pAAV-IRES-hrGFP腺病毒载体说明(图)

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腺病毒载体操作手册中文版解析

腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒载体工艺平台介绍(PPT37张)

LMP2
CDC病毒病所委托源兴承担药学研究
2019/4/11
基因药物研发中心
14
新药申报三方面研究内容 • 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
2019/4/11
基因药物研发中心
15
药学研究主要内容 • • • • • • • 上游构建及鉴定细胞/毒种研究及三级库建立原液工艺研究制剂工艺研究检测方法及质量标准研究稳定性研究试制三批样品
2019/4/11
基因药物研发中心
11
管理制度 • 建立了300多个SOP、SMP等标准程序和规章管理制度，按照GMP要求严格规范管理。
2019/4/11
基因药物研发中心
12
研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和临床用样品制备的要求。 • 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新药研发及生产的技术基础。 • 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批，注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生产能力。 • 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标准要求。
20211122?基因药物研发中心研发中心已完成申报临床所需药学研究的品种品种代号研究单位研究时间治疗性重组hbv腺病毒疫2004年3月至2005年11月治疗性hiv腺病毒载体疫苗h302005年12月至2007年8月治疗性重组腺病毒eb病毒潜伏膜抗原疫苗lmp2cdc病毒病所委托源兴承担药学研究2007年9月至2008年10月20211122?基因药物研发中心新药申报三方面研究内容安全评价20211122?基因药物研发中心药学研究主要内容试制三批样品20211122?基因药物研发中心细胞及毒种研究毒种检定代次及遗传稳定性研究20211122?基因药物研发中心建细胞库原始细胞细胞来源于atcc主细胞库质量控制工作细胞库质量控制细胞扩增细胞扩增20211122?基因药物研发中心工作种子批病毒扩增原始种子批主种子批鉴定检病毒扩增20211122?基因药物研发中心原液工艺流程参数及技术指标sepharosefastflow分子筛层析回收率3批平均重组腺病毒种子罐收获物超滤浓缩液source30q阴离子交换柱层析层析收集液6000rpm离心20min500k膜超滤浓缩10倍细胞种子细胞罐扩增5l罐细胞培养病毒扩增

pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐hSyn-‐RFP编号载体名称北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。

稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A CCCTTGATG T TTTCTTTCC C CTTCTTTTC T ATGGTTAAG T TCATGTCAT A GGAAGGGGA781 G AAGTAACAG G GTACACATA T TGACCAAAT C AGGGTAATT T TGCATTTGT A ATTTTAAAA841 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC901 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA961 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC1021 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA1081 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC1141 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT1201 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GCACGTGAA T TCGAAGATC T GGCCGCCTC1261 G GCCTCTAGA A CTAGTGGAT C CCCCGGGCT G CAGGAATTC G ATGCTACCG G TCGCCACCA1321 T GGCCTCCTC C GAGGACGTC A TCAAGGAGT T CATGCGCTT C AAGGTGCGC A TGGAGGGCT 1381 C CGTGAACGG C CACGAGTTC G AGATCGAGG G CGAGGGCGA G GGCCGCCCC T ACGAGGGCA 1441 C CCAGACCGC C AAGCTGAAG G TGACCAAGG G CGGCCCCCT G CCCTTCGCC T GGGACATCC 1501 T GTCCCCCCA G TTCCAGTAC G GCTCCAAGG T GTACGTGAA G CACCCCGCC G ACATCCCCG1561 A CTACAAGAA G CTGTCCTTC C CCGAGGGCT T CAAGTGGGA G CGCGTGATG A ACTTCGAGG 1621 A CGGCGGCGT G GTGACCGTG A CCCAGGACT C CTCCCTGCA G GACGGCTCC T TCATCTACA1681 A GGTGAAGTT C ATCGGCGTG A ACTTCCCCT C CGACGGCCC C GTAATGCAG A AGAAGACTA 1741 T GGGCTGGGA G GCCTCCACC G AGCGCCTGT A CCCCCGCGA C GGCGTGCTG A AGGGCGAGA 1801 T CCACAAGGC C CTGAAGCTG A AGGACGGCG G CCACTACCT G GTGGAGTTC A AGTCCATCT 1861 A CATGGCCAA G AAGCCCGTG C AGCTGCCCG G CTACTACTA C GTGGACTCC A AGCTGGACA 1921 T CACCTCCCA C AACGAGGAC T ACACCATCG T GGAGCAGTA C GAGCGCGCC G AGGGCCGCC 1981 A CCACCTGTT C CTGTAGCGG C CAAATGAAT T CCCAAACCG T ACGGGAAAC G GCCCTATTC2041 T ATAGTGTCA C CTAAATGCT A GAGCTCGCT G ATCAGCCTC G ACTGTGCCT T CTAGTTGCC2101 A GCCATCTGT T GTTTGCCCC T CCCCCGTGC C TTCCTTGAC C CTGGAAGGT G CCACTCCCA2161 C TGTCCTTTC C TAATAAAAT G AGGAAATTG C ATCGCATTG T CTGAGTAGG T GTCATTCTA2221 T TCTGGGGGG T GGGGTGGGG C AGGACAGCA A GGGGGAGGA T TGGGAAGAC A ATAGCGCGG 2281 C CGCTCTAGA G 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GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA C GTTGGAGTC 3121 C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC C TATCTCGGT3181 C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA A AAATGAGCT3241 G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGCTTACAA T TTAAATATT3301 T GCTTATACA A TCTTCCTGT T TTTGGGGCT T TTCTGATTA T CAACCGGGG T ACATATGAT3361 T GACATGCTA G TTTTACGAT T ACCGTTCAT C GATTCTCTT G TTTGCTCCA G ACTCTCAGG3421 C AATGACCTG A TAGCCTTTG T AGAGACCTC T CAAAAATAG C TACCCTCTC C GGCATGAAT 3481 T TATCAGCTA G AACGGTTGA A TATCATATT G ATGGTGATT T GACTGTCTC C GGCCTTTCT3541 C ACCCGTTTG A ATCTTTACC T ACACATTAC T CAGGCATTG C ATTTAAAAT A TATGAGGGT3601 T CTAAAAATT T TTATCCTTG C GTTGAAATA A AGGCTTCTC C CGCAAAAGT A TTACAGGGT 3661 C ATAATGTTT T TGGTACAAC C GATTTAGCT T TATGCTCTG A GGCTTTATT G CTTAATTTT3721 G CTAATTCTT T GCCTTGCCT G TATGATTTA T TGGATGTTG G AATCGCCTG A TGCGGTATT3781 T TCTCCTTAC G CATCTGTGC G GTATTTCAC A CCGCATATG G TGCACTCTC A GTACAATCT3841 G CTCTGATGC C GCATAGTTA A GCCAGCCCC G ACACCCGCC A ACACCCGCT G ACGCGCCCT 3901 G ACGGGCTTG T CTGCTCCCG G CATCCGCTT A CAGACAAGC T GTGACCGTC T ccgggagct3961 g catgtgtca g aggttttca c cgtcatcac c gaaacgcgc g agACGAAAG G GCCTCGTGA4021 T ACGCCTATT T TTATAGGTT A ATGTCATGA T AATAATGGT T TCTTAGACG T CAGGTGGCA 4081 C TTTTCGGGG A AATGTGCGC G GAACCCCTA T TTGTTTATT T TTCTAAATA C ATTCAAATA4141 T GTATCCGCT C ATGAGACAA T AACCCTGAT A AATGCTTCA A TAATATTGA A AAAGGAAGA 4201 G TATGAGTAT T CAACATTTC C GTGTCGCCC T TATTCCCTT T TTTGCGGCA T TTTGCCTTC4261 C TGTTTTTGC T CACCCAGAA A CGCTGGTGA A AGTAAAAGA T GCTGAAGAT C AGTTGGGTG 4321 C ACGAGTGGG T TACATCGAA C TGGATCTCA A CAGCGGTAA G ATCCTTGAG A GTTTTCGCC 4381 C CGAAGAACG T TTTCCAATG A TGAGCACTT T TAAAGTTCT G CTATGTGGC G CGGTATTAT 4441 C CCGTATTGA C GCCGGGCAA G AGCAACTCG G TCGCCGCAT A CACTATTCT C AGAATGACT 4501 T GGTTGAGTA C TCACCAGTC A CAGAAAAGC A TCTTACGGA T GGCATGACA G TAAGAGAAT 4561 T ATGCAGTGC T GCCATAACC A TGAGTGATA A CACTGCGGC C AACTTACTT C TGACAACGA 4621 T CGGAGGACC G AAGGAGCTA A CCGCTTTTT T GCACAACAT G GGGGATCAT G TAACTCGCC 4681 T TGATCGTTG G GAACCGGAG C TGAATGAAG C CATACCAAA C GACGAGCGT G ACACCACGA 4741 T GCCTGTAGC A ATGGCAACA A CGTTGCGCA A ACTATTAAC T GGCGAACTA C TTACTCTAG 4801 C TTCCCGGCA A CAATTAATA G ACTGGATGG A GGCGGATAA A GTTGCAGGA C CACTTCTGC 4861 G CTCGGCCCT T CCGGCTGGC T GGTTTATTG C TGATAAATC T GGAGCCGGT G AGCGTGGGT 4921 C TCGCGGTAT C ATTGCAGCA C TGGGGCCAG A TGGTAAGCC C TCCCGTATC G TAGTTATCT 4981 A CACGACGGG G AGTCAGGCA A CTATGGATG A ACGAAATAG A CAGATCGCT G AGATAGGTG 5041 C CTCACTGAT T AAGCATTGG T AACTGTCAG A CCAAGTTTA C TCATATATA C TTTAGATTG5101 A TTTAAAACT T CATTTTTAA T TTAAAAGGA T CTAGGTGAA G ATCCTTTTT G ATAATCTCA5161 T GACCAAAAT C CCTTAACGT G AGTTTTCGT T CCACTGAGC G TCAGACCCC G TAGAAAAGA 5221 T CAAAGGATC T TCTTGAGAT C CTTTTTTTC T GCGCGTAAT C TGCTGCTTG C AAACAAAAA5281 A ACCACCGCT A CCAGCGGTG G TTTGTTTGC C GGATCAAGA G CTACCAACT C TTTTTCCGA5341 A GGTAACTGG C TTCAGCAGA G CGCAGATAC C AAATACTGT T CTTCTAGTG T AGCCGTAGT 5401 T AGGCCACCA C TTCAAGAAC T CTGTAGCAC C GCCTACATA C CTCGCTCTG C TAATCCTGT5461 T ACCAGTGGC T GCTGCCAGT G GCGATAAGT C GTGTCTTAC C GGGTTGGAC T CAAGACGAT 5521 A GTTACCGGA T AAGGCGCAG C GGTCGGGCT G AACGGGGGG T TCGTGCACA C AGCCCAGCT 5581 T GGAGCGAAC G ACCTACACC G AACTGAGAT A CCTACAGCG T GAGCTATGA G AAAGCGCCA 5641 C GCTTCCCGA A GGGAGAAAG G CGGACAGGT A TCCGGTAAG C GGCAGGGTC G GAACAGGAG 5701 A GCGCACGAG G GAGCTTCCA G GGGGAAACG C CTGGTATCT T TATAGTCCT G TCGGGTTTC 5761 G CCACCTCTG A CTTGAGCGT C GATTTTTGT G ATGCTCGTC A GGGGGGCGG A GCCTATGGA 5821 A AAACGCCAG C AACGCGGCC T TTTTACGGT T CCTGGCCTT T TGCTGGCCT T TTGCTCACA5881 T GTTCTTTCC T GCGTTATCC C CTGATTCT//pAAV-‐hSyn-‐RFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFPpAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCSpShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMVpAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。

轮状病毒、腺病毒二合一抗原检测试剂盒(乳胶法)说明书

轮状病毒、腺病毒抗原检测试剂盒（乳胶法）说明书【产品名称】通用名称：康珠生物轮状病毒、腺病毒抗原检测试剂盒（乳胶法）【包装规格】1人份/袋，20袋/盒。

【预期用途】本产品用于体外定性检测婴幼儿腹泻患者粪便中的A群轮状病毒和腺病毒抗原。

人类轮状病毒（Human RotaVirus，HRV）感染是婴儿和小孩重度脱水性胃肠炎最常见的原因，3月龄后的婴儿最可能发生重度腹泻和脱水，几乎所有人在其3~5岁时都感染过HRV。

轮状病毒于1973年被人类认识，Bishop等于在澳大利亚墨尔本腹泻儿童的十二指肠活检物通过电镜检出该病毒。

轮状病毒属于呼肠孤病毒科，为球型无包膜的双股RNA病毒。

腺病毒(adenovirus)是一种没有包膜的直径为70～90 nm的颗粒，由252个壳粒呈廿面体排列构成。

腺病毒是DNA 病毒，主要在细胞核内繁殖，耐温、耐酸、耐脂溶剂的能力较强，一般通过呼吸道传染。

【检验原理】本检测试纸条采用高度特异性的双抗体夹心反应原理及免疫层析分析技术，试纸卡为两窗试纸卡，在试纸卡左边的窗口的试纸条上含有被预先固定于膜上测试区（T）抗A群轮状病毒抗体和质控区（C）的羊抗鼠抗体，乳胶标记垫上包被有乳胶颗粒标记的抗A群轮状病毒单克隆抗体；右边的窗口的试纸条上含有被预先固定于膜上测试区（T）抗腺病毒抗体和质控区（C）的羊抗鼠抗体，乳胶标记垫上包被有乳胶颗粒标记的抗腺病毒单克隆抗体，测试时，标本与预包被在左边的试纸条上的乳胶颗粒标记的抗A群轮状病毒单克隆抗体（或者与预包被在右边的试纸条上的乳胶颗粒标记的抗腺病毒单克隆抗体）混合，并在毛细效应下向上层析。

如是A群轮状病毒阳性，左边试纸条上的乳胶标记抗体在层析过程中先与标本中的A群轮状病毒结合，随后结合物会与固定在膜上的抗A群轮状病毒抗体结合，在测试区（T）内会出现一条红色条带。

这条带是特异性的抗体-抗原-乳胶标记抗体复合物在膜上结合形成的。

如是阴性，则测试区（T）内将没有红色条带。

汉恒腺病毒载体操作手册

4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基 +20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为 3 x 106 个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。
6
汉恒生物公司地址：上海市徐汇区斜土路
E-mail:service@
1175 号 15 楼

T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
四、腺病毒包装、扩增和纯化
（一）腺病毒包装
5118bp
GFP
(NotI ) (NcoI ) (NcoI )
pUC ori
SV40 PolyA LoxP
HindIII
[ SacI SalI
Amp r pUC ori
SacII
XbaI(456)
ITR
ITR
1
(NdeI )
(NdeI )
NheI(1384)
pHB Ad-U6-RFP 4993bp
1
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T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP 和 pHBAd-U6-RFP 能表达红色荧光蛋白（RFP）。
3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。

腺病毒载体AVV的作用

腺病毒载体AVV的作用
典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。

pCA13/的HCMV IE啟动子－多克隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源基因的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包装信号φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。

pBHG11因為缺失包装信号及E1区而不能复制，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能复制。

外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。

pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装產生腺病毒颗粒。

该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。

腺相关病毒操作手册--汉恒生物

汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。

AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。

rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。

腺病毒载体的分类及包装方法

腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。

第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。

第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。

2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。

局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。

注：此方法适用于临床。

(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。

特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。

pAAV-hrGFP腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐hrGFP编号载体名称北京华越洋VECT10048 pAAV-‐hrGFPpAAV-‐hrGFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hrGFP， pAAV h rGFP, p AAVhrGFP质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV载体大小: 5.3 k b3‘ 端测序引物: Beta-‐globin-‐F：ATTCTGAGTCCAAGCTAGGC 5‘ 端测序引物: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hrGFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hrGFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFP pAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐A pAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。

人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达

人乳铁蛋白腺病毒载体的构建及细胞表达作者：韩增胜李健高大威李青旺来源：《湖北农业科学》2008年第06期(燕山大学环化学院生物技术与工程系，河北秦皇岛066004)摘要：将人乳铁蛋白基因与腺病毒基因组骨架质粒重组，在293细胞中包装重组腺病毒颗粒，获得真核细胞表达的载体pAd－hLTF｡以pcDNA3X为模板，PCR扩增hLTF基因，腺病毒穿梭载体pshuttle－cmv与hLTF重组为pshuttle－cmv－hLTF；再与腺病毒骨架质粒pAdEasy－1同源重组为pAd－hLTF质粒；脂质体法将重组pAd－hLTF质粒转染HEK 293细胞，包装成重组腺病毒颗粒｡Western blot和ELISA法测定细胞中hLTF基因的表达｡结果表明，pAd－hLTF质粒转染293细胞后，7～10 d后，获得细胞裂解液，将细胞裂解产物再次接种新鲜的293细胞，3～5 d后，80%以上的细胞变圆､膨胀､漂浮｡Western blot和ELISA结果显示，上清液中有hLTF基因的表达，为重组人乳铁蛋白的体外表达及其功能分析奠定了基础｡关键词：重组人乳铁蛋白；腺病毒载体；重组蛋白质中图分类号：Q513+．2；S852．65+9．1；Q782文献标识码：A文章编号：0439－8114(2008)06－0629－04Construction of Human Lactoferrin Gene Recombinant Adenoviruses and Expression in Eukaryotic CellsHAN Zeng－sheng，LI Jian，GAO Da－wei，LI Qing－wang(Department of Biological Engineering，College of Environment & Chemical Engineering，Yanshan University，Qinhuangdao 066004，Hebei，China)Abstract： To construct the recombinant adenoviral vectors containing human lactoferrin gene，the recombinant adenoviruseswas obtained and expressed the recombinant protein in eukaryotic cells． The human lactoferrin gene was amplified from plasmid pcDNA3X； the gene of interest which contained hLTF gene was cloned into the pshuttle－cmv vector． The resulted vector was named pshuttle－cmv－hltf that was linearized by digesting with restriction endonuclease PmeI， andsubsequently cotransformed into Escherichia coli BJ5183 cells with an adenoviral backbone vector pAdEasy－1； Homologous recombinants were performed in bacterial cells． Finally， the linearized backbone adenoviral vector was transfected into the packaging cells lines HEK 293 cells by lipofectamine 2000 transfection reagents． The expression of human lactoferrin in cells was investigated by Western blot and ELISA methods． After the transfection， seven to ten days later，the cells lyses were collected and added into the separate 293 cells． The cells become roundness，swell and floats． Western blot and ELISA results showed the high expressed human lactoferrin in the cells． These results shown that human lactoferrin gene recombinant adenoviral backbone vector had been constructed successfully． The recombinant adenoviruses pAd－hLTF had been produced by packaging in 293 cells． This study could provide the possibility of further researches on the high －level expression of recombinant proteins．Key words： recombinant human lactoferrin； adenoviral vectors； recombinant protein人乳铁蛋白(human lactoferrin，hLTF)是主要存在于初乳中的一种结合性糖蛋白，由于乳铁蛋白具有许多独特的生物学功能，如广谱的抗菌性及免疫作用､抗氧化作用､抗炎症､抗病毒､抗癌症作用等[1]生物学功能，近年来成为国内外研究的热点｡目前人乳铁蛋白已在多种基因表达系统中获得成功表达，如乳腺[2]､烟草[3]､昆虫[4]､酵母[5]等系统中均表达了hLTF重组蛋白｡但上述表达系统均存在一些缺陷，如转基因乳腺表达需要特异启动子，以及制作转基因动物效率低､成本高，且烟草和酵母基因表达系统所得重组真核蛋白存在生物活性不高和不易纯化的缺点｡为此，有必要探索新的重组人乳铁蛋白的高效表达方法｡腺病毒载体表达系统是近年来应用于人类基因治疗中最为广泛的真核载体表达系统之一｡由于腺病毒载体本身具有安全性好和转基因效率高的优点，被广泛应用于真核基因的表达和癌症的基因治疗中[6]，本研究构建了含有人乳铁蛋白的腺病毒载体，并进行了重组人乳铁蛋白腺病毒在细胞中的表达试验，以期获得可以高效表达的重组人乳铁蛋白腺病毒颗粒，为重组人乳铁蛋白的体外高效表达奠定了基础，也可为其他重组蛋白质的高效表达提供一定的参考｡1材料与方法1．1细胞､菌株及培养HEK 293(人胚胎肾细胞系)来自于中国医学科学院细胞中心，Escherichia coli BJ5183菌株由张智英先生惠赠｡293细胞培养于DMEM基础培养基中添加100 U·mL－1双抗(青霉素100，000 U·mL－1+链霉素100，000 U·mL－1)､1%非必需氨基酸(NAA)(Gibco)､10%胎牛血清(FBS，Hyclone)｡37℃，5% CO2培养箱｡1．2主要试剂限制性内切酶､DNA连接酶､Taq DNA聚合酶等工具酶类均来自大连宝生物工程有限公司；人乳铁蛋白ELISA试剂盒购自美国USBiological公司；脂质体lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；人乳铁蛋白单克隆抗体购自Sigma公司｡1．3重组穿梭载体的构建含有人乳铁蛋白基因的pcDNA3X质粒由我们实验室克隆保存，分别以Kpn I/Xho I消化后，接入以同样酶Kpn I/Xho I消化的pshuttle－cmv载体，获得阳性重组子后，命名为pshuttle －cmv－hltf，并送往上海英俊公司进行测序｡经测序以及限制性内切酶消化重组质粒pshuttle－cmv－hltf鉴定正确后，将其转化DH5α感受态细胞，进行大量扩增，碱裂解法抽提质粒并纯化备用｡1．4腺病毒载体的构建将pshuttle－cmv－hlTF质粒以Pme I酶消化使其线性化，利用PCR产物纯化试剂盒纯化线性化质粒pshuttle－cmv－hlTF，腺病毒骨架质粒pAdEasy－1和线性化质粒pshuttle－cmv－hlTF共转化大肠杆菌BJ5183感受态细胞进行同源重组，限制性内切酶鉴定重组腺病毒载体pAd－LTF｡1．5重组腺病毒的包装将酶切鉴定正确的重组腺病毒载体pAd－LTF进行Pac I酶切消化，胶回收试剂盒回收约33kb大小的片段，将该大片段以脂质体法转染293细胞，转染4 h后，细胞换成完全培养基培养，即DMEM基础培养基中添加10% FBS，37℃，5%CO2培养箱｡每日观察细胞，记录细胞生长状态｡转染7～10 d后，细胞会出现变圆和脱落等现象，小心收集细胞及上清，将细胞反复冻融3次(分别置于液氮和37℃水浴)，离心后获得上清液，即为病毒的初级产物，于－70℃贮存，或直接用于下一步病毒扩增试验｡1．6重组病毒的扩增与鉴定将病毒初级产物接种于细胞生长汇合率为50%～70%的293细胞，感染3～5d后，根据细胞脱落状况判断收获病毒时间，若细胞90%以上出现飘落时，立即收集细胞及上清，同样，将细胞反复冻融3次，最终获得病毒的扩增产物｡而后，取细胞上清液10 μL，加入蛋白酶K，于50℃孵育1 h，离心后取上清为模版，分别进行PCR鉴定｡以hLTF特异引物进行PCR扩增，可获得约2．2kb的目标片段，引物分别为：F11—GGTCTATATAAGCAGAGCTG；R12—CTGATCATAATCAGCCATACCAC｡以腺病毒基因组和hLTF的结合处设计引物，可获得约1．2kb的目标片段，引物分别为：F21—ATTTCAGTCAAAGCTGTGCCCCTG；R22—CTCAGGAAAGCAAAGTCAGTCAC｡1．7重组腺病毒的细胞表达将鉴定正确的pAd－LTF重组腺病毒接种293细胞，感染48 h后，取上清分别进行Western blot和ELISA分析，以检测人乳铁蛋白在细胞中的表达效果｡2结果与分析2．1重组穿梭载体的鉴定将重组的阳性质粒pShuttle－hLTF进行3种不同限制性内切酶分析，所获琼脂糖电泳大小片段与预期的完全一致(图1)｡经送往测序公司的结果分析，所测序列与国际GENEBANK上AY875691和AY178998登录的人乳铁蛋白序列基本一致｡上述结果表明，已正确获得了人乳铁蛋白基因克隆，并已完成了腺病毒穿梭载体的构建｡并可用于下一步重组腺病毒载体的构建｡2．2重组腺病毒载体pAd－hLTF的鉴定利用AdEasy腺病毒骨架系统，在BJ5183细菌内同源重组而获得的腺病毒载体，用PacI 酶切后将会出现3．0kb大小的特异条带，分别以pAdEasy－1质粒为空白对照，同时用PacI消化pAd－hLTF和pAdEasy－1质粒，仅在pAd－hLTF消化产物中出现了约3．0kb大小的特征性小条带(图2)｡证明已成功构建获得重组人乳铁蛋白腺病毒载体pAd－hLTF｡由于重组质粒大于30kb，所以用1%的琼脂糖电泳时大片段容易跑不出，出现部分质粒停留在泳道口的现象，但这不影响结果分析｡2．3重组腺病毒载体转染293细胞结果利用阳离子脂质体法，将PacI消化的pAd－hLTF载体转染293细胞，转染4h后，若在显微镜下看到细胞形状稍有变化，则立即取出脂质体，更换培养基为完全培养基｡继续培养7～10 d后，可看到细胞有明显的变化，主要表现为细胞肿胀､容易脱落和漂浮于培养液中｡待到80%细胞出现上述现象后，收集细胞和上清液，同时进行PCR鉴定初级病毒产物｡分别使用了2对引物进行PCR鉴定，琼脂糖电泳分别获得2．2kb和1．2kb两条片段，结果与预期完全一致(图3)｡2．4pAd－hLTF在细胞中的表达将鉴定正确的pAd－hLTF用于进一步的细胞表达试验，分别于不同接种密度的细胞培养皿中加入pAd－hLTF病毒，于48 h后，开始检测细胞上清中hLTF的表达，以兔抗人乳铁蛋白单克隆抗体为一抗，辣根过氧化酶标记的羊抗兔免疫球蛋白为二抗，Western blot杂交试验结果显示，在约80kD处有一条特异的蛋白条带，与人乳铁蛋白标准品条带一致，表明pAd－hLTF载体在细胞里获得了正确表达(图4)｡同时，利用人乳铁蛋白酶联免疫检测试剂盒(USBiological，USA)，对细胞上清进行了检测，酶标仪450 nm处读数，阴性对照孔值平均0．064 1，阳性标准品对照孔值平均0．235，上清液样品孔值平均为0．243，表明上清液中有较高水平的重组人乳铁蛋白的表达｡3讨论在基因工程技术中，重组蛋白质的表达一直以来是人们所研究的热点之一，特别是随着人类基因组计划的完成，大量的人源性基因急需表达，以便研究其结构和功能｡本研究以人乳铁蛋白为目标基因，成功构建了重组腺病毒载体pAd－hLTF，并在细胞里获得了重组人乳铁蛋白的较高水平的表达｡另外，以腺病毒为载体，我们实验室同时做了人生长激素基因､人红细胞生成素基因和神经生长因子等基因的细胞表达，均获得了重组基因的表达｡由此可揭示出，重组腺病毒表达系统可用于其他真核基因的体外快速表达和鉴定｡构建腺病毒载体的主要思路是删除其早期基因(主要是E1A和E3A)的部分或全部，使外源基因能够通过同源重组的方式进入病毒基因的框架[6]｡外源基因主要进入E1区，因为E1区是病毒复制所必需的，缺失E1区的腺病毒可以在反式提供E1区编码产物的细胞系中，如HEK 293细胞系中复制｡而E3区的缺失主要是为了扩大病毒的包装容量｡本研究中采用pAdEasy腺病毒载体系统，通过细菌同源重组产生腺病毒载体的方法[7]，该方法是利用重组酶缺陷型大肠杆菌(如BJ5183，recBCsbcBC)高效的同源重组机制得以实现的｡该法中的腺病毒骨架质粒包含全长病毒序列(或E3区缺陷)，且末端带有PacI酶切位点(8bp 内切酶识别序列)､氨苄青霉素抗性基因和质粒复制区｡穿梭质粒包含病毒基因组左侧区序列ITR序列､病毒包装信号序列及与E1区下游的一段同源序列｡首先，将构建含有目标基因的穿梭质粒，然后与病毒载体两个质粒载体共转化于recBCsbcBC型大肠杆菌(BJ5183)，挑取单菌落获得阳性重组质粒，经过限制性酶切分析，正确的重组子再转染HEK 293细胞，从而获得重组腺病毒｡该方法可以最大程度避免野生型腺病毒的产生，所以重组成功率较高[6，7]｡另外，细菌内重组的方法无需进行繁琐的病毒空斑化筛选，因而省时省力｡因此，通过本试验pAd－hLTF的成功构建，可为人乳铁蛋白腺病毒载体的构建以及其他重组腺病毒载体的构建提供一定的依据｡参考文献：[1]LONNERDAL B， IYER S． Lactoferrin： molecular structure and biologicalfunction[J]． Annu Rev Nutr，1995，15：93－110．[2]VAN BERKEL P H， WELLING M M， GEERTS M， et al． Large－scale production of recombinant human lactoferrin in the milk of transgenic cows[J]． Nat Biotechnol，2002，20：484－487．[3]MATRAA， ZHANG Z Y． Expression of human lactoferrin cDNA in tobacco cells produces antibacterial protein [J]． Plant Physiol， 1994，106：977－981．[4]张大兵，姜育蕾，吴祥甫，等．人乳铁蛋白基因在昆虫细胞中的表达[J]．生物化学与生物物理学报，1998，30：57－59．[5]LIANG Q， RICHARDSON T． Expression and characterized of human lactoferrinin yeast Saccharomyces cerevisiae[J]． J Agric Food Chem， 1993，41：1800－1807．[6]RUSSELL W C． Update on adenovirus and its vectors [J]． Journal of General Virology，2000， 81： 2573－2604．SOUZA D W， ARMENTANO D． Novel cloning method for recombinant adenovirus construction in Escherichia coli [J]． Biotechniques， 1999，26：502－508．。

人 PPARγ基因过表达重组腺病毒载体的构建及鉴定

ＶＥＣｓ中ＰＰＡＲ７基因的表达。结论
ＰＰＡＲＴ基因的表达。
ＰＰＡＲ７过表达重组腺病毒载体构建成功，且能有效上调ＨＵＶＥＣｓ中
关键词：过氧化物酶体增殖物激活受体；重组腺病毒载体；基因重组；ＡｄＭａｘ腺病毒包装系统
ｓｔｒｕｃｔｅｄａｎｄｍａｒｋｅｄｌｙｕｐ — ｒｅｇｕｌａｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰＰＡＲ７ｉｎＨＵＶＥＣｓ．ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ — ａｃｔｉｖａｔｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒ７；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒ；
南昌大学学报（医学版）２０１５年第５５卷第３期
ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｃｈａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ）２０１５，Ｖｏ１．５５Ｎｏ．３
ＮａｎｃｈａｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎａｎｃｈａｎｇ３３０００６，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔａｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｖｅｃｔｏｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇｈｕｍａｎｐｅｒｏｘｉ —

通用腺病毒骨架载体pAdEasy-1产品说明书中文版主要用途

通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）产品说明书（中文版）主要用途通用腺病毒骨架载体（pAdEasy-1）是一种与穿梭载体在特定细菌中同源重组构建产生重组腺病毒的改造型人腺病毒5型的主干基因分子。

适用于病毒感染性基因疗法的载体。

产品即到即用，性能稳定，重组保证。

技术背景pAdEasy-1腺病毒骨架载体含有人腺病毒5型的大部分基因组，去除E1和E3病毒基因，旨在提供外源性DNA 插入整合，同时避免病毒自我复制。

其中E1基因的剔除，使病毒在宿主细胞内失去DNA复制能力，而不能产生传染性病毒颗粒；E3基因的剔除，可以避开宿主的免疫反应。

pAdEasy-1为33.5kb，具有氨苄青霉素抗性，一旦与穿梭载体重组，其抗性消失。

同时具有内切酶Pac1和Cla1的位点。

产品内容载体液（Reagent A）（100纳克/微升）5微升产品说明书1份保存方式保存在－20℃冰箱里，有效保证6月用户自备BJ5183：用于载体转化重组的宿主细胞实验提示1．通常1次转化用量为100纳克2．使用BJ5183进行转化后重组3．建议和线性穿梭载体（1微克）共转染4．建议使用电转为优先5．转化后细菌培养不宜在BJ5183里超过20小时6．转化后的阳性细菌菌落通常比正常菌落小三分之一注意事项1．本产品为5微升（500纳克）规格2．操作时，须戴手套3．严格无菌操作4．载体转化后的菌落越小，转染阳性可能性越高；BJ5183的转化效率通常较之其它细菌要高5．转染的载体越大，转化效率越低，载体拷贝数越低，菌落后续培养越慢；大于40kb的载体，其琼脂平板上的菌落阳性率至多为20％6．不能使用常规质粒抽提方法提取载体；建议使用煮沸法质粒/柯斯质粒DNA快速抽提试剂盒－HL60004，既适合大型质粒提取，又避免质粒切口产生7．使用Pac1（50单位）进行酶切鉴定，其电泳条带为30kb和3kb（或4.5kb）8．pAdEasy-1腺病毒骨架载体基本信息如下：9．本公司提供系列腺病毒试剂产品质量标准1．本产品经鉴定性能稳定2．本产品经鉴定重组保证。

腺相关病毒概述

腺相关病毒引言腺相关病毒（AAVs）是一种复制缺陷型细小病毒，其生产性感染需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System）可以生产出无需辅助病毒的重组人血清型2型腺相关病毒（AAV-2）。

AAV HELPER-FREE SYSTEM利用已经明确用于调节AAV复制和表达的腺病毒基因产物，并且这些基因产物能通过转染引进宿主细胞。

在AAV HELPER-FREE SYSTEM中，生产具感染性的AAV 病毒颗粒所需的腺病毒基因产物（例如：E2A,E4和VA RNA 基因）大部分由和人AAV-2载体ＤＮＡ共转染进细胞的pHelper质粒提供，其余的腺病毒基因产物由稳定表达腺病毒E1基因的AAV-293宿主细胞提供。

本系统包括通过改良HEK293腺相关病毒生产能力而衍生出的AAV-293细胞。

通过消除对活的辅助病毒的需求，AAV Helper-Free System提供一个更安全，更纯净和更便利的替代逆转录病毒和腺病毒的基因传递系统。

野生型AAV-2基因组由病毒rep和cap基因（分别编码复制和基因）及位于两侧的包含所有辅助和包装必须的顺式作用元件的反向末端重复序列（ITRs）组成。

在AAV Helper-Free System中，rep和cap 基因从病毒载体中移除并转移到pAAV-RC质粒中，AAV-2 ITRs仍位于病毒载体中。

AAV rep和cap基因的转移允许感兴趣的外源基因插入病毒基因组中。

本系统可以容纳最大插入3kb。

在传统的基因传递系统中，有一个很大的顾虑是通过重组而恢复病毒野生型。

在本系统中，包含AAV-2末端重复序列的质粒(pAAV-MCS, pAAV-LacZ 和pAAV-hrGFP 以及 pAAV-IRES-hrGFP)与包含rep/cap基因的质粒(pAAV-RC)没有任何共同区域，从而阻止通过重组来野生型AAV-2。

为了确保这种无共同区域的保持，只用本系统提供的组件是非常重要的。

(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2

腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。

连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。

其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。

1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。

随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

pAAV-MCS腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐MCS编号载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息：载体名称: pAAVMCS， pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C ATGGTGATG C GGTTTTGGC 541 A GTACATCAA T GGGCGTGGA T AGCGGTTTG A CTCACGGGG A TTTCCAAGT C TCCACCCCA 601 T TGACGTCAA T GGGAGTTTG T TTTGCACCA A AATCAACGG G ACTTTCCAA A ATGTCGTAA 661 C AACTCCGCC C CATTGACGC A AATGGGCGG T AGGCGTGTA C GGTGGGAGG T CTATATAAG 721 C AGAGCTCGT T TAGTGAACC G TCAGATCGC C TGGAGACGC C ATCCACGCT G TTTTGACCT 781 C CATAGAAGA C ACCGGGACC G ATCCAGCCT C CGCGGATTC G AATCCCGGC C GGGAACGGT 841 G CATTGGAAC G CGGATTCCC C GTGCCAAGA G TGACGTAAG T ACCGCCTAT A GAGTCTATA 901 G GCCCACAAA A AATGCTTTC T TCTTTTAAT A TACTTTTTT G TTTATCTTA T TTCTAATAC961 T TTCCCTAAT C TCTTTCTTT C AGGGCAATA A TGATACAAT G TATCATGCC T CTTTGCACC1021 A TTCTAAAGA A TAACAGTGA T AATTTCTGG G TTAAGGCAA T AGCAATATT T CTGCATATA 1081 A ATATTTCTG C ATATAAATT G TAACTGATG T AAGAGGTTT C ATATTGCTA A TAGCAGCTA 1141 C AATCCAGCT A CCATTCTGC T TTTATTTTA T GGTTGGGAT A AGGCTGGAT T ATTCTGAGT1201 C CAAGCTAGG C CCTTTTGCT A ATCATGTTC A TACCTCTTA T CTTCCTCCC A CAGCTCCTG1261 G GCAACGTGC T GGTCTGTGT G CTGGCCCAT C ACTTTGGCA A AGAATTGGG A TTCGAACAT 1321 C GATTGAATT C CCCGGGGAT C CTCTAGAGT C GACCTGCAG A AGCTTGCCT C GAGCAGCGC 1381 T GCTCGAGAG A TCTACGGGT G GCATCCCTG T GACCCCTCC C CAGTGCCTC T CCTGGCCCT 1441 G GAAGTTGCC A CTCCAGTGC C CACCAGCCT T GTCCTAATA A AATTAAGTT G CATCATTTT1501 G TCTGACTAG G TGTCCTTCT A TAATATTAT G GGGTGGAGG G GGGTGGTAT G GAGCAAGGG 1561 G CAAGTTGGG A AGACAACCT G TAGGGCCTG C GGGGTCTAT T GGGAACCAA G CTGGAGTGC 1621 A GTGGCACAA T CTTGGCTCA C TGCAATCTC C GCCTCCTGG G TTCAAGCGA T TCTCCTGCC1681 T CAGCCTCCC G AGTTGTTGG G ATTCCAGGC A TGCATGACC A GGCTCAGCT A ATTTTTGTT 1741 T TTTTGGTAG A GACGGGGTT T CACCATATT G GCCAGGCTG G TCTCCAACT C CTAATCTCA1801 G GTGATCTAC C CACCTTGGC C TCCCAAATT G CTGGGATTA C AGGCGTGAA C CACTGCTCC 1861 C TTCCCTGTC C TTCTGATTT T GTAGGTAAC C ACGTGCGGA C CGAGCGGCC G CAGGAACCC 1921 C TAGTGATGG A GTTGGCCAC T CCCTCTCTG C GCGCTCGCT C GCTCACTGA G GCCGGGCGA 1981 C CAAAGGTCG C CCGACGCCC G GGCTTTGCC C GGGCGGCCT C AGTGAGCGA G CGAGCGCGC 2041 A GCTGCCTGC A GGGGCGCCT G ATGCGGTAT T TTCTCCTTA C GCATCTGTG C GGTATTTCA 2101 C ACCGCATAC G TCAAAGCAA C CATAGTACG C GCCCTGTAG C GGCGCATTA A GCGCGGCGG 2161 G TGTGGTGGT T ACGCGCAGC G TGACCGCTA C ACTTGCCAG C GCCCTAGCG C CCGCTCCTT 2221 T CGCTTTCTT C CCTTCCTTT C TCGCCACGT T CGCCGGCTT T CCCCGTCAA G CTCTAAATC2281 G GGGGCTCCC T TTAGGGTTC C GATTTAGTG C TTTACGGCA C CTCGACCCC A AAAAACTTG 2341 A TTTGGGTGA T GGTTCACGT A GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA 2401 C GTTGGAGTC C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC 2461 C TATCTCGGG C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA2521 A AAATGAGCT G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGTTTACAA2581 T TTTATGGTG C ACTCTCAGT A CAATCTGCT C TGATGCCGC A TAGTTAAGC C AGCCCCGAC2641 A CCCGCCAAC A CCCGCTGAC G CGCCCTGAC G GGCTTGTCT G CTCCCGGCA T CCGCTTACA2701 G ACAAGCTGT G ACCGTCTCC G GGAGCTGCA T GTGTCAGAG G TTTTCACCG T CATCACCGA 2761 A ACGCGCGAG A CGAAAGGGC C TCGTGATAC G CCTATTTTT A TAGGTTAAT G TCATGATAA 2821 T AATGGTTTC T TAGACGTCA G GTGGCACTT T TCGGGGAAA T GTGCGCGGA A CCCCTATTT 2881 G TTTATTTTT C TAAATACAT T CAAATATGT A TCCGCTCAT G AGACAATAA C CCTGATAAA2941 T GCTTCAATA A TATTGAAAA A GGAAGAGTA T GAGTATTCA A CATTTCCGT G TCGCCCTTA3001 T TCCCTTTTT T GCGGCATTT T GCCTTCCTG T TTTTGCTCA C CCAGAAACG C TGGTGAAAG3061 T AAAAGATGC T GAAGATCAG T TGGGTGCAC G AGTGGGTTA C ATCGAACTG G ATCTCAACA 3121 G CGGTAAGAT C CTTGAGAGT T TTCGCCCCG A AGAACGTTT T CCAATGATG A GCACTTTTA3181 A AGTTCTGCT A TGTGGCGCG G TATTATCCC G TATTGACGC C GGGCAAGAG C AACTCGGTC 3241 G CCGCATACA C TATTCTCAG A ATGACTTGG T TGAGTACTC A CCAGTCACA G AAAAGCATC3301 T TACGGATGG C ATGACAGTA A GAGAATTAT G CAGTGCTGC C ATAACCATG A GTGATAACA 3361 C TGCGGCCAA C TTACTTCTG A CAACGATCG G AGGACCGAA G GAGCTAACC G CTTTTTTGC 3421 A CAACATGGG G GATCATGTA A CTCGCCTTG A TCGTTGGGA A CCGGAGCTG A ATGAAGCCA 3481 T ACCAAACGA C GAGCGTGAC A CCACGATGC C TGTAGCAAT G GCAACAACG T TGCGCAAAC 3541 T ATTAACTGG C GAACTACTT A CTCTAGCTT C CCGGCAACA A TTAATAGAC T GGATGGAGG3601 C GGATAAAGT T GCAGGACCA C TTCTGCGCT C GGCCCTTCC G GCTGGCTGG T TTATTGCTG3661 A TAAATCTGG A GCCGGTGAG C GTGGGTCTC G CGGTATCAT T GCAGCACTG G GGCCAGATG 3721 G TAAGCCCTC C CGTATCGTA G TTATCTACA C GACGGGGAG T CAGGCAACT A TGGATGAAC 3781 G AAATAGACA G ATCGCTGAG A TAGGTGCCT C ACTGATTAA G CATTGGTAA C TGTCAGACC 3841 A AGTTTACTC A TATATACTT T AGATTGATT T AAAACTTCA T TTTTAATTT A AAAGGATCT3901 A GGTGAAGAT C CTTTTTGAT A ATCTCATGA C CAAAATCCC T TAACGTGAG T TTTCGTTCC3961 A CTGAGCGTC A GACCCCGTA G AAAAGATCA A AGGATCTTC T TGAGATCCT T TTTTTCTGC4021 G CGTAATCTG C TGCTTGCAA A CAAAAAAAC C ACCGCTACC A GCGGTGGTT T GTTTGCCGG 4081 A TCAAGAGCT A CCAACTCTT T TTCCGAAGG T AACTGGCTT C AGCAGAGCG C AGATACCAA 4141 A TACTGTCCT T CTAGTGTAG C CGTAGTTAG G CCACCACTT C AAGAACTCT G TAGCACCGC4201 C TACATACCT C GCTCTGCTA A TCCTGTTAC C AGTGGCTGC T GCCAGTGGC G ATAAGTCGT4261 G TCTTACCGG G TTGGACTCA A GACGATAGT T ACCGGATAA G GCGCAGCGG T CGGGCTGAA 4321 C GGGGGGTTC G TGCACACAG C CCAGCTTGG A GCGAACGAC C TACACCGAA C TGAGATACC 4381 T ACAGCGTGA G CTATGAGAA A GCGCCACGC T TCCCGAAGG G AGAAAGGCG G ACAGGTATC 4441 C GGTAAGCGG C AGGGTCGGA A CAGGAGAGC G CACGAGGGA G CTTCCAGGG G GAAACGCCT 4501 G GTATCTTTA T AGTCCTGTC G GGTTTCGCC A CCTCTGACT T GAGCGTCGA T TTTTGTGAT4561 G CTCGTCAGG G GGGCGGAGC C TATGGAAAA A CGCCAGCAA C GCGGCCTTT T TACGGTTCC 4621 T GGCCTTTTG C TGGCCTTTT G CTCACATGT//pAAV-‐MCS其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。

慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒系统介绍

度
高峰，在体水平在体水平表达较差，
用
物水平需要表达 2 周
约 72hr 达到高峰约需要 96hr 表达
维持表达时间 3 周
稳定表达
稳定表达，有被 silence 的稳定表达 6 月以上
风险
滴度
1011 PFU/ml
108 TU/ml
107 TU/ml
1012 v.g./ml
克隆容量
他血清型表达效率弱非常适合极低免疫原性
表 1. 四种主流病毒载体系统的特点比较。图表来源：汉恒生物组织整理。
图 3. AAV 基因组结构与 Capsid（Cap）高频突变位点示意图。A. Capsid 晶体结构示意图。其中蛋白 VP1 表面不同颜色的氨基酸基团代表 Cap 高频突变位点。B. Cap 基因结构。其中 Cap ORF 编码 3 个蛋白VP1、VP2 和 VP3。高频突变区域用不同颜色的箭头表示，并对应到图 A 中 Cap 表面不同颜色的氨基酸基团。C. AAV 基因组结构。图片来源：汉恒生物组织整理。
图 4. 不同的 AAV 血清型对组织或脏器的偏爱性。图片来源：汉恒生物组织整理。
我们综合比较下四种病毒载体系统的特点（表 1）：
病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒
腺相关病毒
病毒基因组 dsDNA
ssRNA
ssRNA 病毒
ssDNA
是否整合
不整合
随机整合并稳定遗传随机整合并稳定遗传
实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳
定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。

腺病毒载体构建

腺病毒的基因及其功能
ITR Ψ E1a/E1b E2 E3 E4 ITR
腺病毒基因组编码数十个腺病毒的结构和功能蛋白，分为早期表达和晚期表达。
早期表达的蛋白是功能蛋白，晚期表达的有功能蛋白也有结构蛋白，并且早期的功能蛋白能够调控晚期蛋白的表达。
早期表达的E1区蛋白（甚至包括E2区蛋白）是腺病毒基因组复制、病毒包装和其他蛋白表达翻译所必须的，但其对细胞毒性也是很强的。
腺病毒粒子相对稳定，插入外源基因的病毒基因组在连续传代中保持不变，易于用重组DNA技术操作。
宿主范可转入分裂后的非分裂细胞中发挥作用，可以感染处
围广
于分裂状态的细胞。
感染性
强
可经不同途径进入不同组织(可以在肠道内繁殖，也可以在呼吸道内繁殖。
包装容量改建腺病毒基因部分缺失载体的克隆容量可达10kb，大腺病毒基因完全缺失载体克隆容量可达37kb。
E2蛋白涉及AdDNA复制 E3蛋白对抗宿主的抗病毒防御系统 E4蛋白调节有效的晚期基因转录
腺病毒分类
第一代腺病毒载体：一般将E1或E3基因缺失的腺病毒载体成为一代
载体。此类型载体在未纯化时可引发机体产生较强的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用，体内表达周期可达4周。（科研、临床应用最广泛，一般常用Ad5型腺病毒）
腺病毒
• 腺病毒 Adenovirus 最初由人类腺样增殖体组织培养中分离得到的，此病毒名称也由此而来。质粒是直径约70毫微米的正二十面体，各顶点具有突起。结构亚基总数为252 个。核酸是双链DNA，分子量20—25×106。无包膜。在被感染的细胞核中增殖，病毒蛋白在细胞质内合成，再输送到细胞核。
• 腺病毒可见于人、鸡、牛、狗、鼠、猪和猴中，并各自具有严格的寄主特异性，不感染他种动物。对人类可引起感冒症状、呼吸系统不适等。

人可溶性转化生长因子βⅡ型受体重组腺病毒表达载体的构建

网１．ＰＳＩ质粒图谱、多克隆酶切位点及质粒特点（摘自＿ｗ．ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ．ｃｏｍ）图２．腺病毒骨架质粒及其特点（摘自ｗｗｗ．—ｓｔ—ｒａｔａｇｅｎｅ，ｃｏｍ）１．３试剂１．３．１实验试剂１．３．１．１Ｐｌａｔｉｎｕｍ高保真ＤＮＡ聚合酶（５Ｕ／１１１）：美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司，共含ＩＯＯＵ酶，货号１３１３５５９。

１．３．１．２ＥｘＴａｑＤＮ＾聚合酶（５Ｕ／ｌｌ１）｛日本Ｔａｋａｒａ，共含２５０Ｕ聚合酶、Ｉｍｌ１０ｘＥｘＴａｑｂｕｆｆｅｒ（峭ｐｌｕｓ）、８００ｎ１２．５ｍＭｄＮＴＰｓ混合液和Ｉｍｌ６ｘｌｏａｄｉｎｇｂｕｆｆｅｒ，货号ＤＲＲＯＯＩＡ。

１．３．Ｌ３限制性内切酶ＳａｌＩ（２０ｕ／｜Ｉ１）：英国ＮＥＢ公司，共含１０００Ｕ内切酶，ＩｍｌｌＯｘＴａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ，货号Ｒ０１３８Ｖ。

１．３．１．４限制性内切酶ＸｈｏＩ（２０ｕ／１１１）：英国ＮＥＢ公司，共含２５００Ｕ内切酶。

ｌｍｌｌＯｘＴａｎｇｏｂｕｆｆｅｒ，货号Ｒ０１４６Ｖ。

１．３．１．５限制性内切酶ＰｍｅＩ（１０Ｕ／１１１）：英国ＮＥＢ公司，共含２５０Ｕ内切酶、５００Ｉｌ１１０ｘＮＥＢｕｆｆｅｒ４、５００ｌｌｌ１００ＸＢＳＡ，货号Ｒ０５６０Ｖ。

１．３．１．６限制性内切酶ＰａｃＩ（ＩＯＵ／１１１）：英国ＮＥＢ公司，共含１２５Ｕ内切酶、结果表明序列正确。

如图４所示．Ｍ．－眦＾ＭａｒｋｅｒＤＬ２，０００Ｉ：ｓＴＢＲＩＩＰＣＲ产物Ｍ：＾－ＨｉｎｄｍＤＮＡＭａｒｋｅｒｌ：ＴＡ＿ｓＴＢＲⅡ质粒（１号）２：ＴＡ＿ｓＴＢＲⅡ质粒（２号）Ｍｌ：＾－Ｈｉｎｄ０１ＤＮＡＭａｒｋｅｒ１：．ｒ＿Ａ＿ｓＴ６ＲⅡ质粒（１号）的双酶切结果２：ＴＡ—ｓＴＢＲⅡ质粒（２号）的双酶切结果啦：ＤＮＡＭａｒｋｅｒＤＬ２，０００图４、ｓＴＢＲＩＩ和Ｔ卜ｓＴＢＲＩＩ质粒鉴定结果１．２测序结果显示插入片段为正确的人ｓＴＯＲⅡ序列。

测序结果如下Ｉ测序结果与Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ中所提供的序列在ＤＮＡｓｓｉｓｔ２．０软件上分析比对，结果正确。