全内反射荧光显微镜 - 北京大学单分子与纳米生物学实验室
隐失驻波、负折射材料(NIM)在全内反射荧光显微术下的综合应用
隐失驻波、负折射材料（NIM）在全内反射荧光显微术下的综合应用11191050张正德（北京航空航天大学，北京102206）摘要：针对隐失波最新发展及应用，查阅了前人所写论文 (蒋练军、金辉霞, 2006) (王琛、王桂英、徐至展, 2004) (王晓秋、吴世法、简国树、王克逸、王景芝、潘石, 2003) (王琛、王桂英、徐至展, 全内反射荧光显微术, 2002) (范路生、薛轶群、王晓华、王钦丽、林金星, 2011)，综合考虑到负折射率材料对隐失波振幅的增益和两束光波全内反射形成的隐失驻波，可做如下设想：采用隐失驻波照亮荧光标记样本并采用负折射率材料制成的扁平镜头用以显微镜聚焦，可以达到分子级别的小范围照亮和高分辨率测量。
关键词：隐失波、负折射率材料、全内反射、超显微技术Abstract:According to the evanescent wave the latest development and application, refer to the previous paper .Comprehensive considering the negative refractive index material on evanescent wave amplitude gain and two beam of light wave total internal reflection formation of evanescent standing wave, can play the following ideas: the evanescent standing wave light fluorescent marker sample and the negative refractive index material made of flat lens to focus microscope, can achieve the molecular level of small range light and high resolution measurement.Key words:Evanescent wave,Negative refractive Index Materials(NIM),Total internal reflection,Ultra micro technology0引言(引用自 (王琛、王桂英、徐至展, 全内反射荧光显微术, 2002)) 自世界上第一台光学显微镜问世以来，显微科学取得了迅猛的发展。
全内反射荧光显微镜概述
3. 物镜型光学成像系统中物镜
由于细胞的典型折射率为1.33~1.38，因此要实现全内 反射，在物镜型全内反射荧光成像系统中物镜的数值 孔径（NA）必须大于1.38。 当物镜数值孔径为1.4时，只有很小的一部分数值孔径 范围（1.4-1.38=0.02）被利用，入射角可调节范围 （最大孔径角与全内反射角的差值）很小，光束校准 比较难，同时光束的强度也很难提高。若使用数值孔 径为1.65的物镜，则有一个大的多的孔径范围（1.651.38=0.27）可以被利用，则入射角可调节范围变大， 降低了操作难度。高数值孔径的物镜的使用是物镜型 全内反射荧光成像系统的关键。
全内反射
全内反射是一种普遍存在的光学现象。 考虑一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射 率为n2的介质中。入射光在表面上一部分发生反射， 另一部分则发生透射。入射角θ1和透射角θ2之间满 足关系式n1sinθ1=n2sinθ2 当n1大于n2时，全反射就可能发生:即所有的入射光 线全部反射出来,称为全内反射。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
2.1棱镜型
棱镜型利用激光经过棱镜并产生全内反射，其隐失波照射已 被荧光标记的生物样品，其激发光从另一侧进入物镜并被 CCD相机捕捉。棱镜作为发生全内反射的光学器件。物镜只 是作为荧光信号收集器。在探测上，它也不容易受到入射光 的干扰。缺点是放置样品的空间位于棱镜和盖玻片之间，所 以样品大小和样品的放置受到限制。
华大测序原理辊环复制
华大测序原理涉及多种技术，包括单分子实时DNA测序技术、合成多聚尾技术、荧光标记及探针制备、数据质量控制与分析方法等，它经过持续的技术迭代，如今已经成为中国、乃至全球生物技术领域的一个重要里程碑。
那么具体到测序原理来说，即以下的全内反射荧光(total internal reflect fluorescence, TIRF)应用方法：全内反射荧光显微镜（TIRFM）是华大测序所应用的一种非常有效的单分子检测技术。
当光线穿过一层薄薄的液体时，只有那些位于光线照射平面内表面之上的分子能够被激发，并且这些分子发出的荧光可以被相机记录下来。
这一技术使得我们能够捕捉到单个分子的运动，为生物学研究提供了前所未有的高分辨率。
其次，华大测序的另一个核心技术是单分子实时DNA测序技术。
这一技术实现了对单个DNA 分子的识别和读取，从根本上解决了传统Sanger测序中需要预先构建模板这一难题。
这一技术利用了合成多聚尾技术，实现了对单个DNA分子的随机标签，从而使得在后续的测序过程中能够实现单分子定位，能够实现复杂体系下的单分子检测。
这种技术的实现不仅突破了传统的Sanger测序技术，更将测序技术的效率提高到了前所未有的新高度。
至于样本处理方面，华大测序采用的是逆转录试剂盒的方法来获取模板DNA。
这个过程主要是先将血液中的RNA逆转录为DNA，然后再将这个DNA进行PCR扩增，最后进行测序。
至于数据产出，华大测序的产出结果可以通过各种软件进行拼接，最终形成完整的基因序列。
同时华大测序还通过引物延伸方向的不同来识别不同的样本来源，这种机制的运用大大提高了测序的效率和准确性。
以上就是华大测序的基本原理，其在生命科学研究中发挥着不可或缺的作用。
不过需要注意，生命科学是一个极其复杂而又变化莫测的领域，华大测序作为一种工具或方法，它的作用是有限的，最终的结果还需要结合其他科学手段进行综合分析。
全内反射荧光显微术名词解释
全内反射荧光显微术名词解释全内反射荧光显微术，听起来就像是从科幻电影里蹦出来的名词，是吧？其实它可是一种非常酷炫的显微镜技术，能让我们看到那些微小得像针尖一样的细胞和分子。
想象一下，把光线像小箭一样射向样品，当光线以一定的角度入射，嘿，光线就不再穿透，而是在界面上反射回来，这就是全内反射的魔法！这时候，样品里的荧光分子会被激发，发出闪闪的光芒，简直就像夜空中的繁星，令人心醉。
用这个技术，科学家们可以观察生物样品，像细胞膜、蛋白质等。
大家知道细胞是生命的基本单位，对吧？而这些微小的结构可不是轻易就能看清的，普通显微镜就像是用放大镜看远处的星星，模糊得很。
全内反射荧光显微术却像是把宇航员送到了太空，直接给你展示了细胞内部的每一个角落，真是让人眼前一亮。
这项技术的魅力在于，能在活细胞中进行观察。
别小看这一点，很多传统的显微镜技术可得把细胞弄得死去活来才能看清。
可是全内反射荧光显微术却让我们能够在“现场”观察，活生生的细胞在做什么，简直就像在看一场精彩的真人秀！你可以看到细胞的动态变化、分裂过程，甚至是它们如何和周围的环境互动，这些都是生命中最微妙的瞬间。
说到荧光，这里有个小秘密。
荧光分子就像是小小的发光棒，只有当它们被特定波长的光激发时，才会闪耀出美丽的光芒。
像小孩子玩耍一样，开心得不得了。
这种现象让我们能够区分不同的细胞，甚至标记特定的蛋白质，形成色彩斑斓的图像。
这些图像比任何油画都要生动，简直就是生命的艺术品。
想想看，科学家们在显微镜下能看到的那些细胞，像极了微缩版的城市，热闹非凡。
全内反射荧光显微术也让我们在医学研究中大放异彩。
比如在癌症研究中，科学家们通过观察癌细胞的特征，发现它们是如何突破正常细胞的防线，蔓延到其他地方的。
这种技术帮助我们了解疾病的根本，寻找更有效的治疗方案。
感觉像是在揭开一个个神秘的面纱，让我们看清楚那些潜藏在暗处的真相。
操作全内反射荧光显微术可不是随便拍拍的事。
它需要一套精密的设备和技术，像调整光路、选择激发波长，这些都得小心翼翼。
全内反射荧光显微术及其在生物单分子科学中的应用(精)
全内反射荧光显微术及其在生物单分子科学中的应用北京大学力学与工程科学系生物医学工程专业02级博士钟建学号: 10203829摘要:全内反射荧光显微技术利用全内反射产生的隐失波激发样品,由于隐失波强度成指数衰减,使激发区域限定在样品表面的一薄层范围内,因此具有其它光学成像技术无法比拟的高的信噪比。
它是当今世界上研究单分子科学最具前途的新型生物光学显微技术之一,可以用来实现对单个荧光分子的直接探测。
近年来,已被生物物理学家们广泛应用于单分子的荧光成像中。
本文主要介绍了全内反射荧光显微技术的基本知识及其在生物单分子科学上的应用。
关键词:全内反射荧光显微技术,生物单分子,隐失波生物单分子研究是指在单分子水平上对生物分子行为(包括构象变化、相互识别、相互作用等的实时﹑动态检测以及在此基础上的操纵和调控等,籍此深入阐明构效、构性关系。
生物单分子研究已经成为21世纪生命科学领域的一个重点研究方向。
在生命科学领域有着广泛的研究前景。
生物单分子研究要求发展超高分辨率的成像技术,从而在分子尺度上探测生命活动的细节。
新一代光学显微技术以其高的空间分辨率和时间分辨率、无损伤、以及对单分子活体探测的可行性,成为生物学家和物理学家的研究热点。
目前国际上公认的最有前途的单分子光学成像技术有全场相衬显微术、共焦荧光显微术,近场光学扫描显微术和全内反射荧光显微术[1]。
这些技术在分子生物学、分子化学、激光医学及纳米材料等领域受到广泛关注,并产生了深远的影响。
其中,全内反射荧光显微术是近年来新兴的一种光学成像技术,它利用全内反射产生的隐失场来照明样品,从而致使在百纳米级厚的光学薄层内的荧光团受到激发,荧光成像的信噪比很高。
这种方法的成像装置简单,极易和其它成像技术、探测技术相结合。
目前已成功的实现200nm甚至更低的空间分辨率。
因此被生物物理学家用来观察单分子成像,也被细胞生物学家和神经科学家来观测发生在细胞膜上的生理反应[2]。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍
TIRFM 原理
全内反射是一项依赖于消逝波的技术。 在两种不同折射率介质的临界面上，临界角 的光线几乎被完全反射： c= sin-1 (n2/n1) n1 > n2 消逝波只能够传播到盖玻片后几百纳米内 典型的有效照明下渗透度只有50nm到100nm
低折射率 q 高折射率
只有临近盖玻片表面（近场）的荧光分子才能 被激发。远场分子不受激发。
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
安装简单 可用于膜片钳实验 物镜数值孔径受限制
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全内反射照明的切换
宽场荧光照明
盖波片
物镜
激光
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高灵敏度冷CCD --- EMCCD Rolera-MGi
背感光、高量子效率，>90% 芯片增益EMCCD，不放大读出噪音 高速度，全幅30fps，最高300fps以上 低温制冷CCD
EM CCD在以下应用具有无可比拟的优势： 1。单分子成像：Single molecule imaging 2。全内反射：Total internal reflection 3。转盘式共聚焦：Spinning Disk 5。Ca等的离子测定 6。快速时间序列的荧光3D成像
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化学生物学研究中的分析检测方法
label-free microRNA detection using
oligonucleotide-silver nanoclusters as probe
Target
Anal. Chem. 84, 4587–4593 (2012) Biosens. Bioelectron. 41, 348-353 (2013)
22
4.核磁与活体成像
核磁共振在蛋白质研究中的应用
蛋白质结构和功能解析用分子力学计算得到蛋白质三维结构23
蛋白质动力学的研究 NMR技术可提供从ps至ms时间内蛋白质分子的运动信息
蛋白质和药物之间的相互作用 判断小分子是否与蛋白质有相互作用及作用强度
膜蛋白解析
24
磁共振成像在化学生物学中的应用
超分辨成像技术
细胞内单分子的检测方法
原子力显微镜单分子成像与单分子力谱法
重要发展方向
2. 单细胞检测
高通量单细胞分析 单细胞电化学及其它成像技术 活体成像技术
单细胞光学成像 分离技术 发展趋势
7
3. 生物质谱与质谱成像
质谱在组学研究中的应用 质谱成像技术 敞开式离子化技术 发展趋势
4. 核磁与活体成像
Anal. Chem. 84, 1452–1458 (2012) Chem. Commun. 49(9), 862-864 (2013)
30
MIT的Strano教授在Acc. Chem. Res. (2014)用一整段并引用一张原图介 绍了Biosens. Bioelectron. 2010, 26: 169，评价称鞠课题组做出了“这 个领域的一项奠基性工作”。
30
Boronic acid-functionalized magnetic carbon nanotubes for highly specific enrichment of glycopeptides
全内反射荧光成像基本原理
hv H**
H hv
S2
吸
放
收
热
S0
精品课件
S1
放
荧
热
光
分子荧光的产生
激发态停留时间短、返回速度快的途径发生的几率大。 荧光：10-7-10-9s 磷光：10-4-100s
精品课件
电子跃迁的单重态（单线态）与三重态（三线态）
在光致激发和去激发光的过程中，分子中的价电子（n, π）处于不同的自旋状态，通常用多重态M来描述：
荧光是相同多重态间的允许跃迁，产生速度快：109—10-7s，又叫快速荧光或瞬时荧光。外部光源停止照射， 荧光马上会消失。
磷光发射：第一激发三重最低振动能级到基态（104—10s），外部光源停止照射后，可以持续一段时间。
精品课件
全内反射荧光显微镜结构
目前，大多数全内反射荧光显微镜主要有两种基本类 型：棱镜型和物镜型(或无棱镜型)。
精品课件
由于隐失波仅在界面上极薄的一层范围内传播，所以利用 隐失波照明样品，可以仅激发厚度大约 100nm 内的荧光团， 而更深层溶液中的荧光基团不会被激发，因此极大地提高了 显微成像的对比度和信噪比。
d12是渗透深度，它等于从分界面处到光强衰减 l/e 处的 距离。
精品课件
精品课件
隐失波强度成指数衰减曲线
M＝2S＋1＝1 电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－ 1/2，这里的正负号取决于自旋的方向。基态中每个能级 通常被两个自旋相反的即自旋配对的电子占据，M=1，成 为单重态。
精品课件
当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激 发态时，其自旋不变，即仍和处于基态的另一电子 成对 。这些能态都被称为单线态或 单重态(singlet state)。
简述全内反射荧光显微术的原理和应用
全内反射荧光显微术原理与应用1. 引言全内反射荧光显微术（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的显微技术，利用全内反射限制激光光束的传播范围，使其仅激发样品表面附近的荧光染料，并通过荧光显微镜观察和记录表面附近的高分辨荧光信号。
该技术具有高灵敏度、高空间分辨率和实时监测能力等优点，广泛应用于生命科学研究中。
本文将详细介绍TIRFM的原理和应用。
2. 全内反射原理光在由一个折射率较大的介质（如光具）射入折射率较小的介质（如空气）时，当入射光线的入射角大于一个特定的临界角时，光线将会完全发生反射，不再穿透进入折射率较小的介质中。
这个现象被称为全内反射（Total Internal Reflection，TIR）。
当一个光束从高折射率的物质射入低折射率的物质时，入射角大于临界角时，发生全内反射。
通过调控入射角，可以使光线沿着介面传播，从而形成衰减系数很小的光束。
这个现象可以被用来实现TIRFM的照明光路。
3. 全内反射荧光显微术系统TIRFM系统主要由以下几个部分组成：激光光源、调制器、目标镜、物镜、荧光滤光片、成像系统和数据采集分析系统等。
激光光源：一般使用高功率激光器，如氩离子激光器或二极管激光器。
激光通过光纤输入到光路系统中。
调制器：用于控制激光的工作模式，常用的包括振荡镜或振荡腔。
目标镜：一般是具有高折射率的玻璃片或光具，用于实现全内反射，常用的目标镜材料有石英、玻璃等。
物镜：用于聚焦激光到样品表面，并收集荧光信号。
物镜的选择要考虑到激光的聚焦效果和空间分辨率。
荧光滤光片：用于选择性地阻挡激发光和透射荧光信号。
成像系统：一般是荧光显微镜或全内反射显微镜。
能够观察并记录样品表面的荧光信号。
数据采集分析系统：可以对观察到的荧光图像进行实时处理和分析，如图像增强、图像叠加、荧光强度计算等。
4. TIRFM原理TIRFM的原理可以通过以下步骤进行解释：1.激光从物镜聚焦到样品表面。
TIRFM原理及应用
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
02.1 全反射
1. 2.
snell定律: n1sin θ 1=n2 sin θ 2
当n1大于n2时，全反射就可能发生:
θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
即所有的入射光线全部反射出来,称为全内反射
02.2 隐失波
1.
如果玻璃的折射率取为1.52，溶液的折射率取为1.33（生物细胞的折 射率范围是1.33-1.38），则玻璃／界面处的临界角为61.78°。从几 何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在剥离界面上完全反 射而不进入液体溶液中。实际上，由于波动效应，有一部分光的能 量会穿过界面渗透到溶液中，平行于界面传播。这部分光场就是所 谓的隐失波。
TIRFM在细胞生物物理研究中的应用
主讲人：秦继伟
TIRFM简介 TIRFM原理 TIRFM分型 TIRFM应用
01 TIRFM简介
全内反射荧光显微术(Total internal reflection fluorescence microscopy TIRFM)是利用全内反 射产生的隐失波激发样品,使样品表面数百纳米厚 的薄层内的荧光团受到激发，只有这个小范围内的 荧光分子将被激发，而在这个范围以外的荧光分子 则完全不受影响。所以全内反射荧光显微术具有其 它成像方法无法比拟的高的信噪比，细胞的光损伤 和光漂白也很小。再用高灵敏度和高时间分辨率的 摄像机CCD来捕捉荧光并用计算机进行显像，从 而实现对生物样品观测的一种技术。
正置荧光显微镜
倒置荧光显微镜
物镜型全内反射荧光显微镜成像系统的最大优点是在进行TIRFM实 验时可对样品进行其他操作，如改变样品介质、进行细胞显微注 射及微操作等。
拉直的单个DNA分子的全内反射荧光实时成像研究
ＴＩ Ｆ成像技术是近年来用于生物 单分子研究最 热门的 Ｒ 方法之一 ｌ 。这种技术利用入射光发生全内反 射时产生的 １ 隐失波 （ｖｎｓｅｔ ｖ） 激发诱 导荧光 ，如 图 １ ａ 所示 。 ｅａ ｅｃｎ ｅ来 ｗａ （） 而隐失波穿透深度（ ） 限 ， 有 一般 仅能激发界 面附近厚 ２ ０ ０
功能，选用 Ｙ Ｏ－ 对 Ｄ ＯＹ １ ＮＡ进行标 记 ， 采用基 于盖玻 片覆
盖法 的分子梳技术 将 Ｄ ＮＡ分子拉 直 ， 并利 用 Ｔ Ｒ Ｉ Ｆ成像 技 术对拉直 的单个 Ｄ ＮＡ分 子进行成像 ， 对单个 Ｄ － ０Ｙ １ ＮＡ Ｙ （
复合体在连续光照条件下 的光漂 白过程进行实时记 录，然后
成像技术 ，女令 内反射荧 光（ Ｒ ） Ｉ １ ＴＩ Ｆ 技术 ，还可 以对 拉直 的、
荧 光 染 料 标 记的 个 Ｉ Ａ 分 子的 动 力 学 行 为 进 行 直 观 的 实 ） Ｎ
时观察 ， 从而 探索分 子 问的 ｌ 互作用 机制Ｉ 。Ｙ （－ 相 ＯＹ ）１等 二 聚花菁染料与 Ｄ Ａ结 合后其荧光 强度 可提 高几 百倍 ，因 Ｎ 此 是常 用 的 高效 ＤＮ 荧 光 探针 ；但 在 持 续 光 照条 件 下， Ａ Ｙ ＹＯ Ｉ与 Ｄ Ａ分 子可形成具有 光敏化作 用 的配 体 ，因而 Ｏ － Ｎ 容易发生光漂 白和光敏断裂现象【 ，这往往 限制 了 Ｄ ＮＡ分
摘
要
全内反射荧光 （ Ｒ ） ＴＩ Ｆ 成像技术利用穿透深度仅 ２ ０ｎｎ左右 的隐失波来激 发诱导荧 光，探测灵敏 ０ ｌ
度和 图像信噪 比大大提高 ， 成为单分子研究 的有力工具 。 分子梳技术利用 Ｄ ＮＡ末端 与固体表面 的结合力 和 周 围流体流动产生 的侧 向力将 Ｄ ＮＡ 分子拉 伸并 平铺 在表 面上 。结 合这两 种技 术 ，对分 子梳 拉直 的单个 Ｄ ＮＡ分子进行了清晰 的实时荧光成像 ，发现 Ｔ Ｒ Ｉ Ｆ成像 条件下 Ｄ ＮＡ分子与荧光 探针 Ｙ Ｏ－ ＯＹ １组成的复合 体可 自然避免发生光敏断裂现象 ； 实时监测 ＿单个 Ｄ 『 ＮＡ－ ＯＹ １ Ｙ Ｏ－ 复合体的光漂白过程 ，通过对激发光照射
全内反射荧光显微镜剖析
隐失波
从几何光学的角度来看，当光发生全反射时，光会在玻 璃界面上完全反射而不进入液体溶液中。实际上，由于 波动效应，有一部分光的能量会穿过界面渗透到溶液中， 是一种非均匀波，它沿着入射面上的介质边界传播，而 振幅随离界面的距离ｚ作指数衰减。
2.3全内反射荧光显微镜特点
①信噪比高（相对共聚焦显微镜） ②分辨率高（相对其他的光学显微镜） ③对生物样本损伤小，可以进行活体物质的研究
和单分子的动态研究。 ④全内反射的荧光激发深度只在～100 nm 的薄
层范围内,从而成为研究细胞表面科学如生物化 学动力学、单分子动力学的最有前途的光学成 像技术。 ⑤全内反射荧光显微成像法不再采用扫描成像, 大大提高了成像速度,可以满足实时成像的要求。
5. 在生物单分子研究中的应用
细胞内的很多至关重要的生命活动过程如信 号转导，蛋白质转运，病原体侵入均与细胞 表面有关，如果我们可以直接对这些细胞表 面的过程进行观测，而不受到来自细胞内深 层区域信号的干扰，这对细胞生物学研究来 说，将是具有重大意义的突破。全内反射荧 光显微术正是凭借其独特的优势,它的荧光激 发深度只在～200ｎｍ的薄层范围内,从而成 为研究细胞表面科学如生物化学动力学、单 分子动力学的最有前途的光学成像技术。
2.2 物镜型
而在物镜型成像系统中，显微镜的物镜既是发生全内反射的 光学器件，又是样品荧光信号的收集器。其优点是样品的大 小没有棱镜的限制，样品的放置非常方便，并且由于样品远 离物镜而可以与多种其他技术相结合，例如微操作，微分干 涉成像系统，光镊技术，扫描探针显微术等等，因而相对于 棱镜型展现出更加广阔的生物应用前景。
全内反射荧光显微镜_单分子荧光能量共转移_
全内反射荧光显微镜单分子荧光能量共转移1. 引言1.1 概述本文旨在介绍全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术，并探讨它们在生物医学领域的应用。
全内反射荧光显微镜是一种基于全内反射现象的高分辨率显微镜，可以实现非常高的空间分辨率和极低的背景噪音，因此被广泛应用于生物体系中超分辨率成像的研究。
而单分子荧光能量共转移是一种用来研究生物体系中分子之间相互作用和结构动态变化的方法，在生命科学领域具有重要意义。
1.2 文章结构本文主要分为五个部分：引言、全内反射荧光显微镜、单分子荧光能量共转移、实验结果与讨论以及结论。
在引言部分，我们将对本篇文章进行简要介绍，并概述全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术的背景和意义。
随后，在接下来的几个部分，我们将逐步深入探讨这两项技术的原理、发展历程、应用领域以及实验方法与技术要点。
最后，我们将介绍相关的实验结果，并进行结果讨论与解释。
在结论部分，我们将对本文进行总结回顾，并探讨存在的问题及未来展望。
1.3 目的本文旨在全面介绍全内反射荧光显微镜和单分子荧光能量共转移技术的原理和应用，并通过实验结果与讨论来验证这两项技术在生物医学领域中的有效性。
通过本文的阐述，读者可以了解到这些重要技术在研究生物体系中起到的关键作用，并对未来发展方向有所启示。
2. 全内反射荧光显微镜部分的内容如下：2.1 原理介绍全内反射荧光显微镜（Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy，TIRFM）是一种基于全内反射原理的高分辨率荧光显微技术。
其原理是利用高折射率物质与低折射率域之间的全内反射现象，将激发光只聚焦在非常薄的表面层上，进而使得观察对象处于极低背景的强照射区域。
相比传统荧光显微镜，TIRFM 具有更高的信噪比和更好的空间分辨率。
在TIRFM中，通过特定角度入射到玻璃-样品界面上的激发光会被全内反射。
当样品中存在荧光探针时，这些探针会受到入射激发光的刺激并发生荧光发射。
细胞生物学 第五版 超高分辨率显微技术 名词解释
SIM
结构照明显微 Structure 术
Illumination
Microscopy
在显微镜的硬件系统增加光栅和控制元件 原理：通过光栅的旋转和移动将多重相互衍射的光束照射到样本上，并 再次发生干涉，然后从收集到的发射光模式中提取高分辨信息，生成一 幅完整的图像。 优点：对于普通的免疫荧光标记样本和各种荧光蛋白表达样本，无需特 殊处理直接观察 缺点：分辨率远低于其他超高分辨显微术。
随机光学重构
optical
心位置，重复 10000 次以上，可以重构出内源蛋白分布的高分辨图像。
显微术
reconstruction 名词解释：利用能在荧光态和暗状态之间不断切换的荧光探针标记待观
microscopy 察分子，任何一帧荧光像只探测一小部分光学上可分辨的荧光基团，因
此能非常精确地确定它们离荧光光斑中心位置的一种超高分辨率荧光显
缺点：只能观察外源表达蛋白的定位，不适合活细胞动态观察。
绿色荧光蛋白
PA-GFP 的突变体
PA-GFP 在激活之前对 488nm 的光没有反应，需先用 405nm 的激光激活 一段时间，再用 488nm 激光照射时才可发出绿色荧光。
作用：细胞内源性蛋白的超分辨定位。
染料：基于花青染料可以被一种波长的光激活发出荧光，也可以被另一
TIRFM
超高分辨率显 微技术Байду номын сангаас
PALM/STORM 4π STED 显微术
SIM
TIRFM
Total Internal 全内反射荧光
Reflection 显微术
Fluorescence
Microscopy
基于斯涅尔定律，当光线从光密介质进入光疏介质时，一部分光会发生 折射，而另一部分光会发生反射，当光线的入射角大于临界角时，会发 生全内反射（TIR）现象，此时光线会在介质的另一面产生隐失波。隐 失波的能量范围通常在 200nm 以内，降低了背景噪声的干扰，提高图像 分辨率。 该技术只能观察细胞紧靠玻片的大约 100nm 的范围。
全内反射荧光显微镜
全内反射荧光显微镜（TIRFM）系统全内反射荧光显微镜TIRFM系统介绍一、全内反射荧光显微镜的原理及其在生物领域的应用全内反射荧光显微镜(Total internal reflection fluorescence microscope TIRFM)利用光从高折射率的介质进入较低折射率的介质时，如果入射角足够大时则光全部被反射而不发生折射，但是在两种介质的界面会产生衰逝波可以激发近界面100nm范围内的荧光的原理来实现对物体表面的观察。
可通过常规荧光显微镜的照明器或特殊照明器送入激发光，并对激光的入射角度进行控制，采用瞬间场激发方法以避免激发光进入探测器，在玻璃和水界面的激发光产生全内反射实现的。
为了实现全内反射，需要大的入射角，例如玻璃-水界面的入射角要大于61度。
这可以通过棱镜(prism)实现，称为prism-based TIRFM，也可通过高数值孔径的物镜实现，此时称为objective-type TIRFM。
现在商品化的全内反射荧光显微镜一般都是物镜类型的，速度快，精度高。
Wide field FL TIRFM全内反射荧光显微镜由于能实现物体表面非常薄范围内（小于100nm）荧光观察，故在某些生物领域得到广泛应用。
如以下等应用：1、细胞表面图象的观察。
如细胞膜表面结构，细胞表层的接触，膜表面动力学/蛋白质定位Fixed 3T3 纤维原细胞细胞免疫化学标记微管蛋白2、单分子观察及其操作。
肌球蛋白，肌动蛋白与Cy3标记ATP3、细胞膜表面运动。
如泡吞、泡吐现象，泡外分泌现象。
表达GFP-肌动蛋白的培养MAST 细胞正在胞饮4、细胞膜钙火花现象的观察，离子通道监视G蛋白偶联钙离子通道监视5、分子马达研究旋转的马达、细胞骨架蛋白、聚合体、G蛋白、环状蛋白、核苷酸马达RNA聚合酶反应除了在生物领域外，在化学领域等对于化学分子结构观察中也有很好的应用。
二、全内反射荧光显微镜的基本组成全内反射荧光显微镜主要由四部分组成。
全内反射荧光显微镜TIRFM介绍介绍
n光束容易校准 n数值孔径越大，分辨率越高 n数值孔径大，有更多的激发光强 可以用来产生全反射 n全内反射角度调节范围更大
100x NA1.4
100x NA1.65
0.04mm
0.21mm
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DiI染色的Hela细胞
TIRFM FLM
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全内反射荧光显微镜的基本组成
•高级研究级显微镜
一般为倒置显微镜，配荧光照明器、高数值孔径的物镜
•TIRFM照明器
通过光纤接入激光，并对激光入射方向进行控制，通过L型照明器实现 和荧光照明器一起从荧光通道进入显微镜
•激光器
根据实验要求选择，可以接入单激光器或者多激光系统
•检测系统
应选择高灵敏度制冷CCD，要求CCD量子效能高，能够对极弱荧光进行 捕捉，具有上千倍的信号放大功能，如果是对快速荧光信号进行捕捉则 还需要高速CCD
如何得到消逝波
标本折射率 消逝波 水 n２ =1.33 细胞内液 n２ =1.38
d
盖波片 （n1＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM) (n1＝1.78 for APO100XOHR ） 镜油 （n0＝1.52 for PLAPO60XOTIRFM） （n0＝1.78 for APO100XOHR ）
全内反射荧光成像基本原理
全内反射荧光成像基本原理全内反射是光线从密度较高的介质（例如玻璃）射向密度较低的介质（例如空气）时发生的一种现象。
当光线在接触面的入射角大于一个临界角时，光线会全部反射回原始介质中，而不会折射进入次级介质。
这一现象被称为全内反射。
在全内反射条件下，介质表面和内部的荧光物质可以被激发并发出荧光信号。
全内反射荧光成像的基本原理是：首先，通过荧光激发源（例如激光器）发射一束脉冲激光通过透镜和反射镜，在接触面处以一个大于临界角的入射角射向样品。
然后，当入射光经过接触面进入样品中时，发生全内反射现象，并被样品内部的荧光物质吸收和激发。
激发后，荧光物质发出特定波长的荧光信号，进一步在样品内部发生传播。
接下来，通过特殊的数码相机或光学探测器将样品中发出的荧光信号收集起来。
相机或探测器可以通过透镜、滤光片等光学元件来选择性地记录特定波长的荧光信号。
然后，将收集到的荧光信号转化为电信号，并通过一些图像处理算法对信号进行处理和分析。
最后，根据处理得到的数据，生成显示样品内部结构和特性的显微图像。
全内反射荧光成像具有很多应用研究领域。
例如，它可以用于生物医学研究，用于观察细胞和组织的内部结构和功能。
此外，它还可以用于纳米材料的表征和研究，用于观察微观尺度下的材料结构和相互作用。
此外，全内反射荧光成像还被广泛应用于材料科学、化学分析等领域。
综上所述，全内反射荧光成像利用全内反射现象和荧光物质的特性，通过激发和探测荧光信号，实现对材料内部结构和特性的成像。
其基本原理涉及激发源、光学元件、荧光信号收集和处理等方面。
全内反射荧光成像在生物医学、材料科学等领域有广泛的应用前景。
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当一束平面光波从折射率为n1的介质进入到折射率为n2的介质中
消逝波----全内反射荧光镜的关键所在
消逝波 消逝场(evanescent field)
荧光消逝波 θ2=90° θc=sin-1(n2/n1)
全内反射的仪器组成
全内反射荧光显微成像系统
棱镜型
物镜型
成像系统的消逝场 是通过入射光经棱 镜发生全反射产生 的
基本概念
Title 全内反射荧光显微术：
Title 数值孔径：
全内反射荧光显微术：
全内反射荧光显微术是利用全内反射产 生的消逝波来照射样品，从而致使在样 品表面数百纳米级厚度的光学薄层内的 荧光团受到激发，使单分子成像。
数值孔径：
数值孔径又叫做镜口率，简写为N.A。它是 由物体与物镜间媒质的折射率n与物镜孔径 角的一半（a\2）的正弦值的乘积，其大小 由下式决定：N.A=n×sin a/2
全内反射荧光技术发展历程
1965年
Hirsch field 完成了第一个 全内反射荧光 实验
1995年
Yanagida小 组用TIRFM技 术首次在液体 溶液中得到了 荧光标记的单 个蛋白质分子 的成像.
1996年
Moerner小 组又用这项技 术实现了限制 在丙烯酰胺胶 体的纳米孔中 的单分子的三 维成像。
层析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反 射显微术典型的垂直照明深度<100nm。这么 薄的光学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统 好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
全内反射荧光显微镜优点：
1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生物样本损伤小
与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统层 析深度分别为～ 500nm～800nm , 而全内反射显 微术典型的垂直照明深度<100nm。这么薄的光 学层析层切片意味着信噪比 比共焦系统好得多, 细胞的光损伤和光漂白也很小。
合适的pH值：PH:4.25
合适的TPPS的浓度：1.5x10-6 -1"L’
2.蛋白质的分泌：
A. 为刺激给予之前;B、C. 为刺激给予后 MIN6 细胞用吖啶橙荧光染料转染后给予50 mmol/ L 氯化钾
刺激,应用TIRFM 得到全反射影像
A1 为刺激给予之前;B、C1 为22mmol/ L 葡萄糖给予之后 MIN6 细胞应用吖啶橙荧光染料转染后给予高浓度葡萄糖刺激,
应用TIRFM 得到全反射影像。
3.全内反射荧光显微镜同原子 力显微镜结合的应用
Injected Fluorescent Beads
1) Silanization of whisker crystals 2) Modification of PC-linker
成像系统的消逝场 是通过入射光经物 镜本身全反射产生
棱镜型系统包括三个主要部分
(1) 倒置的相衬光学显微镜; (2) 可以二维精确移动的样品台; (3) 用来发生全反射的棱镜
棱பைடு நூலகம்型评价
棱镜型系统在实现上更加容易,它只
1
需要激光光源、棱镜和显微镜。
在探测上,它也不容易受到入射光信
2
号的干扰
全内反射荧光显微镜
Presented by 何维清 张帆 吴夕 姚兴荣
Contents
11..全全内内反反射射荧荧光光技技术术发发展展历历程程 22..全全内内反反射射的的基基本本原原理理 33..微微镜镜及及荧荧光光显显微微镜镜比比较较的的优优缺缺点点 44..全全内内反反射射荧荧光光显显微微术术应应用用
有效消除直到近红外范围的色差
最高级的UIS2物镜是UPLSAPO系列，它杰出的超级复消色差特点有效 地消除了从可见光谱直到1000nm范围内的色差。这意味着从紫外到红 外范围内的成像都可以只用一个物镜实现。这一系列物镜在使用覆盖很 宽谱带的荧光进行多色观察时，可以获得出色的清晰图像而不产生颜色 偏移
wa sa m plifiedt hreet imesin thef igure) [T PPSI-1.5x10 '-I-L’;[BSA]=6ig"-L-',P H425 1, 吕 k -1.,i- (丁PPS);2 ,B ulk solodon( TPPS十】3SA);
3, I n te rf ace (丁PPSI B SA
全内反射的应用
蛋白质吸附平衡 表面分子浓度梯度变化 表面分子的旋转 荧光寿命及反应速率的测量及选择性观
测细胞/底物接触区等 其中蛋白质界面吸附平衡是全内反射荧
光法的重点应用领域
1：关于测定蛋白质分的吸附平衡的应用
Thes ynchronousf luorescence spectra( Ax= 230r un)o f TP PS i nd if ferente nvironment( thei ntensityo fi nterface
CCD功用介绍
比较：
一般的光学显微镜： 分辨率为250nm
1
显微图像的信 噪比不高
2 光源对生物样 本照射的损伤
3
光学衍射所致 的分辨极限 （R≥ 0.61λ/nsin θ）
比较：
一般的光学 显微镜分辨率为250nm 因此有：1：信噪比高 2：分辨率高 3：对生
物样本损伤小 与共焦技术相比, 单光子或双光子的共焦系统
全内反射的基本原理
全内反射与Snell 定律 ----Snell 定律
入射光在两介质接触面一部分发生反射，一部 关分系发由生折Sn射ell。定入律射角θ1和透射角θ2之间满足
θ2 =90° θc=sin-1(n 2/n 1) ----全内反射
生由。上即式所可有知的，入当射n1光大线于全n2部时反，射全出反来射称就为可全能内发 反射
放置样品的空间收到棱镜的限制
3
物镜
物镜型
物镜型全内反射荧光显微镜成像系统
图4 物镜型全内反射荧光显微镜示意图
棱镜形和物镜型的简易光路图
拥有更宽波长范围内的高透过率
IX2系列的内置物镜采用UW多层鍍膜技术，能够有效消除超宽谱带上的反射， 在可见光到近红外光的波长范围内能够实现平坦的高透过率，在近红外和紫外 范围内的透过率显著提高。总之，在较宽波长范围内的性能使它非常适合当今 最需要的研究用途。