pcambia2301-101植物表达载体
一步法快速构建长片段RNAi发夹的载体
一步法快速构建长片段RNAi发夹的载体作者：刘廷利郭冬姝姚瑶张保龙来源：《江苏农业学报》2021年第05期摘要：利用RNA干擾（RNA interference， RNAi）技术可以进行基因功能研究以及作物遗传改良，但常规构建RNAi载体方法费时费力。
本研究报道了一种基于 USER 酶一步法快速构建RNAi发夹结构的载体2301/RNAi/OS及其应用方法，操作简便，省时省力。
与已报道的利用酶切连接、Gateway兼容的同源重组或PCR直接连接等构建RNAi载体相比，该载体不需要酶切片段，片段扩增完成后即可与制备好的线性化载体进行反应，缩短操作流程和时间，提高成功率;该载体对插入片段的酶切位点和长度没有要求，理论上任何位置和长度的片段均可进入2301/RNAi/OS载体中，尤其是长片段RNAi的构建。
本试验以本氏烟（ Nicotiana benthamiana ） PDS （ Phytoene desaturase ）基因为例，利用农杆菌介导的瞬时表达体系验证了该RNAi能够在植物体内有效地实现基因沉默。
该载体以新霉素磷酸转移酶基因（ NPTII ）作为筛选标记基因，可以利用卡那霉素（Kanamycin）和G418（Geneticin）等抗生素筛选转基因阳性植株，适合单子叶和双子叶植物的遗传转化。
关键词： RNA干扰（RNAi）; USER 酶; 一步法; 载体构建; 基因沉默中图分类号： Q782 文献标识码： A 文章编号： 1000-4440（2021）05-1131-06A one-step method for rapid construction of long-fragment RNA interference vectorLIU Ting-li， GUO Dong-shu， YAO Yao， ZHANG Bao-long（Excellence and Innovation Center， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China）Abstract： RNA interference （RNAi） technology can be used for gene function research and crop genetic improvement， but the conventional construction method of RNAi vector is time-consuming and laborious. In this research， we provide a one-step method for rapid construction of long-fragment RNAi vector using uracil-specific excision reagent （ USER ） enzyme. The methodis simple， time-saving and labor-saving. Compared with the reported RNAi vectors constructed by restriction enzyme ligation method， Gateway compatible homologous recombination method and PCR direct ligation method， this vector dose not need enzyme digestion fragments. After the fragment amplification is completed， it can react with the prepared lineurized vector. Therefore，the operation process and time are shortened， and the success rate is improved. This vector has no requirements for the restriction site and length of the inserted fragment. Using neomycin phosphotransferase （ NPTII ） as selective marker gene in this vector， kanamycin and geneticin （G418） can be used to screen transgenic positive plants. It is suitable for genetic transformation of dicot and monocot plants.Key words： RNA interference（RNAi）; USER enzyme; one-step method; vector construction; gene silencingFire等发现双链RNA （dsRNA）可引发线虫体内的基因沉默，并将这一现象命名为RNA 干扰（RNAi）。
甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体的构建
甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体的构建摘要：将甘蓝型油菜（Brassica napus L.）MYB4基因家族共保守的467 bp 反义片段构建到中间载体pCambia2301G中，替换GUS基因，由CaMV35S启动子驱动，形成了反义植物表达载体，命名为pCambia2301G-MYB4A，并转化到根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中形成工程菌株，为进一步研究甘蓝型油菜MYB4基因家族的功能奠定基础。
关键词：甘蓝型油菜（Brassica napus L.）；苯丙烷代谢途径；MYB4基因甘蓝型油菜（Brassica napus L.）是重要的油料作物之一。
甘蓝型油菜中与苯丙烷代谢途径相关的农艺性状是研究人员长期致力于遗传改良的焦点。
经常发生的倒伏问题要求更加强壮的茎和分枝，抗病性的提高要求更高水平的受病原菌入侵而诱导的细胞壁木质化[1-3]。
另外，油菜种皮栅状细胞层中的色素主要与种皮中类黄酮类物质紧密相关，种皮中类黄酮类物质积累越多，种皮的颜色就越深，积累越少或没有时种皮就呈黄色，即呈现种胚的颜色，从而表现出黄子性状的优质特性[4，5]。
AtMYB4属于拟南芥R2R3-MYB家族的一种新的负调控转录因子，对于植株中抗紫外线类的芥子酸酯类物质的合成具有重要调控作用，该基因在大多数的植物组织中均有表达。
研究发现拟南芥AtMYB4基因突变体叶片中芥子酸酯的含量升高，并呈现出比野生型更强的紫外线耐受能力。
已报道AtMYB4转录因子调控苯丙烷代谢途径关键酶基因C4H的表达[6-8]。
因此，研究MYB4基因有利于阐明甘蓝型油菜苯丙烷类物质合成和相关性状形成的分子机理。
本研究通过构建甘蓝型油菜MYB4基因反义植物表达载体，为研究MYB4基因家族功能，阐明油菜木质素、种皮色素、花青素、植保素、芥子酸等成分的生物合成机制奠定基础。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌种及质粒 E. coli DH5α、根癌农杆菌（A. tumefaciens）LBA4404、植物表达中间载体pCambia2301G均由重庆市油菜工程技术研究中心保存；pMD18-T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。
pcambia2301-101植物表达载体
所有质粒载体汇总
所有质粒载体汇总酿酒酵母表达载体pYES2,pYES2/NT,pYES2/CT,pYES3,pYES6, pYCplac22-GFP,酵母载体pAUR123,pRS303TEF,pRS304, pRS305,pRS306,pY13TEF,pY14TEF，pY15TEF，pY16TEF, 酵母基因重组表达载体pUG6, pSH47,酵母单杂载体pHISi,pLacZi,pHIS2, pGAD424, 酵母双杂交系统:酿酒酵母Y187, 酿酒酵母AH109；质粒pGADT7,pGBKT7；对照质粒pGBKT7-53，pGBKT7-lam，pGADT7-T，PCL1，酿酒酵母菌株INVSc1,YM4271, AH109,Y187,Y190,毕赤酵母表达载体pPIC9K,pPIC9K-His,pPIC3.5K,pPICZalphaA,B,C,pPICZA,B,C,pGAPZαA,pAO815,pPIC9k-His,pHIL-S1,pPink hc，配套毕赤酵母Pichiapink,毕赤酵母宿主X33，KM71，KM71H，GS115，原核表达载体pQE30,31,32,40,60,61,62,等原核表达载体,包括pET系列，pET-GST，pGEX系列（含GST标签），pMAL系列pMAL-c2x,-c4x,-c4e,-c5x,-p5x,pBAD,pBADHis,pBADmycHis系列，pQE系列,pTrc99a,pTrcHis系列，pBV220,221,222,pTXB系列，pLLP-ompA,pIN-III-ompA （分泌型表达系列）,pQBI63（原核表达带荧光）pET3a, pET 3d, pET 11a, pET 12a, pET 14b, pET 15b, pET 16b, pET 17b, pET 19b, pET 20b, pET 21a,b,d, pET 22b, pET 23a, pET 23b, pET 24a,b, pET 25b, pET 26b, pET 27b, pET 28a,b, pET 29a, pET 30a, pET 31b, pET 32a, pET 35b, pET 38b, pET 39b, pET 40b, pET 41a,b pET 42a, pET 43.1a,b pET 44a, pET 49b pET302,303 pET His,pET Dsb,pET GST,pET Trx pQE2, pQE9 pQE30,31,32, pQE 40pQE70 pQE80L pQETirs system pRSET-A pRSET-B pRSET-C pGEX4T-1,-2,-3,5x-1,6p-1,6p-2,2tk,3c pBV220,221,222 pTrcHisA,B,C pBAD24,34,43 pBAD HisA,B,C pPinPoint-Xa1,Xa2,Xa3 pMALc2x, p2x pBV220 pGEM Ex1, pGEM7ZF（+）, pTrc99A, pTwin1, pEZZ18 pkk232-8,pkk233-3,pACYC184,pBR322,pUC119pTYB1,pTYB2,pTYB4,pTYB11 pBlueScript SK （+）,pBlueScript SK （-）pLLP ompA, pINIIIompA, pMBP-P ,pMBP-C, 大肠杆菌冷激质粒： pColdI pColdII pColdIII pColdTF 原核共表达质粒：pACYCduet-1,pETduet-1,pCDFduet-1，pRSFduet-1 Takara公司大肠杆菌分子伴侣： pG-KJE8 pGro7 pKJE7 pGTf2 pTf16 大肠杆菌宿主细胞： DH5a JM101 JM103JM105 JM107 JM109 JM110 Top10 Top10F BL21（DE3）HB101 ER2529 E2566 C2566 MG1655 XL-10gold XL blue M15 JF1125 K802 SG1117 BL21（AI）BL21（DE3）plysS TG1 TB1 DH5a（pir）Tuner（DE3）Bl21 codonplusRIPL Novablue （DE3）Rosetta Rosetta（DE3）Rosetta（DE3）plys Rosetta-gami（DE3）Rosetta-gamiB（DE3）, Rosetta-gamiB（DE3）plysS Orgami （DE3）OrgamiB（DE3）HMS174（DE3）植物表达/RNAi载体农杆菌pBI121,pBI121-GFP,pBI101,pBI221,pSN1301,pUN1301,pRTL2 , pRTL2-GFP , pRTL2-CFP, pRTL2-RFP , pRTL2-YFP,pCAMBIA 1300, 1301, 1302,1303,1304,1305, 1381Z,1391Z,2300, 2301,3300,3301,pCAMBIA super1300,pCAMBIAsuper1300-GFP,pPZP212,pPZP2121,pPZP212-GFP,pGDG,RNAi载体pART27,pHANNIBAL,pKANNIBAL, pFGC5941,pTCK303, pTRV1,pTRV2,T-DNA插入载体（随机突变体库）pSKI015,pSKI074,真菌ATMT载体pBIG2RHPH2-GUS-GFP,pBHt1枯草芽孢杆菌表达载体pWB980,pHT43,pHP13,pHP43,pBE2,pMUTIN4,pUB110,pE194,pMA5,pMK3,pMK4,pHT304,pHY300PLK,pBest502,pDG1363,pSG1154,pAX01, pSAS144,pDL,pDG148-stu,pDG641,pAL12,pUCX05-bgaB,pHT01，配套菌株BS 168,WB600,WB800,WB700,WB800N,1012,FZB42,1A747,广宿主质粒pVLT33RNAi基因沉默干扰敲除载体pSilencer1.0，pSilencer 2.1-U6 hygro，pSilencer 3.1-H1 hygro，pSilencer 3.1-H1 neo，pSilencer 4.1-CMV neo， pSilencer 4.1-CMV puro pMIR-REPORT Luciferase RNAi载体（oligoengine）pSuper-puro RNAi逆转录病毒载体（clontech）: RNAi-Ready pSIREN-Retro Q， RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen（Luciferase shRNA Annealed Oligonucleotide）RNAi慢病毒载体（addgene）: pLKO.1 哺乳动物表达载体pcDNA3.1+/-,pcDNA4/HisMax B，pSecTag2 A，pVAX1，pBudCE4.1,pTracer CMV2，pcDNA3.1（-）/myc-His A ，pcDNA6-Myc/His B，pCEP4， pIRES，pIRESneo，pIRES hyg3，pCMV-myc，pCMV-HA，pIRES-puro3，pIRES-neo3,pCAGGS哺乳动物双杂交系统pACT，pBIND，pACT-MyoD，pBIND-Id，pG5luc,pCMV-BD, pCMV-AD, pBD-p53, pFR-luc,Cytotrap Two-Hybrid System:pSos, pSos MAFB, pMyr蜕皮激素诱导系统pIND, pVgRxR,LacSwith II哺乳动物诱导表达系统:pOPRSVI ，pOPI3CAT，pCMVLacI,GeneSwitch System:pSwitch哺乳动物表面展示系统:pDisplay, 四环素调控系统（Invitrogen）：pcDNA4/TO/Myc-His A，pcDNA4/TO/Myc-His B，pcDNA4/TO/Myc-His C，pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ，pcDNA6/TR四环素调控系统（Clontech）：pTet-On，pTet-Off，pTRE2,pRevTRE，pRevTet-On，pRevT et-off信号通路报告载体:pGAS-TA-Luc，pSTAT3-TA-Luc, pISRE-TA-Luc, pTA-Luc，pIκB-EGFP，pNFAT-TA-Luc，pCaspase3-sensor，pAP1（PMA）-Luc;pGL4.26[luc2P/minP/Hygro],pGL4.29[luc2P/CRE/Hygro],pGL 4.30[luc2P/NFA T-RE/Hygro]，pGL4.75;p53-Luc，pAP-1-Luc，pNF-κB-Luc，pSRE-Luc，pFA2-Elk1，pFC-MEKK，pFR-luc,Gateway系统（invitrogen）pcDNA6.2-GWEmGFP-miR negative, pLenti 6/TR,pcDNA 6.2-GW EmGFP-miR，乳酸菌表达载体及各种乳酸菌乳酸杆菌菌株，pNZ8148,pLEISS,pMG36e,pBBR1MCS-5,pBBR1MCS-6,pRV610,pLEM415,pHY3 00PLK,分泌型乳酸菌表达载体pVE5523，pPG611.1,pPG612.1等和乳酸杆菌菌株宿主菌NZ9000,MG1363,Lactobacillus casei 1.539,Lactobacillus casei,acidophilus NCFM,1.2,Lactobacillus sakei 23K,L.plantarum,L.rhamnosusGG,B.coagulans,Bifidobacterium bifidum,Bifidobacterium infantis,Lactococcus lactis M17,1663,Lactobacillus reuterii 广宿主表达载体链球菌表达敲除载体假单胞菌表达载体pVLT33,pBBR1MCS-2,3,4,5,6, pJRD215,pJN105,pME6032,Cos 载体pLAFR3,pMP2444（GFP）, pHY300PLK,pRT102,pRL1063a, 转座子载体pUT-miniTn5,pMGS100, pWHM10,pKC1139,pSET152,pOJ260,pPG611.1,pPG612.1，腺病毒载体/慢病毒，逆转录病毒表达载体及包装包膜质粒，腺病毒系统（Stratagene）: pAdEasy-1,pShuttle-CMV,pShuttle,pAdTrack, pAdTrack-CMV, pShuttle-IRES-hrGFP-1、pShuttle-IRES-hrGFP-2、pShuttle-CMV-lacZ,pShuttle-CMV-EGFP-C,pXC1, pBHGE3, 配套大肠杆菌BJ5183,293,293T cellline 腺相关病毒系统（Stratagene）：pAAV-MCS，pAAV-RC，pHelper，pAAV-LacZ，pAAV-IRES-hrGFP，pCMV-MCS，慢病毒载体:pLVX-DsRed-Monomer-N1,pLVX-IRES-ZsGreen1,pLVX-AcGFP1-N1,Lenti6/v 5-EDST-EGFP,pWPXL, FUGW,pLentilox 3.7,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q,RNAi-Ready pSIREN-Retro Q-ZsGreen,pSUPER.Retro-GFP/Neo,pSUPER-Retro-Neo, pSUPER.Retro-puro,PLNCX PLNCX2 pMSCV-HYG pMSCV-neo pMSCV-puro pLEGFP-C1 pLOX-CW-CRE pLOX-GFP-IRES-TK pRetroX-IRES-DsRedExpress, pLVX-IRES-mCherry质粒载体。
双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化
双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的构建及转化石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【摘要】【目的】构建双元植物表达载体,通过遗传转化提高植物的抗逆能力。
【方法】将从超旱生、耐盐植物梭梭（Haloxylon ammodendron）中克隆得到的HaBADH基因,定向导入植物表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS中,以HaCMO替换pCAMBIA2300-HaBADH中的抗性基因NPTⅡ,构建双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并通过农杆菌介导法将其转入粳稻品种＂优引三号＂,对所获得的转基因植株进行PCR检验。
【结果】成功构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,并获得了携带有pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO的水稻阳性植株5株,经PCR检测,转入成功。
【结论】将梭梭抗逆基因HaBADH和HaCMO构建到一个表达载体中,并成功转化水稻,为转入基因后水稻植株内甜菜碱合成和积累过程的深入分析提供了条件。
%【Objective】The study was done to construct a binary expression vector to improve stress-tolerance of target plants by genetic transformation.【Method】 We introduced HaBADH directly into plant expression vector pCAMBIA2300-35S-OCS,and replaced NPTⅡ with HaCMO,and constructed a binary expression vector.HaBADH and HaCMO were both cloned by our laboratory and pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO was transformed into rice Youyin-3 by Agrobacterium-mediated transformation and transgenatic plants were detected with PCR.【Result】 We constructed the plant binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO successfully,and obtained 5 transgenic rice plants which contained the vector by PCRanalysis.【Conclusion】 This study introduces HaBADH and HaCMO to pCAMBIA2300-35S-OCS,and constructs a binary expression vector pCAMBIA2300-HaBADH-HaCMO,and transforms it to rice,which prepares for study synthesis and accumulation of glycine betaine in transgenetic rice.【期刊名称】《西北农林科技大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(040)006【总页数】8页(P210-216,223)【关键词】梭梭;甜菜碱醛脱氢酶;胆碱单加氧酶【作者】石磊;周晓燕;甘晓燕;马洪爱;宋玉霞【作者单位】宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002 宁夏大学生命科学学院,宁夏银川750021;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002;宁夏农业生物重点实验室,宁夏银川750002【正文语种】中文【中图分类】Q782在盐渍、干旱等渗透胁迫情况下，许多高等植物会在细胞内大量合成并积累一些有机渗透调节物质，如山梨醇、甘露醇、脯氨酸、甜菜碱等，以提高自身抵抗盐渍、干旱等胁迫的能力。
真核细胞常见表达载体
真核细胞常见表达载体真核细胞, 表达载体1、pCMVp-NEO-BAN载体特点：该真核细胞表达载体分子量为6600碱基对，主要由CMVp启动子、兔β-球蛋白基因内含子、聚腺嘌呤、氨青霉素抗性基因和抗neo基因以及pBR322骨架构成，在大多数真核细胞内都能高水平稳定地表达外源目的基因。
更重要的是，由于该真核细胞表达载体中抗neo基因存在,转染细胞后，用G418筛选，可建立稳定的、高表达目的基因的细胞株。
插入外源基因的克隆位点包括Sal1、BamH1和EcoR1位点。
注意在此载体中有二个EcoR1位点存在。
2、pEGFP，增强型绦色荧光蛋白表达载体（Enhanced Fluorecent Protein Vector)特点：pEGFP表达载体中含有绿色荧光蛋白，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达。
载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。
Neo抗性盒由SV40早期启动子、Tn5的neomycin/kanamycin抗性基因以及HSV—TK基因的聚腺嘌呤信号组成，能应用G418筛选稳定转染的真核细胞株。
此外，载体中的pUC origin 能保证该载体在大肠杆菌中的复制，而位于此表达盒上游的细菌启动子能驱动kanamycin抗性基因在大肠杆菌中的表达.用途: 该表达载体EGFP上游有Nde1、Eco47111和Age1克隆位点,将外源基因扦入这些位点,将合成外源基因和EGFP的融合基因。
借此可确定外源基因在细胞内的表达和/或组织中的定位.亦可用于检测克隆的启动子活性（取代CMV启动子,Acet1-Nhe1）。
3、pEGFT-Actin，增强型绿色荧光蛋白/人肌动蛋白表达载体特点:pEGFP—Actin表达载体中含有绿色荧光蛋白和人胞浆β-肌动蛋白基因，在PCMV启动子驱动下，在真核细胞中高水平表达.载体骨架中的SV40origin使该载体在任何表达SV40 T抗原的真核细胞内进行复制。