pAAV-CAG-GFP腺病毒载体说明(图)
uPA基因重组GFP-腺相关病毒载体质粒的构建及其表达
ｕＰＡ基因重组ＧＦＰ－腺相关病毒载体质粒的构建及其表达摘要：利用基因重组技术，用RT-PCR法从幼鼠肾脏获得μPA cDNA，再克隆到质粒pAAv-IRES-hrGFP的多克隆位点，构建重组质粒pAA V-hrGFP-uPA，通过酶切和DNA测序鉴定重组质粒的正确性，采用磷酸钙共沉淀法，以重组质粒pAAv-hrCFP-uPA和pAAv-RC、pHelper共转染AAv-293细胞，产生具有传染性的病毒颗粒；用斑点杂交法测定重组病毒颗粒的滴度，再将此病毒颗粒体外转染到培养的肾小管细胞中，倒置荧光显微镜观察GFP的表达，用免疫组化法检测转染的uPA蛋白表达，结果表明：成功地构建uPA基因GFP-腺相关病毒重组质粒，病毒滴度达每mL4×1013病毒颗粒，60％～70％肾小管细胞感染了病毒颗粒，感染的肾小管细胞能稳定、高效表达外源uPA蛋白，为今后建立AA V－uPA 基因治疗肾纤维化的模型奠定了良好的基础。
关键词：uPA；GFP；腺相关病毒载体；基因转染尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase typeplasminogen activator，uPA)自身有直接降解基底膜及细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的作用，uPA还可通过激活纤溶酶及基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)降解ECM，uPA 激活肝细胞生长因子间接对损伤肾脏起保护作用，因此uPA在降解ECM、逆转纤维化方面起重要作用，肾脏纤维化的病理改变主要是肾小球硬化和，肾小管间质纤维化，是肾脏ECM合成与降解失衡，导致ECM过度积聚的结果，因此，我们设想采用高效表达载体-腺相关病毒(adeno-associatedvirus，AA V)载体，将uPA基因全长序列转移到有纤维化病变的部位，以增强病变局部uPA的表达，发挥其降解ECM的作用，从而缓解肾纤维化的进程，为临床治疗肾脏纤维化提供理论基础。
腺病毒载体操作手册中文版解析
腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。
腺病毒载体工艺平台介绍(PPT37张)
LMP2
CDC病毒病所委托 源兴承担药学研究
2019/4/11
基因药物研发中心
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新药申报三方面研究内容 • 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
2019/4/11
基因药物研发中心
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药学研究主要内容 • • • • • • • 上游构建及鉴定 细胞/毒种研究及三级库建立 原液工艺研究 制剂工艺研究 检测方法及质量标准研究 稳定性研究 试制三批样品
2019/4/11
基因药物研发中心
11
管理制度 • 建立了300多个SOP、SMP等标准程 序和规章管理制度，按照GMP要求 严格规范管理。
2019/4/11
基因药物研发中心
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研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药 物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中 试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可 以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和 临床用样品制备的要求。 • 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新 药研发及生产的技术基础。 • 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批， 注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生 产能力。 • 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检 结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标 准要求。
20211122?基因药物研发中心研发中心已完成申报临床所需药学研究的品种品种代号研究单位研究时间治疗性重组hbv腺病毒疫2004年3月至2005年11月治疗性hiv腺病毒载体疫苗h302005年12月至2007年8月治疗性重组腺病毒eb病毒潜伏膜抗原疫苗lmp2cdc病毒病所委托源兴承担药学研究2007年9月至2008年10月20211122?基因药物研发中心新药申报三方面研究内容安全评价20211122?基因药物研发中心药学研究主要内容试制三批样品20211122?基因药物研发中心细胞及毒种研究毒种检定代次及遗传稳定性研究20211122?基因药物研发中心建细胞库原始细胞细胞来源于atcc主细胞库质量控制工作细胞库质量控制细胞扩增细胞扩增20211122?基因药物研发中心工作种子批病毒扩增原始种子批主种子批鉴定检病毒扩增20211122?基因药物研发中心原液工艺流程参数及技术指标sepharosefastflow分子筛层析回收率3批平均重组腺病毒种子罐收获物超滤浓缩液source30q阴离子交换柱层析层析收集液6000rpm离心20min500k膜超滤浓缩10倍细胞种子细胞罐扩增5l罐细胞培养病毒扩增
pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐hSyn-‐RFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。
稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A CCCTTGATG T TTTCTTTCC C CTTCTTTTC T ATGGTTAAG T TCATGTCAT A GGAAGGGGA781 G AAGTAACAG G GTACACATA T TGACCAAAT C AGGGTAATT T TGCATTTGT A ATTTTAAAA841 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC901 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA961 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC1021 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA1081 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC1141 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT1201 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GCACGTGAA T TCGAAGATC T GGCCGCCTC1261 G GCCTCTAGA A CTAGTGGAT C CCCCGGGCT G CAGGAATTC G ATGCTACCG G TCGCCACCA1321 T GGCCTCCTC C GAGGACGTC A TCAAGGAGT T CATGCGCTT C AAGGTGCGC A TGGAGGGCT 1381 C CGTGAACGG C CACGAGTTC G AGATCGAGG G CGAGGGCGA G GGCCGCCCC T ACGAGGGCA 1441 C CCAGACCGC C AAGCTGAAG G TGACCAAGG G CGGCCCCCT G CCCTTCGCC T GGGACATCC 1501 T GTCCCCCCA G TTCCAGTAC G GCTCCAAGG T GTACGTGAA G CACCCCGCC G ACATCCCCG1561 A CTACAAGAA G CTGTCCTTC C CCGAGGGCT T CAAGTGGGA G CGCGTGATG A ACTTCGAGG 1621 A CGGCGGCGT G GTGACCGTG A CCCAGGACT C CTCCCTGCA G GACGGCTCC T TCATCTACA1681 A GGTGAAGTT C ATCGGCGTG A ACTTCCCCT C CGACGGCCC C GTAATGCAG A AGAAGACTA 1741 T GGGCTGGGA G GCCTCCACC G AGCGCCTGT A CCCCCGCGA C GGCGTGCTG A AGGGCGAGA 1801 T CCACAAGGC C CTGAAGCTG A AGGACGGCG G CCACTACCT G GTGGAGTTC A AGTCCATCT 1861 A CATGGCCAA G AAGCCCGTG C AGCTGCCCG G CTACTACTA C GTGGACTCC A AGCTGGACA 1921 T CACCTCCCA C AACGAGGAC T ACACCATCG T GGAGCAGTA C GAGCGCGCC G AGGGCCGCC 1981 A CCACCTGTT C CTGTAGCGG C CAAATGAAT T CCCAAACCG T ACGGGAAAC G GCCCTATTC2041 T ATAGTGTCA C CTAAATGCT A GAGCTCGCT G ATCAGCCTC G ACTGTGCCT T CTAGTTGCC2101 A GCCATCTGT T GTTTGCCCC T CCCCCGTGC C TTCCTTGAC C CTGGAAGGT G CCACTCCCA2161 C TGTCCTTTC C TAATAAAAT G AGGAAATTG C ATCGCATTG T CTGAGTAGG T GTCATTCTA2221 T TCTGGGGGG T GGGGTGGGG C AGGACAGCA A GGGGGAGGA T TGGGAAGAC A ATAGCGCGG 2281 C CGCTCTAGA G CATGGCTAC G TAGATAAGT A GCATGGCGG G TTAATCATT A ACTACAAGG 2341 A ACCCCTAGT G ATGGAGTTG G CCACTCCCT C TCTGCGCGC T CGCTCGCTC A CTGAGGCCG2401 G GCGACCAAA G GTCGCCCGA C GCCCGGGCT T TGCCCGGGC G GCCTCAGTG A GCGAGCGAG 2461 C GCGCAGCTG G CGTAATAGC G AAGAGGCCC G CACCGATCG C CCTTCCCAA C AGTTGCGCA2521 G CCTGAATGG C GAATGGCGA T TCCGTTGCA A TGGCTGGCG G TAATATTGT T CTGGATATT 2581 A CCAGCAAGG C CGATAGTTT G AGTTCTTCT A CTCAGGCAA G TGATGTTAT T ACTAATCAA 2641 A GAAGTATTG C GACAACGGT T AATTTGCGT G ATGGACAGA C TCTTTTACT C GGTGGCCTC 2701 A CTGATTATA A AAACACTTC T CAGGATTCT G GCGTACCGT T CCTGTCTAA A ATCCCTTTA2761 A TCGGCCTCC T GTTTAGCTC C CGCTCTGAT T CTAACGAGG A AAGCACGTT A TACGTGCTC 2821 G TCAAAGCAA C CATAGTACG C GCCCTGTAG C GGCGCATTA A GCGCGGCGG G TGTGGTGGT 2881 T ACGCGCAGC G TGACCGCTA C ACTTGCCAG C GCCCTAGCG C CCGCTCCTT T CGCTTTCTT2941 C CCTTCCTTT C TCGCCACGT T CGCCGGCTT T CCCCGTCAA G CTCTAAATC G GGGGCTCCC3001 T TTAGGGTTC C GATTTAGTG C TTTACGGCA C CTCGACCCC A AAAAACTTG A TTAGGGTGA 3061 T GGTTCACGT A GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA C GTTGGAGTC 3121 C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC C TATCTCGGT3181 C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA A AAATGAGCT3241 G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGCTTACAA T TTAAATATT3301 T GCTTATACA A TCTTCCTGT T TTTGGGGCT T TTCTGATTA T CAACCGGGG T ACATATGAT3361 T GACATGCTA G TTTTACGAT T ACCGTTCAT C GATTCTCTT G TTTGCTCCA G ACTCTCAGG3421 C AATGACCTG A TAGCCTTTG T AGAGACCTC T CAAAAATAG C TACCCTCTC C GGCATGAAT 3481 T TATCAGCTA G AACGGTTGA A TATCATATT G ATGGTGATT T GACTGTCTC C GGCCTTTCT3541 C ACCCGTTTG A ATCTTTACC T ACACATTAC T CAGGCATTG C ATTTAAAAT A TATGAGGGT3601 T CTAAAAATT T TTATCCTTG C GTTGAAATA A AGGCTTCTC C CGCAAAAGT A TTACAGGGT 3661 C ATAATGTTT T TGGTACAAC C GATTTAGCT T TATGCTCTG A GGCTTTATT G CTTAATTTT3721 G CTAATTCTT T GCCTTGCCT G TATGATTTA T TGGATGTTG G AATCGCCTG A TGCGGTATT3781 T TCTCCTTAC G CATCTGTGC G GTATTTCAC A CCGCATATG G TGCACTCTC A GTACAATCT3841 G CTCTGATGC C GCATAGTTA A GCCAGCCCC G ACACCCGCC A ACACCCGCT G ACGCGCCCT 3901 G ACGGGCTTG T CTGCTCCCG G CATCCGCTT A CAGACAAGC T GTGACCGTC T ccgggagct3961 g catgtgtca g aggttttca c cgtcatcac c gaaacgcgc g agACGAAAG G GCCTCGTGA4021 T ACGCCTATT T TTATAGGTT A ATGTCATGA T AATAATGGT T TCTTAGACG T CAGGTGGCA 4081 C TTTTCGGGG A AATGTGCGC G GAACCCCTA T TTGTTTATT T TTCTAAATA C ATTCAAATA4141 T GTATCCGCT C ATGAGACAA T AACCCTGAT A AATGCTTCA A TAATATTGA A AAAGGAAGA 4201 G TATGAGTAT T CAACATTTC C GTGTCGCCC T TATTCCCTT T TTTGCGGCA T TTTGCCTTC4261 C TGTTTTTGC T CACCCAGAA A CGCTGGTGA A AGTAAAAGA T GCTGAAGAT C AGTTGGGTG 4321 C ACGAGTGGG T TACATCGAA C TGGATCTCA A CAGCGGTAA G ATCCTTGAG A GTTTTCGCC 4381 C CGAAGAACG T TTTCCAATG A TGAGCACTT T TAAAGTTCT G CTATGTGGC G CGGTATTAT 4441 C CCGTATTGA C GCCGGGCAA G AGCAACTCG G TCGCCGCAT A CACTATTCT C AGAATGACT 4501 T GGTTGAGTA C TCACCAGTC A CAGAAAAGC A TCTTACGGA T GGCATGACA G TAAGAGAAT 4561 T ATGCAGTGC T GCCATAACC A TGAGTGATA A CACTGCGGC C AACTTACTT C TGACAACGA 4621 T CGGAGGACC G AAGGAGCTA A CCGCTTTTT T GCACAACAT G GGGGATCAT G TAACTCGCC 4681 T TGATCGTTG G GAACCGGAG C TGAATGAAG C CATACCAAA C GACGAGCGT G ACACCACGA 4741 T GCCTGTAGC A ATGGCAACA A CGTTGCGCA A ACTATTAAC T GGCGAACTA C TTACTCTAG 4801 C TTCCCGGCA A CAATTAATA G ACTGGATGG A GGCGGATAA A GTTGCAGGA C CACTTCTGC 4861 G CTCGGCCCT T CCGGCTGGC T GGTTTATTG C TGATAAATC T GGAGCCGGT G AGCGTGGGT 4921 C TCGCGGTAT C ATTGCAGCA C TGGGGCCAG A TGGTAAGCC C TCCCGTATC G TAGTTATCT 4981 A CACGACGGG G AGTCAGGCA A CTATGGATG A ACGAAATAG A CAGATCGCT G AGATAGGTG 5041 C CTCACTGAT T AAGCATTGG T AACTGTCAG A CCAAGTTTA C TCATATATA C TTTAGATTG5101 A TTTAAAACT T CATTTTTAA T TTAAAAGGA T CTAGGTGAA G ATCCTTTTT G ATAATCTCA5161 T GACCAAAAT C CCTTAACGT G AGTTTTCGT T CCACTGAGC G TCAGACCCC G TAGAAAAGA 5221 T CAAAGGATC T TCTTGAGAT C CTTTTTTTC T GCGCGTAAT C TGCTGCTTG C AAACAAAAA5281 A ACCACCGCT A CCAGCGGTG G TTTGTTTGC C GGATCAAGA G CTACCAACT C TTTTTCCGA5341 A GGTAACTGG C TTCAGCAGA G CGCAGATAC C AAATACTGT T CTTCTAGTG T AGCCGTAGT 5401 T AGGCCACCA C TTCAAGAAC T CTGTAGCAC C GCCTACATA C CTCGCTCTG C TAATCCTGT5461 T ACCAGTGGC T GCTGCCAGT G GCGATAAGT C GTGTCTTAC C GGGTTGGAC T CAAGACGAT 5521 A GTTACCGGA T AAGGCGCAG C GGTCGGGCT G AACGGGGGG T TCGTGCACA C AGCCCAGCT 5581 T GGAGCGAAC G ACCTACACC G AACTGAGAT A CCTACAGCG T GAGCTATGA G AAAGCGCCA 5641 C GCTTCCCGA A GGGAGAAAG G CGGACAGGT A TCCGGTAAG C GGCAGGGTC G GAACAGGAG 5701 A GCGCACGAG G GAGCTTCCA G GGGGAAACG C CTGGTATCT T TATAGTCCT G TCGGGTTTC 5761 G CCACCTCTG A CTTGAGCGT C GATTTTTGT G ATGCTCGTC A GGGGGGCGG A GCCTATGGA 5821 A AAACGCCAG C AACGCGGCC T TTTTACGGT T CCTGGCCTT T TGCTGGCCT T TTGCTCACA5881 T GTTCTTTCC T GCGTTATCC C CTGATTCT//pAAV-‐hSyn-‐RFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFPpAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCSpShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMVpAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺相关病毒操作手册--汉恒生物
汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。
AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。
基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。
rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。
图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。
AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。
pBHGloxdelE13cre腺病毒载体说明(图)
pBHGloxdelE13cre编号 载体名称 北京华越洋VECT10032 pBHGloxdelE13crepBHGloxdelE13cre载体基本信息：载体名称: pBHGloxdelE13cre质粒类型: 哺乳细胞表达；腺病毒载体高拷贝/低拷贝: -‐-‐启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 34707bp5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: -‐-‐载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素(Ampicillin)筛选标记: -‐-‐备注: -‐-‐稳定性: -‐-‐组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pBHGloxdelE13cre载体质粒图谱和多克隆位点信息pBHGloxdelE13cre其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
pAAV-hrGFP腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐hrGFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10048 pAAV-‐hrGFPpAAV-‐hrGFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hrGFP， pAAV h rGFP, p AAVhrGFP质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV载体大小: 5.3 k b3‘ 端测序引物: Beta-‐globin-‐F：ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC 5‘ 端测序引物: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hrGFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hrGFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
腺病毒载体产品
产品——腺病毒产品（Adv）腺病毒载体质粒携带报告基因的腺病毒载体（Ad5、Ad5F35）携带治疗基因的腺病毒AdMax腺病毒载体包装系统腺病毒相关检测试剂腺病毒载体质粒在AdMax TM腺病毒载体包装系统中，Kit D为广大科研学者常选用的试剂盒之一。
为了方便研究者使用，本公司可单独提供该试剂盒中的pDC315、pDC316、pDC311、pDC312腺病毒载体质粒。
pDC315和pDC316的区别在于多克隆位点的差异，pDC311和pDC312与前两者的区别是无CMV和poly A，方便插入完整表达盒。
客户可根据质粒构建需要任意选择。
pDC315和pDC316载体质粒除了可以作为腺病毒包装的穿梭质粒外，还可以作为真核表达质粒。
pDC316-EGFP-U6 是siRNA通用腺病毒载体质粒。
它是以pDC316 质粒为骨架改造的，启动子是人U6 启动子，同时表达EGFP，便于示踪和估计转导效率。
请点击下面链接：>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC315（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC316（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC311（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体穿梭质粒pDC312（AdMax Kit D）说明书[pdf]>>> 腺病毒载体siRNA穿梭质粒pDC316-EGFP-U6说明书[pdf]目录号产品名称Promoter Poly A 浓度规格价格Ad0001 pDC316-EGFP-U6 hU6 --- 1ug/ul 10ul 4000.00PD-01-25 pDC311 无无1ug/ul 10ul 3000.00PD-01-26 pDC312 无无1ug/ul 10ul 3000.00PD-01-27 pDC315 mCMV SV40 1ug/ul 10ul 3000.00PD-01-28 pDC316 mCMV SV40 1ug/ul 10ul 3000.00携带报告基因的腺病毒载体（Ad5、Ad5F35）公司提供3种报告基因（EGFP，lacZ，Luc）和2种血清型（Ad5, Ad5F35)的腺病毒载体产品。
腺病毒包装操作手册
汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒） 附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。
2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。
3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。
如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。
4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。
5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。
6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。
7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。
➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。
注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。
汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。
b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。
2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。
重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。
通用腺病毒骨架载体pAdEasy-1产品说明书中文版主要用途
通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）产品说明书（中文版）主要用途通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）是一种与穿梭载体在特定细菌中同源重组构建产生重组腺病毒的改造型人腺病毒5型的主干基因分子。
适用于病毒感染性基因疗法的载体。
产品即到即用，性能稳定，重组保证。
技术背景pAdEasy-1腺病毒骨架载体含有人腺病毒5型的大部分基因组，去除E1和E3病毒基因，旨在提供外源性DNA 插入整合，同时避免病毒自我复制。
其中E1基因的剔除，使病毒在宿主细胞内失去DNA复制能力，而不能产生传染性病毒颗粒；E3基因的剔除，可以避开宿主的免疫反应。
pAdEasy-1为33.5kb，具有氨苄青霉素抗性，一旦与穿梭载体重组，其抗性消失。
同时具有内切酶Pac1和Cla1的位点。
产品内容载体液（Reagent A）（100纳克/微升）5微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备BJ5183：用于载体转化重组的宿主细胞实验提示1．通常1次转化用量为100纳克2．使用BJ5183进行转化后重组3．建议和线性穿梭载体（1微克）共转染4．建议使用电转为优先5．转化后细菌培养不宜在BJ5183里超过20小时6．转化后的阳性细菌菌落通常比正常菌落小三分之一注意事项1．本产品为5微升（500纳克）规格2．操作时，须戴手套3．严格无菌操作4．载体转化后的菌落越小，转染阳性可能性越高；BJ5183的转化效率通常较之其它细菌要高5．转染的载体越大，转化效率越低，载体拷贝数越低，菌落后续培养越慢；大于40kb的载体，其琼脂平板上的菌落阳性率至多为20％6．不能使用常规质粒抽提方法提取载体；建议使用煮沸法质粒/柯斯质粒DNA快速抽提试剂盒－HL60004，既适合大型质粒提取，又避免质粒切口产生7．使用Pac1（50单位）进行酶切鉴定，其电泳条带为30kb和3kb（或4.5kb）8．pAdEasy-1腺病毒骨架载体基本信息如下：9．本公司提供系列腺病毒试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定重组保证。
腺病毒载体操作手册1407
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2
腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。
连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。
二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。
其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。
pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。
1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。
三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。
该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。
若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。
若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。
随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
pAAV-MCS腺病毒载体说明(图)
pAAV-‐MCS编号 载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息：载体名称: pAAVMCS， pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C ATGGTGATG C GGTTTTGGC 541 A GTACATCAA T GGGCGTGGA T AGCGGTTTG A CTCACGGGG A TTTCCAAGT C TCCACCCCA 601 T TGACGTCAA T GGGAGTTTG T TTTGCACCA A AATCAACGG G ACTTTCCAA A ATGTCGTAA 661 C AACTCCGCC C CATTGACGC A AATGGGCGG T AGGCGTGTA C GGTGGGAGG T CTATATAAG 721 C AGAGCTCGT T TAGTGAACC G TCAGATCGC C TGGAGACGC C ATCCACGCT G TTTTGACCT 781 C CATAGAAGA C ACCGGGACC G ATCCAGCCT C CGCGGATTC G AATCCCGGC C GGGAACGGT 841 G CATTGGAAC G CGGATTCCC C GTGCCAAGA G TGACGTAAG T ACCGCCTAT A GAGTCTATA 901 G GCCCACAAA A AATGCTTTC T TCTTTTAAT A TACTTTTTT G TTTATCTTA T TTCTAATAC961 T TTCCCTAAT C TCTTTCTTT C AGGGCAATA A TGATACAAT G TATCATGCC T CTTTGCACC1021 A TTCTAAAGA A TAACAGTGA T AATTTCTGG G TTAAGGCAA T AGCAATATT T CTGCATATA 1081 A ATATTTCTG C ATATAAATT G TAACTGATG T AAGAGGTTT C ATATTGCTA A TAGCAGCTA 1141 C AATCCAGCT A CCATTCTGC T TTTATTTTA T GGTTGGGAT A AGGCTGGAT T ATTCTGAGT1201 C CAAGCTAGG C CCTTTTGCT A ATCATGTTC A TACCTCTTA T CTTCCTCCC A CAGCTCCTG1261 G GCAACGTGC T GGTCTGTGT G CTGGCCCAT C ACTTTGGCA A AGAATTGGG A TTCGAACAT 1321 C GATTGAATT C CCCGGGGAT C CTCTAGAGT C GACCTGCAG A AGCTTGCCT C GAGCAGCGC 1381 T GCTCGAGAG A TCTACGGGT G GCATCCCTG T GACCCCTCC C CAGTGCCTC T CCTGGCCCT 1441 G GAAGTTGCC A CTCCAGTGC C CACCAGCCT T GTCCTAATA A AATTAAGTT G CATCATTTT1501 G TCTGACTAG G TGTCCTTCT A TAATATTAT G GGGTGGAGG G GGGTGGTAT G GAGCAAGGG 1561 G CAAGTTGGG A AGACAACCT G TAGGGCCTG C GGGGTCTAT T GGGAACCAA G CTGGAGTGC 1621 A GTGGCACAA T CTTGGCTCA C TGCAATCTC C GCCTCCTGG G TTCAAGCGA T TCTCCTGCC1681 T CAGCCTCCC G AGTTGTTGG G ATTCCAGGC A TGCATGACC A GGCTCAGCT A ATTTTTGTT 1741 T TTTTGGTAG A GACGGGGTT T CACCATATT G GCCAGGCTG G TCTCCAACT C CTAATCTCA1801 G GTGATCTAC C CACCTTGGC C TCCCAAATT G CTGGGATTA C AGGCGTGAA C CACTGCTCC 1861 C TTCCCTGTC C TTCTGATTT T GTAGGTAAC C ACGTGCGGA C CGAGCGGCC G CAGGAACCC 1921 C TAGTGATGG A GTTGGCCAC T CCCTCTCTG C GCGCTCGCT C GCTCACTGA G GCCGGGCGA 1981 C CAAAGGTCG C CCGACGCCC G GGCTTTGCC C GGGCGGCCT C AGTGAGCGA G CGAGCGCGC 2041 A GCTGCCTGC A GGGGCGCCT G ATGCGGTAT T TTCTCCTTA C GCATCTGTG C GGTATTTCA 2101 C ACCGCATAC G TCAAAGCAA C CATAGTACG C GCCCTGTAG C GGCGCATTA A GCGCGGCGG 2161 G TGTGGTGGT T ACGCGCAGC G TGACCGCTA C ACTTGCCAG C GCCCTAGCG C CCGCTCCTT 2221 T CGCTTTCTT C CCTTCCTTT C TCGCCACGT T CGCCGGCTT T CCCCGTCAA G CTCTAAATC2281 G GGGGCTCCC T TTAGGGTTC C GATTTAGTG C TTTACGGCA C CTCGACCCC A AAAAACTTG 2341 A TTTGGGTGA T GGTTCACGT A GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA 2401 C GTTGGAGTC C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC 2461 C TATCTCGGG C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA2521 A AAATGAGCT G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGTTTACAA2581 T TTTATGGTG C ACTCTCAGT A CAATCTGCT C TGATGCCGC A TAGTTAAGC C AGCCCCGAC2641 A CCCGCCAAC A CCCGCTGAC G CGCCCTGAC G GGCTTGTCT G CTCCCGGCA T CCGCTTACA2701 G ACAAGCTGT G ACCGTCTCC G GGAGCTGCA T GTGTCAGAG G TTTTCACCG T CATCACCGA 2761 A ACGCGCGAG A CGAAAGGGC C TCGTGATAC G CCTATTTTT A TAGGTTAAT G TCATGATAA 2821 T AATGGTTTC T TAGACGTCA G GTGGCACTT T TCGGGGAAA T GTGCGCGGA A CCCCTATTT 2881 G TTTATTTTT C TAAATACAT T CAAATATGT A TCCGCTCAT G AGACAATAA C CCTGATAAA2941 T GCTTCAATA A TATTGAAAA A GGAAGAGTA T GAGTATTCA A CATTTCCGT G TCGCCCTTA3001 T TCCCTTTTT T GCGGCATTT T GCCTTCCTG T TTTTGCTCA C CCAGAAACG C TGGTGAAAG3061 T AAAAGATGC T GAAGATCAG T TGGGTGCAC G AGTGGGTTA C ATCGAACTG G ATCTCAACA 3121 G CGGTAAGAT C CTTGAGAGT T TTCGCCCCG A AGAACGTTT T CCAATGATG A GCACTTTTA3181 A AGTTCTGCT A TGTGGCGCG G TATTATCCC G TATTGACGC C GGGCAAGAG C AACTCGGTC 3241 G CCGCATACA C TATTCTCAG A ATGACTTGG T TGAGTACTC A CCAGTCACA G AAAAGCATC3301 T TACGGATGG C ATGACAGTA A GAGAATTAT G CAGTGCTGC C ATAACCATG A GTGATAACA 3361 C TGCGGCCAA C TTACTTCTG A CAACGATCG G AGGACCGAA G GAGCTAACC G CTTTTTTGC 3421 A CAACATGGG G GATCATGTA A CTCGCCTTG A TCGTTGGGA A CCGGAGCTG A ATGAAGCCA 3481 T ACCAAACGA C GAGCGTGAC A CCACGATGC C TGTAGCAAT G GCAACAACG T TGCGCAAAC 3541 T ATTAACTGG C GAACTACTT A CTCTAGCTT C CCGGCAACA A TTAATAGAC T GGATGGAGG3601 C GGATAAAGT T GCAGGACCA C TTCTGCGCT C GGCCCTTCC G GCTGGCTGG T TTATTGCTG3661 A TAAATCTGG A GCCGGTGAG C GTGGGTCTC G CGGTATCAT T GCAGCACTG G GGCCAGATG 3721 G TAAGCCCTC C CGTATCGTA G TTATCTACA C GACGGGGAG T CAGGCAACT A TGGATGAAC 3781 G AAATAGACA G ATCGCTGAG A TAGGTGCCT C ACTGATTAA G CATTGGTAA C TGTCAGACC 3841 A AGTTTACTC A TATATACTT T AGATTGATT T AAAACTTCA T TTTTAATTT A AAAGGATCT3901 A GGTGAAGAT C CTTTTTGAT A ATCTCATGA C CAAAATCCC T TAACGTGAG T TTTCGTTCC3961 A CTGAGCGTC A GACCCCGTA G AAAAGATCA A AGGATCTTC T TGAGATCCT T TTTTTCTGC4021 G CGTAATCTG C TGCTTGCAA A CAAAAAAAC C ACCGCTACC A GCGGTGGTT T GTTTGCCGG 4081 A TCAAGAGCT A CCAACTCTT T TTCCGAAGG T AACTGGCTT C AGCAGAGCG C AGATACCAA 4141 A TACTGTCCT T CTAGTGTAG C CGTAGTTAG G CCACCACTT C AAGAACTCT G TAGCACCGC4201 C TACATACCT C GCTCTGCTA A TCCTGTTAC C AGTGGCTGC T GCCAGTGGC G ATAAGTCGT4261 G TCTTACCGG G TTGGACTCA A GACGATAGT T ACCGGATAA G GCGCAGCGG T CGGGCTGAA 4321 C GGGGGGTTC G TGCACACAG C CCAGCTTGG A GCGAACGAC C TACACCGAA C TGAGATACC 4381 T ACAGCGTGA G CTATGAGAA A GCGCCACGC T TCCCGAAGG G AGAAAGGCG G ACAGGTATC 4441 C GGTAAGCGG C AGGGTCGGA A CAGGAGAGC G CACGAGGGA G CTTCCAGGG G GAAACGCCT 4501 G GTATCTTTA T AGTCCTGTC G GGTTTCGCC A CCTCTGACT T GAGCGTCGA T TTTTGTGAT4561 G CTCGTCAGG G GGGCGGAGC C TATGGAAAA A CGCCAGCAA C GCGGCCTTT T TACGGTTCC 4621 T GGCCTTTTG C TGGCCTTTT G CTCACATGT//pAAV-‐MCS其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。
慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒系统介绍
度
高 峰 ， 在 体 水 平 在体水平表达较差，
用
物水平需要表达 2 周
约 72hr 达到高峰 约需要 96hr 表达
维持表达时间 3 周
稳定表达
稳定表达，有被 silence 的 稳定表达 6 月以上
风险
滴度
1011 PFU/ml
108 TU/ml
107 TU/ml
1012 v.g./ml
克隆容量
他血清型表达效率弱 非常适合 极低免疫原性
表 1. 四种主流病毒载体系统的特点比较。图表来源：汉恒生物组织整理。
图 3. AAV 基因组结构与 Capsid（Cap）高频突变位点示意图。A. Capsid 晶体结构示意图。其中蛋白 VP1 表面不同颜色的氨基酸基团代表 Cap 高频突变位点。B. Cap 基因结构。其中 Cap ORF 编码 3 个蛋白VP1、VP2 和 VP3。高频突变区域用不同颜色的箭头表示，并对应到图 A 中 Cap 表面不同颜色的氨基酸基 团。C. AAV 基因组结构。图片来源：汉恒生物组织整理。
图 4. 不同的 AAV 血清型对组织或脏器的偏爱性。图片来源：汉恒生物组织整理。
我们综合比较下四种病毒载体系统的特点（表 1）：
病毒表达系统 腺病毒表达系统 慢病毒表达系统 逆转录病毒
腺相关病毒
病毒基因组 dsDNA
ssRNA
ssRNA 病毒
ssDNA
是否整合
不整合
随机整合并稳定遗传 随机整合并稳定遗传
实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础 发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳
定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛 应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。
腺相关病毒包装操作手册
hCHETA-EYFP pHBAAV-hSyneNpHR3.0-EYFP pHBAAV-hSynhChR2(H134R)-mcherry
启动子及其特点
CAG（人巨细胞病毒 启动子 CMV 和鸡 beta-actin 嵌合型启 动子），广谱，强
CMV（人巨细胞病毒启动 子），广谱，强
4) 汉恒生物 AAV-mRFP-GFP-LC3 自噬流监测工具（表 4）
载体 类型 双标 单标
载体名称
pHBAAV-mRFP-GFP-LC3 pHBAAV-GFP-LC3
启动子及其特点
CMV，广谱，强 CMV，广谱，强
标记基因
mRFP/GFP GFP
是否 Cre 依赖 否 否
五、整体实验流程（图 2）
图 1、 AAV2 基因组结构示意图。 四、汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 1. 汉恒 AAV 产品分类：
常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）； 常规启动子和组织特异性启动子驱动的 AAV-Cas9 定制； AAV 介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表 1）； 双标、单标 LC3 自噬流监测工具（见表 2）； 组织特异性 AAV-DIO 载体的定制（原理见附件 2）。 2. 汉恒 AAV 产品特点：
hChR2(H134R)-mcherry
mcherry
否
pHBAAV-GFAP-ArchT-
抑制
EYFP
否
EYFP
GFAP（星形胶质细胞特异
红光 激活
pHBAAV-GFAPC1V1 (t/t)-TS-mcherry
腺病毒载体AVV的作用
腺病毒载体AVV的作用
典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。
pCA13/的HCMV IE啟动子－多克隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源基因的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包装信号φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。
pBHG11因為缺失包装信号及E1区而不能复制，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能复制。
外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。
pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装產生腺病毒颗粒。
该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。
腺病毒PPT课件
10
二、病毒的复制
（一）粘附和进入细胞 腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体 病毒纤毛基底部五邻体与细胞表面结合 通过内吞作 用将腺病毒内化到细胞质中 病毒在含内体的酸性环 境中部分降解 通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内
11
+ 1、腺病毒除了卵细胞以外几乎在所有已 知细胞中都不整合到染色体中，不会干扰 宿主基因。
4
+腺病毒载体的特点
+ ①用它制备成疫苗或表达载体安全性好；②对其结构及 特性的研究较深入，容易复制，操作简单；③重组的腺 病毒载体可获得较高的滴度；④腺病毒无需整合进宿主 细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态 下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低；⑤有较 大的宿主范围，可感染分裂期及非分裂期细胞；⑥腺病 毒载体可以插入7.5kb的外源基因，容量较大；⑦相对稳 定，经得起纯化、浓缩。
——具有日程表的病毒
1
因该病毒最初来自腺体，故命名为腺 病毒 (Adenovirus)。
是一群分布十分广泛，能引起呼吸道、肠粘 膜上皮细胞溶解性感染；可在淋巴样和腺样细胞 中引起潜伏感染，在啮齿动物细胞中引起转化感 染。少数几种腺病毒对实验动物→致癌（12、18 型），有潜在致癌性。
2
型别多，约110个血清型，根据宿主可分鸟腺病毒 属和哺乳类腺病毒,其中至少42个血清型能引起人 类疾病。
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三、病毒的传播
传播途径：“粪——口”途径（胃肠道） 感染对象：儿童为主。 所致疾病：胃肠炎与腹泻。
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四、病毒对宿主防卫的逃逸
+ 1、在病毒感染早期，病毒的两种蛋白阻断激活死 亡程序的细胞基因转录。在感染后期，腺病毒合 成一种“腺病毒死亡蛋白”使被感染细胞破裂， 快速释放出新病毒。
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pAAV-‐CAG-‐GFP编号 载体名称 北京华越洋VECT10004 pAAV-‐CAG-‐GFPpAAV-‐CAG-‐GFP载体基本信息载体名称: pAAV-‐CAG-‐GFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光蛋白报告载体高拷贝/低拷贝: 低拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: CAG (CMV e nhancer/chicken β-‐actin p romoter) 载体大小: 5439 b p5' 测序引物及序列: pCAG f wd p rimer 5’CAACGTGCTGGTTATTGTG 3’ 3' 测序引物及序列: cggcttctggcgtgtgac载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: EGFP克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 常规哺乳动物细胞系备注: -‐-‐稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐CAG-‐GFP载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐CAG-‐GFP载体序列:ORIGIN1 C TTCCGCTTC C TCGCTCACT G ACTCGCTGC G CTCGGTCGT T CGGCTGCGG C GAGCGGTAT61 C AGCTCACTC A AAGGCGGTA A TACGGTTAT C CACAGAATC A GGGGATAAC G CAGGAAAGA 121 A CATGTGAGC A AAAGGCCAG C AAAAGGCCA G GAACCGTAA A AAGGCCGCG T TGCTGGCGT 181 T TTTCCATAG G CTCCGCCCC C CTGACGAGC A TCACAAAAA T CGACGCTCA A GTCAGAGGT241 G GCGAAACCC G ACAGGACTA T AAAGATACC A GGCGTTTCC C CCTGGAAGC T CCCTCGTGC 301 G CTCTCCTGT T CCGACCCTG C CGCTTACCG G ATACCTGTC C GCCTTTCTC C CTTCGGGAA361 G CGTGGCGCT T TCTCATAGC T CACGCTGTA G GTATCTCAG T TCGGTGTAG G TCGTTCGCT421 C CAAGCTGGG C 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pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。