药敏试验ppt课件(1)

实验十一 细菌的药敏实 验及耐药表型检测
实验目的
▪ 一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀 灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素“敏 感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。 为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药， 减少盲目性，往往应进行药敏试验。
实验方法
药物敏感试验
目前常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩 散法（K-B法）、稀释法、E试验、检测细 菌耐药性的方法。稀释法分液体稀释法和 琼脂稀释法。检测细菌耐药性的方法包括 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检 测、耐万古霉素肠球菌（VER）的检测、耐 青霉素肺炎链球菌（PRP）的检测、超广谱 β-内酰胺酶（ESBL）的检测和β-内酰胺 酶的检测。
琼脂稀释法
▪ 介绍 ▪ 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加
入融化并冷至50℃左右的定量MH琼脂中， 制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接 种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以 抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓 度为MIC。本法优点是可在一个平板上同时 作多株菌MIC测定，结果可靠，易发现污染 菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。
▪ 3. 培养基 NCCLS推荐使用Mueller-Hinton （MH）肉汤，pH7.2~7.4。需氧菌及兼性厌 氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球 菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入 2%（W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制 需要量的MH肉汤。
常量肉汤稀释法
4.接种物的制备 直接菌落悬液配制法，直接 取培养18~24h的菌落调配成0.5麦氏比浊标 准的菌悬液。用MH肉汤将上述菌悬液进行 1∶100稀释后备用。注意应在15分钟内接种 完配制好的接种物。
药物敏感试验
药敏试验方法
纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法 稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。
检测细菌耐药性的方法
超广谱 β-内酰胺酶（ESBL）的检测 β-内酰胺酶的检测
实验方法
--药敏实验
平板扩散法
1 可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌 混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于 平皿培养基表面。要求涂布均匀致密 2 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片 贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧 密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准 确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平 皿培养基上；一般每个平皿贴4片，每种药敏片 的名称要记住。
常量肉汤稀释法
1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度 不应低于1000μg/ml(如1280μg/ml)或10倍 于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍 低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相 关机构。
常量肉汤稀释法
2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据NCCLS 抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范 围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊 情况例外。
3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后， 观察效果。
平板扩散法
4 抑菌环直径测量：以肉眼观察没有明显 菌苔生长的边缘为界，用的卡尺量取抑菌环 直径。变形杆菌在抑菌环内生长的薄菌苔可 忽略不计。复方新诺明抑菌环内会有轻微细 菌生长，小于20％左右可忽略不计。 5 结果报告：，抑菌环直径的大小可以反 应MIC值的高低。因此根据抑菌环直径的大 小可以参照稀释法MIC值的判断标准报告敏 感、耐药和中介。
琼脂稀释法
培养基制备 ▪ 2.1.培养基制备 使用MH琼脂，按商品说明
书进行配制，pH7.2~7.4。淋病奈瑟菌使用 GC琼脂基础加1%添加剂；其它链球菌使用 含5%（V/V）绵羊血的MH琼脂（当试验磺胺 药时，使用溶解的马血）。
琼脂稀释法
▪ 2.2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将 已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加 入已加热溶解，并在45~50℃水浴中平衡的 MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂 厚度3~4mm。通常按1∶9比例配制药物琼脂 平板，根据需要来选择药物浓度范围。配 制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中 ，置2~8℃冰箱可贮存5天。
常量肉汤稀释法
5. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（
13×100mm）13支，排成一排，除第1管加入1.6mlMH肉 汤外，其余每管加入MH肉汤1ml，在第 0.4ml混匀，然后吸取1ml至第2 管，混匀后再吸取1ml至第3管，如此连续倍比稀释至第 11管，并从第11管中吸取1ml弃去，第12管为不含药物 的生长对照。此时各管药物浓度依次为256、128、64、 32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。然后在每管 内加入上述制备好的接种物各1ml，使每管最终菌液浓 度约为5×105CFU/ml。第1管至第11管药物浓度分别为 128、64、32、16、8、4、2、1、05、0.25、 0.125μg/ml。
常量肉汤稀释法
▪ 6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置 35℃普通空气孵箱中孵育16~20h；嗜血杆菌 和链球菌在普通空气孵箱中孵育20~24h；对 可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠 球菌应持续孵育满24h。
常量肉汤稀释法
▪ 7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌 株的MIC前，应检查生长对照管的细菌生长 情况是否良好，同时还应检查接种物的传代 培养情况以确定其是否污染，质控菌株的 MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药 物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的 MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释 法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制 80%细菌生长管药物浓度为受试菌MIC。
▪ E、附：0.5麦氏比浊管配制方法 ▪ 0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O)
0.5ml ▪ 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml ▪ 将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保
在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于 细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判 断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将 配菌液浓度配成0.5麦氏比浊管时，相当于 1.5×108细菌数/ml，由于方法本身就是一 种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差 异很大，除了真菌孢子，细菌的差别不大 ，结果不会有影响。但是，标准比浊管的 浓度，是药敏实验结果的影响因素之一。