pAAV-hrGFP腺病毒载体说明(图)

腺病毒载体操作手册中文版解析

腺病毒载体操作手册中文版解析腺病毒载体操作手册中文版AdEasyTM操作手册目录缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒操作手册

Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作手册(Version 2.0)上海吉凯基因技术有限公司二〇〇九年二月地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室电话：86-21-51320189 网址：邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 1 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒实验系统腺病毒是一种的线型双链 DNA 无包膜病毒，它的 DNA 和核心蛋白形成的内核，蛋白外壳是直径约 80nm 的正二十面体，由 240 个六面体和 12 个位于正二十面体顶部的五面体构成。

Genechem 重组腺病毒系统是将携带外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒基因组的包装质粒共转染 HEK293 细胞，通过 Cre/loxP 系统的作用实现重组，产生重组腺病毒。

重组腺病毒能够表达较大的外源基因片段，感染分裂和非分裂细胞，具有广泛的宿主。

GFP-adenovirus 感染的代表细胞――腺病毒可以感染绝大多数细胞TCA8113SGC-7901NRKPC-3Huh-7GliaRabbit Mesenchymal Stem CellsHuman Mesenchymal Stem CellRat Cardiac Fibroblasts地址：上海张江高科技园区蔡伦路 720 弄 1 号 408 室电话：86-21-51320189 网址：邮编：201203 传真：86-21-51320179 Email：service@Page 2 of 4 Shanghai GeneChem Co. Ltd 重组腺病毒操作过程一, 注意事项:1. 操作病毒时请尽量使用生物安全柜。

腺病毒载体工艺平台介绍(PPT37张)

LMP2
CDC病毒病所委托源兴承担药学研究
2019/4/11
基因药物研发中心
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新药申报三方面研究内容 • 药学研究 • 药效研究 • 安全评价
2019/4/11
基因药物研发中心
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药学研究主要内容 • • • • • • • 上游构建及鉴定细胞/毒种研究及三级库建立原液工艺研究制剂工艺研究检测方法及质量标准研究稳定性研究试制三批样品
2019/4/11
基因药物研发中心
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管理制度 • 建立了300多个SOP、SMP等标准程序和规章管理制度，按照GMP要求严格规范管理。
2019/4/11
基因药物研发中心
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研发中心工艺平台
• 研发中心工艺产业化平台是通用型腺病毒载体药物生产工艺和质量标准研究的药学技术平台，中试生产工艺水平达到了国内同行业先进水平，可以在产量及质量上满足腺病毒载体药物临床前和临床用样品制备的要求。 • 本工艺拥有自主知识产权，可作为腺病毒载体新药研发及生产的技术基础。 • 5L细胞罐收获物经纯化后产量能达到E15VP/批，注射液制剂工艺达到了小容量水针1万支/批的生产能力。 • 产品纯度大于98%，比滴度大于3.3%，各项质检结果都能达到FDA对腺病毒类生物制品的质量标准要求。
20211122?基因药物研发中心研发中心已完成申报临床所需药学研究的品种品种代号研究单位研究时间治疗性重组hbv腺病毒疫2004年3月至2005年11月治疗性hiv腺病毒载体疫苗h302005年12月至2007年8月治疗性重组腺病毒eb病毒潜伏膜抗原疫苗lmp2cdc病毒病所委托源兴承担药学研究2007年9月至2008年10月20211122?基因药物研发中心新药申报三方面研究内容安全评价20211122?基因药物研发中心药学研究主要内容试制三批样品20211122?基因药物研发中心细胞及毒种研究毒种检定代次及遗传稳定性研究20211122?基因药物研发中心建细胞库原始细胞细胞来源于atcc主细胞库质量控制工作细胞库质量控制细胞扩增细胞扩增20211122?基因药物研发中心工作种子批病毒扩增原始种子批主种子批鉴定检病毒扩增20211122?基因药物研发中心原液工艺流程参数及技术指标sepharosefastflow分子筛层析回收率3批平均重组腺病毒种子罐收获物超滤浓缩液source30q阴离子交换柱层析层析收集液6000rpm离心20min500k膜超滤浓缩10倍细胞种子细胞罐扩增5l罐细胞培养病毒扩增

pAAV-hSyn-RFP腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐hSyn-‐RFP编号载体名称北京华越洋VECT10040 pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐hSyn-‐RFP载体基本信息：载体名称: pAAV-‐hSyn-‐RFP质粒类型: 腺病毒载体；荧光报告载体高拷贝/低拷贝: 高拷贝克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子: human S ynapsin 1载体大小: 5909 b p5' 测序引物及序列: -‐-‐3' 测序引物及序列: SP6 5'ATTTAGGTGACACTATAG 3'载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: 红色荧光蛋白DsRedExpress克隆菌株: Stbl3 或 NEB S tble宿主细胞（系）: 神经细胞备注: pAAV-‐hSyn-‐RFP载体含有human s ynapsin 1 启动子，适合在神经细胞中表达。

稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐hSyn-‐RFP载体质粒图谱和多克隆位点信息：pAAV-‐hSyn-‐RFP载体序列：ORIGIN1 G TGGATAACC G TATTACCGC C TTTGAGTGA G CTGATACCG C TCGCCGCAG C CGAACGACC61 G AGCGCAGCG A GTCAGTGAG C GAGCGAGCG C GCAGAGAGG G AGTGGCCAA C TCCATCACT 121 A GGGGTTCCT T GTAGTTAAT G ATTAACCCG C CATGCTACT T ATCTACGTA G CCATGCTCT181 A GAGGATCCT T CGAAAAGCT T CTGCAGAGG G CCCTGCGTA T GAGTGCAAG T GGGTTTTAG 241 G ACCAGGATG A GGCGGGGTG G GGGTGCCTA C CTGACGACC G ACCCCGACC C ACTGGACAA 301 G CACCCAACC C CCATTCCCC A AATTGCGCA T CCCCTATCA G AGAGGGGGA G GGGAAACAG 361 G ATGCGGCGA G GCGCGTGCG C ACTGCCAGC T TCAGCACCG C GGACAGTGC C TTCGCCCCC 421 G CCTGGCGGC G CGCGCCACC G CCGCCTCAG C ACTGAAGGC G CGCTGACGT C ACTCGCCGG 481 T CCCCCGCAA A CTCCCCTTC C CGGCCACCT T GGTCGCGTC C GCGCCGCCG C CGGCCCAGC541 C GGACCGCAC C ACGCGAGGC G CGAGATAGG G GGGCACGGG C GCGACCATC T GCGCTGCGG 601 C GCCGGCGAC T CAGCGCTGC C TCAGTCTGC G GTGGGCAGC G GAGGAGTCG T GTCGTGCCT 661 G AGAGCGCAG T CGAGGCGCG C CGAGCTCGG A TCCTGAGAA C TTCAGGGTG A GTCTATGGG 721 A CCCTTGATG T TTTCTTTCC C CTTCTTTTC T ATGGTTAAG T TCATGTCAT A GGAAGGGGA781 G AAGTAACAG G GTACACATA T TGACCAAAT C AGGGTAATT T TGCATTTGT A ATTTTAAAA841 A ATGCTTTCT T CTTTTAATA T ACTTTTTTG T TTATCTTAT T TCTAATACT T TCCCTAATC901 T CTTTCTTTC A GGGCAATAA T GATACAATG T ATCATGCCT C TTTGCACCA T TCTAAAGAA961 T AACAGTGAT A ATTTCTGGG T TAAGGCAAT A GCAATATTT C TGCATATAA A TATTTCTGC1021 A TATAAATTG T AACTGATGT A AGAGGTTTC A TATTGCTAA T AGCAGCTAC A ATCCAGCTA1081 C CATTCTGCT T TTATTTTAT G GTTGGGATA A GGCTGGATT A TTCTGAGTC C AAGCTAGGC1141 C CTTTTGCTA A TCATGTTCA T ACCTCTTAT C TTCCTCCCA C AGCTCCTGG G CAACGTGCT1201 G GTCTGTGTG C TGGCCCATC A CTTTGGCAA A GCACGTGAA T TCGAAGATC T GGCCGCCTC1261 G GCCTCTAGA A CTAGTGGAT C CCCCGGGCT G CAGGAATTC G ATGCTACCG G TCGCCACCA1321 T GGCCTCCTC C GAGGACGTC A TCAAGGAGT T CATGCGCTT C AAGGTGCGC A TGGAGGGCT 1381 C CGTGAACGG C CACGAGTTC G AGATCGAGG G CGAGGGCGA G GGCCGCCCC T ACGAGGGCA 1441 C CCAGACCGC C AAGCTGAAG G TGACCAAGG G CGGCCCCCT G CCCTTCGCC T GGGACATCC 1501 T GTCCCCCCA G TTCCAGTAC G GCTCCAAGG T GTACGTGAA G CACCCCGCC G ACATCCCCG1561 A CTACAAGAA G CTGTCCTTC C CCGAGGGCT T CAAGTGGGA G CGCGTGATG A ACTTCGAGG 1621 A CGGCGGCGT G GTGACCGTG A CCCAGGACT C CTCCCTGCA G GACGGCTCC T TCATCTACA1681 A GGTGAAGTT C ATCGGCGTG A ACTTCCCCT C CGACGGCCC C GTAATGCAG A AGAAGACTA 1741 T GGGCTGGGA G GCCTCCACC G AGCGCCTGT A CCCCCGCGA C GGCGTGCTG A AGGGCGAGA 1801 T CCACAAGGC C CTGAAGCTG A AGGACGGCG G CCACTACCT G GTGGAGTTC A AGTCCATCT 1861 A CATGGCCAA G AAGCCCGTG C AGCTGCCCG G CTACTACTA C GTGGACTCC A AGCTGGACA 1921 T CACCTCCCA C AACGAGGAC T ACACCATCG T GGAGCAGTA C GAGCGCGCC G AGGGCCGCC 1981 A CCACCTGTT C CTGTAGCGG C CAAATGAAT T CCCAAACCG T ACGGGAAAC G GCCCTATTC2041 T ATAGTGTCA C CTAAATGCT A GAGCTCGCT G ATCAGCCTC G ACTGTGCCT T CTAGTTGCC2101 A GCCATCTGT T GTTTGCCCC T CCCCCGTGC C TTCCTTGAC C CTGGAAGGT G CCACTCCCA2161 C TGTCCTTTC C TAATAAAAT G AGGAAATTG C ATCGCATTG T CTGAGTAGG T GTCATTCTA2221 T TCTGGGGGG T GGGGTGGGG C AGGACAGCA A GGGGGAGGA T TGGGAAGAC A ATAGCGCGG 2281 C CGCTCTAGA G 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A GCCAGCCCC G ACACCCGCC A ACACCCGCT G ACGCGCCCT 3901 G ACGGGCTTG T CTGCTCCCG G CATCCGCTT A CAGACAAGC T GTGACCGTC T ccgggagct3961 g catgtgtca g aggttttca c cgtcatcac c gaaacgcgc g agACGAAAG G GCCTCGTGA4021 T ACGCCTATT T TTATAGGTT A ATGTCATGA T AATAATGGT T TCTTAGACG T CAGGTGGCA 4081 C TTTTCGGGG A AATGTGCGC G GAACCCCTA T TTGTTTATT T TTCTAAATA C ATTCAAATA4141 T GTATCCGCT C ATGAGACAA T AACCCTGAT A AATGCTTCA A TAATATTGA A AAAGGAAGA 4201 G TATGAGTAT T CAACATTTC C GTGTCGCCC T TATTCCCTT T TTTGCGGCA T TTTGCCTTC4261 C TGTTTTTGC T CACCCAGAA A CGCTGGTGA A AGTAAAAGA T GCTGAAGAT C AGTTGGGTG 4321 C ACGAGTGGG T TACATCGAA C TGGATCTCA A CAGCGGTAA G ATCCTTGAG A GTTTTCGCC 4381 C CGAAGAACG T TTTCCAATG A TGAGCACTT T TAAAGTTCT G CTATGTGGC G CGGTATTAT 4441 C CCGTATTGA C GCCGGGCAA G AGCAACTCG G TCGCCGCAT A CACTATTCT C AGAATGACT 4501 T GGTTGAGTA C TCACCAGTC A CAGAAAAGC A TCTTACGGA T GGCATGACA G TAAGAGAAT 4561 T ATGCAGTGC T GCCATAACC A TGAGTGATA A CACTGCGGC C AACTTACTT C TGACAACGA 4621 T CGGAGGACC G AAGGAGCTA A CCGCTTTTT T GCACAACAT G GGGGATCAT G TAACTCGCC 4681 T TGATCGTTG G GAACCGGAG C TGAATGAAG C CATACCAAA C GACGAGCGT G ACACCACGA 4741 T GCCTGTAGC A ATGGCAACA A CGTTGCGCA A ACTATTAAC T GGCGAACTA C TTACTCTAG 4801 C TTCCCGGCA A CAATTAATA G ACTGGATGG A GGCGGATAA A GTTGCAGGA C CACTTCTGC 4861 G CTCGGCCCT T CCGGCTGGC T GGTTTATTG C TGATAAATC T GGAGCCGGT G AGCGTGGGT 4921 C TCGCGGTAT C ATTGCAGCA C TGGGGCCAG A TGGTAAGCC C TCCCGTATC G TAGTTATCT 4981 A CACGACGGG G AGTCAGGCA A CTATGGATG A ACGAAATAG A CAGATCGCT G AGATAGGTG 5041 C CTCACTGAT T AAGCATTGG T AACTGTCAG A CCAAGTTTA C TCATATATA C TTTAGATTG5101 A TTTAAAACT T CATTTTTAA T TTAAAAGGA T CTAGGTGAA G ATCCTTTTT G ATAATCTCA5161 T GACCAAAAT C CCTTAACGT G AGTTTTCGT T CCACTGAGC G TCAGACCCC G TAGAAAAGA 5221 T CAAAGGATC T TCTTGAGAT C CTTTTTTTC T GCGCGTAAT C TGCTGCTTG C AAACAAAAA5281 A ACCACCGCT A CCAGCGGTG G TTTGTTTGC C GGATCAAGA G CTACCAACT C TTTTTCCGA5341 A GGTAACTGG C TTCAGCAGA G CGCAGATAC C AAATACTGT T CTTCTAGTG T AGCCGTAGT 5401 T AGGCCACCA C TTCAAGAAC T CTGTAGCAC C GCCTACATA C CTCGCTCTG C TAATCCTGT5461 T ACCAGTGGC T GCTGCCAGT G GCGATAAGT C GTGTCTTAC C GGGTTGGAC T CAAGACGAT 5521 A GTTACCGGA T AAGGCGCAG C GGTCGGGCT G AACGGGGGG T TCGTGCACA C AGCCCAGCT 5581 T GGAGCGAAC G ACCTACACC G AACTGAGAT A CCTACAGCG T GAGCTATGA G AAAGCGCCA 5641 C GCTTCCCGA A GGGAGAAAG G CGGACAGGT A TCCGGTAAG C GGCAGGGTC G GAACAGGAG 5701 A GCGCACGAG G GAGCTTCCA G GGGGAAACG C CTGGTATCT T TATAGTCCT G TCGGGTTTC 5761 G CCACCTCTG A CTTGAGCGT C GATTTTTGT G ATGCTCGTC A GGGGGGCGG A GCCTATGGA 5821 A AAACGCCAG C AACGCGGCC T TTTTACGGT T CCTGGCCTT T TGCTGGCCT T TTGCTCACA5881 T GTTCTTTCC T GCGTTATCC C CTGATTCT//pAAV-‐hSyn-‐RFP其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFPpAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCSpShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMVpAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFPpAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐FlucpAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐BpDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RCpAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐PurpAAV-‐minCMV-‐mCherry。

腺病毒PPT课件

9
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二、病毒的复制
（一）粘附和进入细胞腺病毒纤毛的头节区粘附到细胞表面的特异性受体病毒纤毛基底部五邻体与细胞表面结合通过内吞作用将腺病毒内化到细胞质中病毒在含内体的酸性环境中部分降解通过核孔将病毒DNA释放到细胞核内
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+ 1、腺病毒除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，不会干扰宿主基因。
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+腺病毒载体的特点
+ ①用它制备成疫苗或表达载体安全性好；②对其结构及特性的研究较深入，容易复制，操作简单；③重组的腺病毒载体可获得较高的滴度；④腺病毒无需整合进宿主细胞基因组中，目的基因在宿主细胞基因组外游离状态下表达，整合突变致癌可能性小，基因毒性低；⑤有较大的宿主范围，可感染分裂期及非分裂期细胞；⑥腺病毒载体可以插入7.5kb的外源基因，容量较大；⑦相对稳定，经得起纯化、浓缩。
——具有日程表的病毒
1
因该病毒最初来自腺体，故命名为腺病毒 (Adenovirus)。
是一群分布十分广泛，能引起呼吸道、肠粘膜上皮细胞溶解性感染；可在淋巴样和腺样细胞中引起潜伏感染，在啮齿动物细胞中引起转化感染。少数几种腺病毒对实验动物→致癌（12、18 型），有潜在致癌性。
2
型别多，约110个血清型，根据宿主可分鸟腺病毒属和哺乳类腺病毒,其中至少42个血清型能引起人类疾病。
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三、病毒的传播
传播途径：“粪——口”途径（胃肠道）感染对象：儿童为主。所致疾病：胃肠炎与腹泻。
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四、病毒对宿主防卫的逃逸
+ 1、在病毒感染早期，病毒的两种蛋白阻断激活死亡程序的细胞基因转录。在感染后期，腺病毒合成一种“腺病毒死亡蛋白”使被感染细胞破裂，快速释放出新病毒。

腺病毒载体AVV的作用

腺病毒载体AVV的作用
典型的腺病毒载体系统如：穿梭质粒pCA13/腺病毒基因组质粒pBHG11/包装细胞293细胞。

pCA13/的HCMV IE啟动子－多克隆位点－SV40 AN（poly A）构成外源基因的表达盒，该表达盒的插入使腺病毒E1基因缺失，但是保留其两端侧翼序列（左侧的1~3bp的ITR，右侧从3.5kb到末端的维持病毒装配和活力的蛋白IX的基因），也保留了腺病毒的包装信号φ（194~358bp）；pBHG11则保留了腺病毒基因组的绝大部分，但是缺失了包装信号φ、0.5~3.7图距（mu）部分的E1区、77.5～86.2mu的E3区，293细胞是整合有Ad5 E1基因的人胚肾细胞系。

pBHG11因為缺失包装信号及E1区而不能复制，pCA13带有包装信号及E1的侧翼序列，但是缺失E1区及腺病毒绝大部分基因组，同样不能复制。

外源目的基因插入pCA13后，与pBHG11共转染，进入293细胞。

pCA13与pBHG11在细胞内发生同源重组，同时，293细胞提供E1蛋白，从而包装產生腺病毒颗粒。

该病毒的蛋白质外壳同野生型腺病毒相似，具有同样的感染力进入靶细胞的能力，但是基因组DNA的E1区被外源目的基因取代，即进入靶细胞后病毒不能复制，但可以表达目的蛋白。

腺病毒载体的分类及包装方法

腺病毒载体的分类及包装方法1.腺病毒载体分类第一代腺病毒载体：指E1或E3基因缺失的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量为6.5-8Kb；(2)适用于大多数基因治疗，且容易获得高滴度的病毒；(3)可用于表达重组蛋白质或将外源基因导入对其他转染方法不敏感的细胞株中；(4)若未经纯化使用，容易引发机体产生强烈的炎症反应和免疫反应，纯化后可安全使用。

第二代腺病毒载体：指E2A或E4基因缺失的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量增加，可达14Kb；(2)病毒蛋白表达降低，引发机体的免疫反应比第一代弱；(3)外源基因表达时间较长；(4)病毒产量较低，且滴度降低。

第三代腺病毒载体：也称为空壳载体或辅助病毒载体，指全部或大部分腺病毒基因组缺失，仅可保留ITR和包装信号序列的腺病毒载体。

特点：(1)外源基因容量大幅度提高，可达37Kb；(2)无病毒蛋白表达，降低了机体的免疫反应，提高了安全性；(3)外源基因可长期稳定表达；(4)需要一个腺病毒突变体作为辅助病毒；(5)可反复应用，无需考虑机体的抗腺病毒中和抗体的影响。

2.腺病毒载体包装方法传统的双质粒共转染法将插入了外源基因的穿梭载体质粒与携带腺病毒基因组的质粒共转染293细胞，这两种质粒在293细胞内通过随机的同源重组（同源序列的DNA分子之间或者分子之内的重新组合），形成重组腺病毒载体基因组，并包装成病毒颗粒。

局限性：(1) 操作较复杂，因其易被亲代病毒污染，需经过多次纯化和鉴定；(2) 重组效率低，耗费时间较长。

注：此方法适用于临床。

(1)Ad-Easy法将克隆了外源基因的腺病毒穿梭质粒与携带腺病毒大部分基因组的质粒共转染RecA+细菌，在细菌RecA 重组酶的作用下，经抗性筛选获得重组腺病毒基因组质粒，将其酶切纯化后转染293细胞，包装成重组病毒颗粒。

特点：(1) 酶切和连接步骤少，操作简便；(2) 可选择的穿梭载体多；(3) 同源重组率达60%以上，效率相对较高；局限性：(1) 某些腺病毒基因容易发生突变；(2) 设备和技术要求较高。

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章AdEasyTM 技术 33.1 技术概况33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3 第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4? 4.1.1 克隆的一般原则4? 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生5? 4.2.1 共转化的一般原则5? 4.2.2 共转化方法5? 4.2.3 预期结果54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增64.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞6? 4.4.1 细胞铺板6? 4.4.2 磷酸钙转化技术7第五章常用技术85.1 QBI-293A细胞培养8? 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8? 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8? 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 ? 5.2.1 感染QBI-293A细胞9? 5.2.2 病毒空斑形成9? 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞95.3 MOI测定105.4 腺病毒感染力测定10? 5.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11? 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送11 ? 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增12? 5.5.3 Western杂交13? 5.5.4 Southern杂交和点杂交13? 5.5.5 病毒裂解产物PCR 14? 5.5.6 免疫测定14? 5.5.7 功能测定145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 ? 5.7.1 不连续密度梯度离心17? 5.7.2 连续密度梯度离心17? 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集175.8 病毒滴度测定18? 5.8.2 空斑测定法20? 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养226.2 感染力测定226.3 转移载体克隆236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞256.6 筛选和测定256.7 在QBI-293A细胞中表达266.8 重组腺病毒的扩增266.9 纯化266.10 病毒滴度测定27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNAMWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒包装操作手册

汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。

4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。

5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。

6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。

7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。

➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。

注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。

汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。

b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。

2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。

腺相关病毒操作技巧——轻松入门

CAG，广谱 CAG，广谱 CAG，广谱 CAG，广谱 EF1a，广谱
4、汉恒生物AAV-retro神经逆行示踪工具现货列表（表4）
载体类型
载体名称
启动子及其特点
神经逆行标记神经逆行标记神经逆行标记神经逆行标记神经逆行标记
AAV2/retro-EGFP AAV2/retro-CAG-cre AAV2/retro-DIO-EGFP AAV2/retro-DIO-tdtomato AAV2/retro-EF1a-DIO-Flp
1.5 kb
CAG，广谱，强
mcherry
否
pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-ZsGreen
1.2 kb
CAG，广谱，强
ZsGreen
是
过表达干扰
pHBAAV-CAG-DIO-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-hsyn-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-ZsGreen pHBAAV-CamkII-MCS-T2A-mCherry pHBAAV-GFAP-T2A-EGFP pHBAAV-U6-MCS-CMV-ZsGreen pHBAAV-U6-CMV-mCherry
04
是否Cre依赖
是是是是是是是是是是是是否否否否否否否否否否否否否否否否否否
腺相关病毒操作手册
3、汉恒生物AAV化学遗传学工具现货列表（表3）
载体类型
白喉毒素介导的细胞毒性
Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD Gq-DREADD Gi- DREADD

腺病毒载体操作手册1407

腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。

连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。

其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。

1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。

随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

载体——精选推荐

NEB
原核表达载体
NEB
配套大肠杆菌
Amersham 原核表达载体
Amersham 原核表达载体
Amersham 原核表达载体
Invitrogen 原核表达载体
Lucigen
原核表达菌株
Stratagene 原核表达菌株
Qiagen
原核表达载体
Qiagen
原核表达载体
Invitrogen 基因载体
700 元现货 800 元现货
900 元现货
800 元现货 800 元现货 800 元现货 800 元现货 800 元现货 700 元现货 800 元现货 800 元现货 800 元现货 800 元现货 900 元现货 1000 元现货 1000 元现货 1000 元现货 900 元现货 1000 元现货 1500 元现货 600 元现货 300 元现货 300 元现货 600 元现货 600 元现货 800 元现货 900 元现货 900 元现货 900 元现货
BL21(DE3) BL21(DE3)plysS Rosetta(DE3) Rosetta(DE3)plysS Rosetta-gami(DE3) Rosetta-gami B(DE3)pLysS Orgami(DE3) OrgamiB(DE3) BLR(DE3) pTWIN1 pTYB11 pMXB10 pTXB1 ER2566 pGEX-6P-1 pGEX-4T-2 pGEX-4T-3 pRset-a C41(DE3) BL21 codonplus（DE3）RIPL TAGZyme pQE-2 pQE-Trisystem pOG44 pORF-lacZ pORF-HSV1tk pSP73 pUC18 pUC19 pBR322 pSP64 pBluescript II SK(+) SuperCos 1 pGAPZα A pPICZα A

(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2

腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。

连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。

其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。

1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。

随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

载体库

pBudCE4.1-EGFP（CMV启动子空着）
pBudCE4.1-DsRed-Monomer（hEF1α启动子空着）
pUB6/V5 His lacZ
pEF1/myc-His lacZ
pMEP4
pSecTag2 HygroA
pCI
pSI
pALTER-MAX
pCAGGS
pKH3
pCGN
pRluc-N2
pSilencer5.1-H1 Retro
pMIR-REPORT miRNA Expression Reporter
pSUPER-EGFP
pSUPER-basic
pSUPER-puro
pSUPER-GFP-neo
pSUPER.Retro-GFP/Neo
pSUPER.retro.puro
psiRNAH1-neo
pET-28b(+)
pET-28c(+)
pET-29a(+)
pET-29b(+)
pET-30a(+)
pET-30b(+)
pET-30c(+)
pET-32a(+)
pET-32b(+)
pET-32c(+)
pET-35b(+)
pET-38b(+)
pET-39b(+)
pET-40a(+)
pET-40b(+)
pADH2
pYIP5
pYRP7
pDR195
pCAMBIA1300
pCAMBIA1301
pCAMBIA1302
pCAMBIA1303
pCAMBIA1304
pCAMBIA1305

pAAV-MCS腺病毒载体说明(图)

pAAV-‐MCS编号载体名称北京华越洋VECT10024 pAAV-‐MCSpAAV-‐MCS载体基本信息：载体名称: pAAVMCS， pAAV-‐MCS, p AAV M CS质粒类型: 腺病毒相关载体表达水平: 高启动子: CMV克隆方法: 多克隆位点，限制性内切酶载体大小: 4650 b p5' 测序引物及序列: CMV-‐F: 5'-‐CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG-‐3'3' 测序引物及序列: hGH-‐PA-‐R: C CAGCTTGGTTCCCAATAGA载体标签: -‐-‐载体抗性: 氨苄备注: -‐-‐稳定性: /组成型: -‐-‐病毒/非病毒: 腺病毒pAAV-‐MCS载体质粒图谱和多克隆位点信息pAAV-‐MCS载体序列:ORIGIN1 C CTGCAGGCA G CTGCGCGCT C GCTCGCTCA C TGAGGCCGC C CGGGCAAAG C CCGGGCGTC 61 G GGCGACCTT T GGTCGCCCG G CCTCAGTGA G CGAGCGAGC G CGCAGAGAG G GAGTGGCCA 121 A CTCCATCAC T AGGGGTTCC T GCGGCCGCA C GCGTGGAGC T AGTTATTAA T AGTAATCAA 181 T TACGGGGTC A TTAGTTCAT A GCCCATATA T GGAGTTCCG C GTTACATAA C TTACGGTAA 241 A TGGCCCGCC T GGCTGACCG C CCAACGACC C CCGCCCATT G ACGTCAATA A TGACGTATG 301 T TCCCATAGT A ACGTCAATA G GGACTTTCC A TTGACGTCA A TGGGTGGAG T ATTTACGGT 361 A AACTGCCCA C TTGGCAGTA C ATCAAGTGT A TCATATGCC A AGTACGCCC C CTATTGACG 421 T CAATGACGG T AAATGGCCC G CCTGGCATT A TGCCCAGTA C ATGACCTTA T GGGACTTTC 481 C TACTTGGCA G TACATCTAC G TATTAGTCA T CGCTATTAC C ATGGTGATG C GGTTTTGGC 541 A GTACATCAA T GGGCGTGGA T AGCGGTTTG A CTCACGGGG A TTTCCAAGT C TCCACCCCA 601 T TGACGTCAA T GGGAGTTTG T TTTGCACCA A AATCAACGG G ACTTTCCAA A ATGTCGTAA 661 C AACTCCGCC C CATTGACGC A AATGGGCGG T AGGCGTGTA C GGTGGGAGG T CTATATAAG 721 C AGAGCTCGT T TAGTGAACC G TCAGATCGC C TGGAGACGC C ATCCACGCT G TTTTGACCT 781 C CATAGAAGA C ACCGGGACC G ATCCAGCCT C CGCGGATTC G AATCCCGGC C GGGAACGGT 841 G CATTGGAAC G CGGATTCCC C GTGCCAAGA G TGACGTAAG T ACCGCCTAT A GAGTCTATA 901 G GCCCACAAA A AATGCTTTC T TCTTTTAAT A TACTTTTTT G TTTATCTTA T TTCTAATAC961 T TTCCCTAAT C TCTTTCTTT C AGGGCAATA A TGATACAAT G TATCATGCC T CTTTGCACC1021 A TTCTAAAGA A TAACAGTGA T AATTTCTGG G TTAAGGCAA T AGCAATATT T CTGCATATA 1081 A ATATTTCTG C ATATAAATT G TAACTGATG T AAGAGGTTT C ATATTGCTA A TAGCAGCTA 1141 C AATCCAGCT A CCATTCTGC T TTTATTTTA T GGTTGGGAT A AGGCTGGAT T ATTCTGAGT1201 C CAAGCTAGG C CCTTTTGCT A ATCATGTTC A TACCTCTTA T CTTCCTCCC A CAGCTCCTG1261 G GCAACGTGC T GGTCTGTGT G CTGGCCCAT C ACTTTGGCA A AGAATTGGG A TTCGAACAT 1321 C GATTGAATT C CCCGGGGAT C CTCTAGAGT C GACCTGCAG A AGCTTGCCT C GAGCAGCGC 1381 T GCTCGAGAG A TCTACGGGT G GCATCCCTG T GACCCCTCC C CAGTGCCTC T CCTGGCCCT 1441 G GAAGTTGCC A CTCCAGTGC C CACCAGCCT T GTCCTAATA A AATTAAGTT G CATCATTTT1501 G TCTGACTAG G TGTCCTTCT A TAATATTAT G GGGTGGAGG G GGGTGGTAT G GAGCAAGGG 1561 G CAAGTTGGG A AGACAACCT G TAGGGCCTG C GGGGTCTAT T GGGAACCAA G CTGGAGTGC 1621 A GTGGCACAA T CTTGGCTCA C TGCAATCTC C GCCTCCTGG G TTCAAGCGA T TCTCCTGCC1681 T CAGCCTCCC G AGTTGTTGG G ATTCCAGGC A TGCATGACC A GGCTCAGCT A ATTTTTGTT 1741 T TTTTGGTAG A GACGGGGTT T CACCATATT G GCCAGGCTG G TCTCCAACT C CTAATCTCA1801 G GTGATCTAC C CACCTTGGC C TCCCAAATT G CTGGGATTA C AGGCGTGAA C CACTGCTCC 1861 C TTCCCTGTC C TTCTGATTT T GTAGGTAAC C ACGTGCGGA C CGAGCGGCC G CAGGAACCC 1921 C TAGTGATGG A GTTGGCCAC T CCCTCTCTG C GCGCTCGCT C GCTCACTGA G GCCGGGCGA 1981 C CAAAGGTCG C CCGACGCCC G GGCTTTGCC C GGGCGGCCT C AGTGAGCGA G CGAGCGCGC 2041 A GCTGCCTGC A GGGGCGCCT G ATGCGGTAT T TTCTCCTTA C GCATCTGTG C GGTATTTCA 2101 C ACCGCATAC G TCAAAGCAA C CATAGTACG C GCCCTGTAG C GGCGCATTA A GCGCGGCGG 2161 G TGTGGTGGT T ACGCGCAGC G TGACCGCTA C ACTTGCCAG C GCCCTAGCG C CCGCTCCTT 2221 T CGCTTTCTT C CCTTCCTTT C TCGCCACGT T CGCCGGCTT T CCCCGTCAA G CTCTAAATC2281 G GGGGCTCCC T TTAGGGTTC C GATTTAGTG C TTTACGGCA C CTCGACCCC A AAAAACTTG 2341 A TTTGGGTGA T GGTTCACGT A GTGGGCCAT C GCCCTGATA G ACGGTTTTT C GCCCTTTGA 2401 C GTTGGAGTC C ACGTTCTTT A ATAGTGGAC T CTTGTTCCA A ACTGGAACA A CACTCAACC 2461 C TATCTCGGG C TATTCTTTT G ATTTATAAG G GATTTTGCC G ATTTCGGCC T ATTGGTTAA2521 A AAATGAGCT G ATTTAACAA A AATTTAACG C GAATTTTAA C AAAATATTA A CGTTTACAA2581 T TTTATGGTG C ACTCTCAGT A CAATCTGCT C TGATGCCGC A TAGTTAAGC C AGCCCCGAC2641 A CCCGCCAAC A CCCGCTGAC G CGCCCTGAC G GGCTTGTCT G CTCCCGGCA T CCGCTTACA2701 G ACAAGCTGT G ACCGTCTCC G GGAGCTGCA T GTGTCAGAG G TTTTCACCG T CATCACCGA 2761 A ACGCGCGAG A CGAAAGGGC C TCGTGATAC G CCTATTTTT A TAGGTTAAT G TCATGATAA 2821 T AATGGTTTC T TAGACGTCA G GTGGCACTT T TCGGGGAAA T GTGCGCGGA A CCCCTATTT 2881 G TTTATTTTT C TAAATACAT T CAAATATGT A TCCGCTCAT G AGACAATAA C CCTGATAAA2941 T GCTTCAATA A TATTGAAAA A GGAAGAGTA T GAGTATTCA A CATTTCCGT G TCGCCCTTA3001 T TCCCTTTTT T GCGGCATTT T GCCTTCCTG T TTTTGCTCA C CCAGAAACG C TGGTGAAAG3061 T AAAAGATGC T GAAGATCAG T TGGGTGCAC G AGTGGGTTA C ATCGAACTG G ATCTCAACA 3121 G CGGTAAGAT C CTTGAGAGT T TTCGCCCCG A AGAACGTTT T CCAATGATG A GCACTTTTA3181 A AGTTCTGCT A TGTGGCGCG G TATTATCCC G TATTGACGC C GGGCAAGAG C AACTCGGTC 3241 G CCGCATACA C TATTCTCAG A ATGACTTGG T TGAGTACTC A CCAGTCACA G AAAAGCATC3301 T TACGGATGG C ATGACAGTA A GAGAATTAT G CAGTGCTGC C ATAACCATG A GTGATAACA 3361 C TGCGGCCAA C TTACTTCTG A CAACGATCG G AGGACCGAA G GAGCTAACC G CTTTTTTGC 3421 A CAACATGGG G GATCATGTA A CTCGCCTTG A TCGTTGGGA A CCGGAGCTG A ATGAAGCCA 3481 T ACCAAACGA C GAGCGTGAC A CCACGATGC C TGTAGCAAT G GCAACAACG T TGCGCAAAC 3541 T ATTAACTGG C GAACTACTT A CTCTAGCTT C CCGGCAACA A TTAATAGAC T GGATGGAGG3601 C GGATAAAGT T GCAGGACCA C TTCTGCGCT C GGCCCTTCC G GCTGGCTGG T TTATTGCTG3661 A TAAATCTGG A GCCGGTGAG C GTGGGTCTC G CGGTATCAT T GCAGCACTG G GGCCAGATG 3721 G TAAGCCCTC C CGTATCGTA G TTATCTACA C GACGGGGAG T CAGGCAACT A TGGATGAAC 3781 G AAATAGACA G ATCGCTGAG A TAGGTGCCT C ACTGATTAA G CATTGGTAA C TGTCAGACC 3841 A AGTTTACTC A TATATACTT T AGATTGATT T AAAACTTCA T TTTTAATTT A AAAGGATCT3901 A GGTGAAGAT C CTTTTTGAT A ATCTCATGA C CAAAATCCC T TAACGTGAG T TTTCGTTCC3961 A CTGAGCGTC A GACCCCGTA G AAAAGATCA A AGGATCTTC T TGAGATCCT T TTTTTCTGC4021 G CGTAATCTG C TGCTTGCAA A CAAAAAAAC C ACCGCTACC A GCGGTGGTT T GTTTGCCGG 4081 A TCAAGAGCT A CCAACTCTT T TTCCGAAGG T AACTGGCTT C AGCAGAGCG C AGATACCAA 4141 A TACTGTCCT T CTAGTGTAG C CGTAGTTAG G CCACCACTT C AAGAACTCT G TAGCACCGC4201 C TACATACCT C GCTCTGCTA A TCCTGTTAC C AGTGGCTGC T GCCAGTGGC G ATAAGTCGT4261 G TCTTACCGG G TTGGACTCA A GACGATAGT T ACCGGATAA G GCGCAGCGG T CGGGCTGAA 4321 C GGGGGGTTC G TGCACACAG C CCAGCTTGG A GCGAACGAC C TACACCGAA C TGAGATACC 4381 T ACAGCGTGA G CTATGAGAA A GCGCCACGC T TCCCGAAGG G AGAAAGGCG G ACAGGTATC 4441 C GGTAAGCGG C AGGGTCGGA A CAGGAGAGC G CACGAGGGA G CTTCCAGGG G GAAACGCCT 4501 G GTATCTTTA T AGTCCTGTC G GGTTTCGCC A CCTCTGACT T GAGCGTCGA T TTTTGTGAT4561 G CTCGTCAGG G GGGCGGAGC C TATGGAAAA A CGCCAGCAA C GCGGCCTTT T TACGGTTCC 4621 T GGCCTTTTG C TGGCCTTTT G CTCACATGT//pAAV-‐MCS其他腺病毒表达载体：pNTAP-‐Shuttle-‐B pAAV-‐CAG-‐RFPpAAV-‐CaMKIIa-‐EGFP pCTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CMV-‐Rluc pNTAP-‐Shuttle-‐ApAAV-‐CAG-‐GFP pBHGloxdelE13cre pCTAP-‐Shuttle-‐C pDC511pDC515 pDC312pAdTrack-‐CMV pAAV-‐IRES-‐hrGFP pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐1 pShuttle-‐CMV-‐EGFP-‐C pacAd5 9.2-‐100 pacAd5 C MV-‐GFP pAAV-‐Syn-‐Rluc pCMV-‐MCS pShuttle-‐IRES-‐hrGFP-‐2 pShuttle-‐CMV pAAV-‐Syn-‐Rluc pAAV-‐hSyn-‐RFP pAAV-‐CMV-‐iRFP pAAV-‐UbCpDC415 pAAV-‐CAG-‐Fluc pAAV-‐LacZ pNTAP-‐Shuttle-‐B pDC316 pDC516pAAV-‐CA pDC416pNTAP-‐Shuttle-‐C pDC311pDC512 pAAV-‐hrGFPpDC411 pAAV-‐RC pAdTrack pacAd5 C MVK-‐NpA pAdEasy-‐1 pDC315pAAV-‐MCS pShuttlepHelper pBApo-‐CMV-‐neo pShuttle-‐CMV-‐lacZ pBApo-‐CMVpAAV-‐TRE-‐Syn-‐Fluc pBApo-‐CMV-‐Pur pAAV-‐minCMV-‐mCherry。

腺病毒载体AVV的分类

腺病毒载体AVV的分类
腺病毒载体AVV是一种高分子(36 KB)双链没有涂布DNA病毒。

通过受体介导的内吞作用进入细胞，然后转移到细胞核内的腺病毒基因组，保持在染色体外，不整合到宿主细胞基因组。

一般将E1或E3基因缺失被称为代腺病毒载体，腺病毒载体这类载体能使身体产生强烈的炎症反应和**反应，表达外源基因的时间很短。

E2A或E4基因缺失的腺病毒载体被称为**代腺病毒载体，**反应其载体能力薄弱和安全也改善了很多。

第三代腺病毒载体缺失(没有病毒载体，没有生气的向量)或大部分腺病毒基因(微腺病毒载体、mini Ad)，只能保留ITR和包装信号序列。

第三代腺病毒载体可以插入到大35 KB基因，病毒蛋白表达的细胞**反应，从而进一步减少，引入核基质附着区基因载体可以保持长期使外源基因表达，并增加载体的稳定性。

载体系统需要一个腺病毒突变体作为辅助。

慢病毒、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒系统介绍

度
高峰，在体水平在体水平表达较差，
用
物水平需要表达 2 周
约 72hr 达到高峰约需要 96hr 表达
维持表达时间 3 周
稳定表达
稳定表达，有被 silence 的稳定表达 6 月以上
风险
滴度
1011 PFU/ml
108 TU/ml
107 TU/ml
1012 v.g./ml
克隆容量
他血清型表达效率弱非常适合极低免疫原性
表 1. 四种主流病毒载体系统的特点比较。图表来源：汉恒生物组织整理。
图 3. AAV 基因组结构与 Capsid（Cap）高频突变位点示意图。A. Capsid 晶体结构示意图。其中蛋白 VP1 表面不同颜色的氨基酸基团代表 Cap 高频突变位点。B. Cap 基因结构。其中 Cap ORF 编码 3 个蛋白VP1、VP2 和 VP3。高频突变区域用不同颜色的箭头表示，并对应到图 A 中 Cap 表面不同颜色的氨基酸基团。C. AAV 基因组结构。图片来源：汉恒生物组织整理。
图 4. 不同的 AAV 血清型对组织或脏器的偏爱性。图片来源：汉恒生物组织整理。
我们综合比较下四种病毒载体系统的特点（表 1）：
病毒表达系统腺病毒表达系统慢病毒表达系统逆转录病毒
腺相关病毒
病毒基因组 dsDNA
ssRNA
ssRNA 病毒
ssDNA
是否整合
不整合
随机整合并稳定遗传随机整合并稳定遗传
实验室常用的慢病毒（Lentivirus）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 1 型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。具有感染谱广泛、可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳
定表达外源基因等优点，因此成为导入外源基因的有力工具。现在慢病毒系统已经被广泛应用到各种细胞系的基因过表达、RNA 干扰、microRNA 研究以及活体动物实验中。