤（可省略）→分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板→无菌检查。
五、操作步骤1. 称量药品根据培养基配方依次准确称取各种药品，放入适当大小的烧杯中，琼脂不要加入。
蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。
2. 溶解用量筒取一定量(约占总量的1/2)蒸馏水倒入烧杯中，在放有石棉网的电炉上小火加热，并用玻棒搅拌，以防液体溢出。
待各种药品完全溶解后，停止加热，补足水分。
（如果配方中有淀粉，则先将淀粉用少量冷水调成糊状，并在火上加热搅拌，然后加足水分及其它原料，待完全溶化后，补足水分。
）3. 调节pH用1mol/L NaOH或1mol/L HC1溶液调至所需pH。
注意pH值不要调过头，以免回调，否则会影响培养基内各离子浓度。
4. 溶化琼脂琼脂加入后，置电炉上一边搅拌一边加热，直至琼脂完全溶化后才能停止搅拌，并补足水分(水需预热)。
注意控制火力不要使培养基溢出或烧焦。
5. 过滤分装有时需用滤纸或纱布趁热过滤，以利于观察结果。
实验一微生物培养基的配制灭菌及纯培养
今天接种的菌种：
枯草杆菌
芽孢杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3
微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。
菌落外表粗糙不透明，污白色或微黄色，在液
体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。广泛分布
在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故
名。
大肠杆菌 需氧及兼性厌氧。G－短杆菌，周鞭毛，
有动力，周身有菌毛。
变形杆菌
为革兰氏染色阴性、无芽胞、无荚膜、周身鞭
毛、运动活泼、两端钝圆的小杆菌。兼性厌氧。有些
种在普通固体培养基上菌落呈迁徙生长。
在自然界中存在极广，水、泥土、阴沟及各种
腐败的动、植物中最多，也存在于安康人和动物的肠
道中。它们是条件致病菌，在特殊情况下对人致病，
如食物中毒、尿路感染、夏季腹泻或其他混合感染。
培养基的介绍
培养基
是指由人工配制的、适合微生物生长 繁殖或产生代谢产物用的混合营养料。
碳源、氮源、无机盐、能源、生长因子、水
营养物质的浓度要适宜 营养物质之间的配比要适宜
培养基的pH值、渗透压、 水活度和氧化复原电势等 物理化学条件要适宜。
通常培养条件：
细菌： pH 7.0~8.0 放线菌：pH 7.5~8.5 酵母菌： pH 3.8~6.0 霉菌：pH 4.0~5.8 藻类： pH 6.0~7.0 原生动物： pH 6.0~8.0
培养基的灭菌
高压蒸气灭菌 一般培养基: 121.3℃, 15-30 min 含糖培养基: 112.6 ℃, 15-30 min
器皿的灭菌： 干热空气： 160℃， 2 小时
无菌室的消毒： 紫外光 化学药物熏蒸〔苯酚；高锰酸
钾+甲醛〕
二、 微生物的纯培养 〔微生物的培养特征〕
实验一培养基的配制与灭菌
实验一培养基的配制与灭菌一、目的学习并掌握培养基配制及灭菌的方法二、原理（一）培养基在植物组织培养过程中，外植体生长所必需的营养成分和生长因子，主要由培养基提供不同材料对培养基的要求不尽相同，适当地设计和选用培养基，对组织培养取得成功是至关重要的。
培养基通常包括下列成分（表1）表1培养基的组成成分及其作用配制培养基可以直接称量，但为了减少称量麻烦和提高称量的准确性，通常都按配方浓度的若干倍称量，配制成一系列的母液置于冰箱保存，用时按比例稀释。
一般要配下列母液：1、微量元素母液：除铁盐外的其它微量元素盐类的混合液，通常配成1000×2、有机化合物母液：通常配成100×3、铁盐母液：铁盐与其它无机物成分混合易沉淀，须单独配制。
浓度为1000×4、激素母液：各种激素单独配制成母液，浓度从0.1mg到1.0mg/ml不等。
5、10×大量元素母液：培养基除激素、糖、琼脂外，其他成分混合配成10倍液，分装后置于冰箱冷冻格保存。
用时取适量该母液，加入激素、糖、琼脂、水等配成常用培养基。
(二) 培养基的灭菌：培养必须保证绝对无菌，否则因其营养丰富，细菌、真菌极易滋生，而导致外植体死亡。
灭菌方法下列几种：1．高温高压灭菌法：将培养基放入高压锅内，在1210C、108KPa(1.1k g/cm2)的压力下持续约20分钟。
2、过滤除菌法：带菌的溶液通过孔径为0.22μm(或更小)的微孔过滤器装置后，杂菌阻隔留在滤膜上，而溶液进入无菌空瓶内，从而达到除菌的目的。
此法用于不能以高温高压灭菌的培养液或酶液的除菌。
3. 60Coγ射线法：用γ射线过量照射以灭菌。
可用于大量灭菌，但设备昂贵。
三、仪器设备及用具(一)仪器设备万分之一电子天平百分之一电子天平超净工作台高压锅酸度计磁力搅拌器及搅拌子不锈钢过滤器玻璃蒸馏水器家用冰箱(二)用具烧杯：100ml×1，500ml×1 ；量筒：100ml×1，250ml×1磨口试剂瓶：100ml×1，500ml×1；带盖试剂瓶：500ml×2三角瓶：100 ml×1，250 ml×1药匙、称量纸、牛皮纸、棉花塞、橡筋：若干(三)试剂1N HCL 02N KOH 蔗糖（分析纯）琼脂粉N6大量：KNO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2P O4 (NH4)2SO4B5微量：KI H3BO3MnO4·H2O ZnSO4·7H2O Na2MoO4·2H2OCuSO4·5H2O CoCL2·6H2O Na2EDTA FeSO4·7H2OB5有机：盐酸硫胺素盐酸吡哆醇烟酸肌醇谷氨酰胺水解酪蛋白脯氨酸2、4－D 6-BA NAA五、实验步骤（一）配母液1、B5微量元素母液（1000×/100ml）：按配方的1000倍用万分之一天平依次称量，搅拌溶解(溶解一种后再加另一种)后定容。
培养基的配制和灭菌实验报告（共8篇）
培养基的配制和灭菌实验报告(共8篇) 培养基的制备与灭菌实验报告(详细)一、实验题目：培养基的制备与灭菌二、实验目的：1、明确培养基的配置原则，掌握配置方法。
2、了解灭菌的原理，学习掌握灭菌器的使用方法。
三、实验器材：1、药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水、琼脂。
2、仪器：三角瓶、培养皿、试管、线绳、棉花、烧杯、报纸、移液管、试管架、铁针、量筒。
四、实验原理：1、培养基的制备包括一下几种成分：（1）水分：主要成分。
（2）N源：包括无机氮和有机氮。
（3）C源：主要是含碳有机物、碳氢化合物等。
（4）无机盐：如NaCl、KH2PO4等。
微量元素：Cu、K、Mg、S、P、Zn。
有些还需要添加“生长因子”，通常是维生素类、某些氨基酸或核酸等。
2、培养基配置的原则根据不同的培养对象及培养目的，选用不同的培养基，但有机物总量不得超过15%，盐类一般不超过1%。
培养基有以下分类：按成分：天然培养基、合成培养基、半合成培养基按状态：固体培养基、半固体培养基、液体培养基按用途：基础培养基、营养培养基、鉴别培养基、选择培养基培养基配好后应立即灭菌，防止营养物质中的微生物富集。
3、灭菌：用理化手段杀灭一切微生物的营养体，包括芽孢和孢子，在实验中应对所有仪器、操作场所、药品及培养基灭菌或消毒。
（1）高压蒸汽灭菌：将物品放入封闭的加压灭菌器，加热使灭菌锅套间的水沸腾产生蒸汽，将冷空气排尽，压力上升，使水沸点变高，导致菌体蛋白质变性，一般0.1MPa、121℃、15~30min 可以彻底灭菌，本次实验灭菌20min。
若是含糖培养基，110℃、30min。
（2）干热灭菌：微生物细胞内蛋白质因高温而凝固变性。
因高温，所以含水量小，不利于蛋白质受热变性，所以温度高，时间长。
（3）紫外灭菌：诱导胸腺嘧啶二聚体形成抑制DNA复制。
（4）过滤除菌：实验室中用微孔滤膜（孔径一般为0.22μm）。
除病菌需更小。
五、实验步骤：1、牛肉膏蛋白胨培养基的制备依次准确称取0.5g牛肉粉、1.0g蛋白胨、0.5gNaCl放入烧杯，加入100mL水，用玻璃棒搅匀溶解，移入三角瓶，并加入1.5g琼脂。
实验一 微生物培养基的制备与灭菌
实验一微生物培养基的制备与灭菌（8课时）一、目的要求1、学习配制微生物培养基的一般方法和步骤。
2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和操作方法。
二、基本原理正确掌握培养基的配制方法是从事微生物学实验工作的重要基础。
由于微生物种类及代谢类型的多样性，因而用于培养微生物的培养基的种类也很多，它们的配方及配制方法虽各有差异，但一般培养基的配制程序却大致相同，例如器皿的准备，培养基的配制与分装，棉塞的制作，培养基的灭菌，斜面与平板的制作以及培养基的无菌检查等基本环节大致相同。
三、实验材料1、药品：牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂粉、1mol/L的NaOH和1mol/L HCl溶液。
2、仪器及玻璃器皿：电子天平、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、酒精灯、移液管、试管、烧杯、量筒、三角瓶、培养皿和玻璃棒等。
3、其他物品：药匙、称量纸、pH试纸、记号笔、棉花、报纸、线绳和注射器等。
四、操作步骤（一）玻璃器皿的洗涤玻璃器皿在使用前必须用洗涤剂洗刷干净，然后用自来水冲净，置于烘箱中烘干后备用。
（二）牛肉膏蛋白胨培养基的配制1、培养基配制（1）称量：按培养基配方计算出各成分的用量，然后用电子天平进行准确称量后倒入一烧杯中。
注意：称量药品时，一定要用称量纸而不能用滤纸。
称药品用的药匙不要混用，称完药品应及时盖紧瓶盖。
（2）溶解：用量筒称量所需体积的水（根据实验需要可用自来水或蒸馏水），倒入烧杯中，用玻璃棒搅动溶解即可。
（3）调pH：一般用pH试纸测定培养基的pH，可用1mol/L NaOH或1mol/L HCl溶液进行调节。
调节pH时，应逐滴加入NaOH或HCI溶液，防止局部过酸或过碱，破坏培养基中成分。
边加边搅拌，并不时用PH试纸测试，直至达到所需pH为止。
注意：pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。
2、制备液体培养基（1）用量筒准确量取20ml培养基，倒入100ml三角瓶中，塞好棉塞，用报纸包好瓶口并用棉线包扎好，灭菌。
注意：倒溶液时不要把瓶口沾湿。
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2．器皿包扎
（1）培养皿：洗净的培养皿烘干后每5套（或根据需要而定）叠在一起，用牢固的纸卷成一筒，或装入特制的不锈钢桶中，然后进行灭菌。
（2）吸管：洗净，烘干后的吸管，在吸口的一头塞入少许脱脂棉花，以防在使用时造成污染。塞入的棉花量要适宜，多余的棉花可用酒精灯火焰烧掉。每支吸管用一条宽约4～5cm的纸条，以30～50℃的角度螺旋形卷起来，吸管的尖端在头部，另一端用剩余的纸条打成一结，以防散开，标上容量，若干支吸管包扎成一束进行灭菌，使用时，从吸管中间拧断纸条，抽出吸管。
琼脂粉（Agar）20.0g
去离子水1000mL
马铃薯培养基配方（自然pH）：
马铃薯（去皮）200.0g
葡萄糖（或蔗糖）（Dextrose or glucose）20.0g
琼脂粉（Agar）20.0g
去离子水1000mL
察氏培养基配方（自然pH）：
蔗糖（glucose）30.0g
NaNO32.0g
K2HPO41.0g
B、融化
在上述烧杯中先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。
将药品完全溶解后，补充水到所需的总体积，如果配制固体培养基时，将称好的琼脂放入己溶的药品中，再加热溶化，最后补足所损失的水分。
C、调节pH
在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH，直至pH达7.6。反之，用1mol/LHCL进行调节。对于有些要求pH较精确的微生物，其pH的调节可用酸度计进行。pH不要调过头，以避免回调而影响培养基内各离子的浓度。配制pH低的琼脂培养基时，若预先调好pH并在高压蒸气下灭菌，则琼脂因水解不能凝固。
高压蒸气灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸气。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸气不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大。其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低，二是湿热的穿透力比干热大，三是湿热的蒸气有潜热存在。这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。
LB培养基配方（pH 7.0）：
胰蛋白胨（Tryptone）10.0g
酵母提取物（Yeast extract）5.0g
氯化钠（NaCl）10.0g
琼脂粉（Agar）20.0g
摇动容器直至溶质溶解，用5mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，在0.1MPa压力下灭菌20min。
牛肉膏蛋白胨培养基配方（pH 7.0）：
3．烘干
洗净的仪器控去水分，放在烘箱内烘干，烘箱温度为105～110℃烘1小时左右。此法适用于一般仪器。对于急于干燥的仪器或不适于放入烘箱的较大的仪器可用吹干的办法。通常用少量乙醇、丙酮（或最后再用乙醚）倒入已控去水分的仪器中摇洗，然后用电吹风机吹至完全干燥。不急等用的仪器，可在蒸馏水冲洗后在无尘处倒置处控去水分，然后自然干燥。可用安有木钉的架子或带有透气孔的玻璃柜放置仪器。
c半固体分装：试管一般以试管高度的1/3为宜，灭菌后垂直待凝。
在分装过程中，应注意不要使培养基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。
F、加塞
培养基分装完毕后，在试管口或三角烷瓶口上塞上棉塞（或硅胶塞及试管帽等），棉塞的作用有二：一方面阻止外界微生物进入培养基，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使培养在里面的微生物能够从外界源源不断地获得新鲜无菌空气。因此棉塞质量的好坏对实验的结果有着很大的影响。一只好的棉塞，外形应象一只蘑菇，大小、松紧都应适当（见图3-2）。加塞时的棉塞的总长度的3/5应在口内，2/5在口外。
KCl0.5g
MgSO4∙7H2O0.5g
FeSO4∙7H2O0.01g
琼脂粉（Agar）20.0g
去离子水1000mL
YPD培养基配方（pH 7.0）：
酵母提取物（Yeast extract）10.0g
蛋白胨（Peptone）20.0g
葡萄糖或蔗糖（Dextrose or glucose）20.0g
（3）试管和三角瓶：试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器。制作棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有皱纹和缝隙，松紧适宜。过紧易挤破管口和不易塞入；过松易掉落和污染。棉塞的长度不小于管口直径的2倍，约2/3塞进管口。若干支试管用绳扎在一起，在棉花部分外包裹油纸或牛皮纸，再用绳扎紧。三角瓶加棉塞后单个用报纸包扎。
A、称量和溶化：按配方先称取可溶性淀粉、放入小烧杯中，并用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分依次逐一溶化。对微量成分FeSO4∙7H2O可先配成高浓度的贮备液按比例换算后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4∙7H2O配成0.01g/mL，再在1000mL培养基中加1mL的0.0lg/mL的贮备液即可。待所有药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其溶化过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
图12棉塞的制作
G、包扎
加塞后，将全部试管用麻绳捆好，再在棉塞外包一层牛皮纸，以防止灭菌时冷凝水润湿棉塞，其外再用一道麻绳扎好。用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。三角烧瓶加塞后，外包牛皮纸，用麻绳以活结形式扎好，使用时容易解开，同样用记号笔注明培养基名称、组别、配制日期。
（2）高氏I号培养基配制方法
干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度高（160～170℃），时间长（1～2h）。但干热灭菌温度不能超过180℃。否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。
一、实验目的
1．掌握实验室常用玻璃器皿的清洗、干燥和包扎方法。
2．明确培养基的配制原理。
3．掌握配制培养基的一般方法和步骤。
4．了解湿热和干热灭菌的原理，并掌握有关的操作技术。
二、实验原理
灭菌是指杀灭物体中所有微生物的繁殖体和芽孢的过程。消毒是指用物理、化学或生物的方法杀死病原微生物的过程。灭菌的原理就是使蛋白质和核酸等生物大分子发生变性，从而达到灭菌的作用，实验室中最常用的1．洗涤
用试管刷蘸取少量去污粉反复刷洗器皿2～3次；用自来水冲洗2～3次；用少量去离子水荡洗1～2次，控干水分。
注意事项：
①不能用有腐蚀作用的化学试剂，也不能使用比玻璃硬度大的物品来擦拭玻璃器皿；新的玻璃器皿应用2%的盐酸溶液浸泡数小时，用水充分洗干净。
②用过的器皿应立即洗涤。
③强酸、强碱、琼脂等能腐蚀、阻塞管道的物质不能直接倒在洗涤槽内，必须到在废物缸内。
实验一 培养基的配制及灭菌
培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。各类微生物对营养的要求不尽相同，因而培养基的种类繁多。在这些培养基中，就营养物质而言，一般不外乎碳源、氮源、无机盐、生长因子及水等几大类。培养基的配制，一是要求在营养成分上能满足所培养微生物生长发育的需要，二是培养基在使用前不带菌，三是以灭菌后和保存过程中营养成分不发生变化。培养基的灭菌通常在培养基配制后进行，其目的是杀灭培养基中残存的微生物或活的生物残体，保证培养基在贮存过程中不变质，也防止其他生物对培养的污染。
图1-1培养基的分装
A漏斗分装装置；B自动分装装置。
1铁架；2漏斗；3孔胶管；4弹簧夹；5玻璃；6流速调节；7装量调节；8开关
少；有的液体培养基在灭菌后，需要补加一定量的其他无菌成分，如抗生素等，则装量一定要准确。
b固体分装：分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。
牛肉膏3.0g
胰蛋白胨（Tryptone）10.0g
NaCl5.0g
琼脂粉（Agar）20.0g
去离子水1000mL
高氏I号培养基配方（pH 7.4-7.6）：
可溶性淀粉20.0g
NaCl0.5g
KNO31.0g
K2HPO4∙3H2O0.5g
MgSO4∙7H2O0.5g
FeSO4∙7H2O0.01g
琼脂粉（Agar）20.0g
去离子水1000mL
在0.1MPa压力下灭菌20min。
三、实验材料
牛肉膏蛋白胨、高氏I号、LB、PDA、YPD、察氏等各种培养基。
四、仪器设备及用具
1.90mm培养皿、吸管、试管、三角瓶、试管刷、硅胶塞、棉花、牛皮纸或报纸、包扎绳、去污粉、洗涤剂、烧杯、量筒、玻棒、牛角匙、pH试纸（pH 5.5～9.0）、记号笔、麻绳、纱布等；
D、过滤
趁热用滤纸或多层纱布过滤，以利某些实验结果的观察。一般无特殊要求的情况下可以省去（本实验勿需过滤）。
E、分装
按实验要求，可将配制的培养基分装人试管内或三角烧瓶内（见图3-1）。
a液体分装：分装高度以试管高度的l/4左右为宜。分装三角瓶的量则根据需要而定，一般以不超过三角瓶容积的一半为宜，如果是用于振荡培养用，则根据通气量的要求酌情减
B、调pH、分装、包扎：灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制方法。
（3）LB培养基配制方法
准确称量胰蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeast extract）5g，氯化钠（NaCl）10g放入一烧杯中，摇动容器直至溶质溶解，加入15～20g琼脂粉，用5 mol/L NaOH调pH至7.0，用去离子水定容至1L，分装，0.1MPa灭菌20 min。