泛耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因研究_胡庆丰

·论　著·
泛耐药肺炎克雷伯菌的耐药基因研究
胡庆丰1,吕火祥1,糜祖煌2,沈蓓琼1
(1.浙江省人民医院检验医学中心,浙江杭州310014;2.无锡市克隆遗传技术研究所,江苏无锡214026)摘要:目的　了解1株对临床常用18种抗菌药物(包括亚胺培南、美罗培南)均耐药的肺炎克雷伯菌(K PN )所携带的耐药基因状况。

方法　对该株K PN 进行了9类耐药基因的P CR 法检测,包括β-内酰胺酶基因bla T EM 、blaSH V 、bla LEN 、blaO KP 、blaCT X -M -1、2、9群、blaO XA -1、2、10群、blaCA RB 、blaP ER 、blaV EB 、blaG ES 、金属β-内酰胺酶基因blaIM P 、blaVIM 、blaK PC ,AmpC 酶基因blaDH A 、blaA CT /M IR 、blaCM Y /M OX 、blaCM Y /L A T ,氨基糖苷修饰酶基因aac (3)-Ⅰ、aac (3)-Ⅱ、aac (6′)-Ⅰb 、aac (6′)-Ⅱ、ant (2″)-Ⅰ、ant (3″)-Ⅰ,喹诺酮类耐药基因qnr A 、T M P 耐药基因dfr A1、df rA 17,消毒剂磺胺耐药基因qacE ■1-sul1,整合子遗传标记基因int Ⅰ1、int Ⅰ2、int Ⅰ3,转座子遗传标记基因tnpA 、mer A ,共计36种。

结果　K P N 共检出7种耐药基因,分别为β-内酰胺酶基因bla T EM ,blaSH V ,金属β-内酰胺酶基因blaKP C -2,氨基糖苷修饰酶基因aac (3)-Ⅱ,ant (3″)-Ⅰ,消毒剂磺胺耐药基因qacE ■1-sul1,整合子遗传标记基因int Ⅰ1。

结论　在该株泛耐药K PN 中发现了少见的blaKP C -2金属β-内酰胺酶基因,该菌对18种抗菌药物的耐药可能与其同时携带有多种耐药基因有关,临床应对此类菌株引起重视。

关键词:肺炎克雷伯菌;耐药基因;泛耐药
中图分类号:R378.99+6 文献标识码:A 文章编号:1005-4529(2009)13-1634-04
Drug Resistance Genes of Pan -resistant Klebsiella pneumoniae Strains
H U Qing -feng ＊,L H uo -xiang ,M I Zhu -huan ,SH EN Pei -qio ng
(＊Zhej iang Provincial Peop le ′s Hospital ,Hangz hou ,Zhejiang 310014,China )
Abstract :OBJEC TIVE T o unde rstand the drug resistance genes in K lebsie lla pneumoniae (K PN )iso late resistance to 18kinds of antibacte rials which included imipenem and mero penem .METHODS W e detected 36kinds o f drug re sistance genes for the strain of K PN by PC R method ,included the be ta -lactamase s genes ,blaT EM ,blaS HV ,bla LEN ,blaO K P ,(blaCT X -M -1,2and 9)gr oups ,(blaOX A -1,2and 10)g roups ,CA RB ,PER ,V EB and G ES ;the genes o f metallo -beta -lactamases genes ,IM P ,VIM and K PC ;the AmpC genes ,D HA ,ACT ,M O X and L A T ;the aminog ly cosides resistant genes ,aac (3)-Ⅰ,aac (3)-Ⅱ,aac (6′)-Ⅰb ,aac (6′)-Ⅱ,ant (2″)-Ⅰand a nt (3″)-Ⅰ;the quinolone s r esistant g ene qnr ;the T M P resistant g enes ,dfrA 1and dfrA 17;the disinfecta nt -sulfanilamide resistantg ene ,qacE ■1-sul1;the integ ron g ene s ,int Ⅰ-1,int Ⅰ-2and int Ⅰ-3;and the transpo so n g enes ,tnpA and merA .RESULTS W e found 9kinds of drug resistance genes in this K PN iso late .T hey w ere the beta -lactamases g enes ,blaT EM and blaS HV ;the metallo -beta -lactamasesgene blaK PC -2;the aminog ly coside s re sistant g enes ,aac (3)-Ⅱand ant (3″)-Ⅰ;the quino lo nes resistant g ene qnr ;the T M P resistant ge ne dfr A17;the disinfecta nt -sulfanilamide resistant g ene qacE ■1-sul1and the integ ron g ene s int Ⅰ-1.C ONC LUSIONS We discover e multiple drug resistant g ene s (some in the chr omosome ,some are plasmid -mediated )in this iso la te .We also find the inf requent plasmid -mediated drug resistant g ene blaK PC -2.We think it ′s conce rned with the pan -re sistant and the multi -drug resistant g ene s in this KP N ,and we must pay highly attention to this isolate in clinic .Key words :K lebsiella pneumoniae ;Drug resistance g enes ;P an -resistance
收稿日期:2009-02-16;　修回日期:2009-04-15基金项目:浙江省医学重点学科建设基金(07-010)通讯作者:吕火祥,E -mail :lab -lhx @
肺炎克雷伯菌(KPN )是临床分离及医院感染的重要致病菌之一,由肺炎克雷伯菌引起的医院感染率近年出现增高的趋势,且多药耐药菌株的不断
增加常导致临床抗菌药物治疗的失败和病程迁延。

泛耐药的非发酵菌的临床分离率越来越高,但泛耐药的肠杆菌属细菌报道较为少见[1,2]。

我院近期于重症监护病房(ICU )中的1例患者血液中分离到1
株对临床常用18种抗菌药物耐药的泛耐药肺炎克雷伯菌。

为探讨本菌株的耐药机制,我们采用聚合
酶链反应(PCR)法对本菌进行了9类,共计36种耐药基因检测。

现报道如下。

1　材料与方法
1.1　菌株来源及鉴定　菌株分离自ICU住院患者的血液培养中。

菌种经法国生物梅里埃公司VITEK-32鉴定,加做吲哚试验阴性确认。

1.2　药物敏感性试验　按照美国C LSI2006年版要求。

分别对氨苄西林、哌拉西林/他唑巴坦、头孢唑林、头孢曲松、头孢他啶、头孢吡肟、头孢西丁、氨曲南、庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星、左氧氟沙星、环丙沙星、呋喃妥因、复方新诺明、亚胺培南、美罗培南、头孢哌酮/舒巴坦进行K-B法及微量肉汤稀释法抗菌药物敏感性检测。

质控菌株:大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌A TCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临床检验中心。

1.3　基因检测方法
1.3.1　模板制备　挑纯培养菌落置入0.5ml离心管内(内预置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl), 56℃水浴2h,改95℃水浴10min,加入Chelex-10040μl,离心(15000r/min)30s。

上清液即为基因检测的模板液,-20℃冰箱保存备用。

1.3.2　基因的检测　均为PCR法。

各种靶基因PCR扩增体系均为:每反应体系P1、P2引物各0.5μmol/L,dNTPs各200mmol/L,KCl10mmol/L, (NH4)2SO48mmol/L,MgCl22mmol/L,Tris-HCl (pH9.0)10mmol/L,NP400.5%,BSA0.02%(w/v), Taq DNA pol1U。

总反应体积20μl(其中模板液5μl)。

PC R扩增产物>500bp热循环参数均为: 93℃预变性2min,然后93℃60s※55℃60s※72℃60s,循环35周期,最后一个72℃延长至5min。

PCR扩增产物<500bp热循环参数均为: 93℃预变性2min,然后93℃30s※55℃30s※72℃60s,循环35周期,最后一个72℃延长至5min。

产物经1%琼脂糖凝胶电泳,出现与阳性对照分子相当的目的条带判为阳性。

试剂盒、阳性对照DNA和PC R引物序列由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

引物序列见表1。

1.4　基因测序　对blaKPC基因扩增产物经纯化后,ABI3730型DNA自动测序仪进行序列分析。

2　结　果
2.1　抑菌环直径及M IC值　KPN对临床常用17种抗菌药物的抑菌环直径及M IC值,见表2。

2.2　耐药基因检测结果　对本株KPN检测了9类,计36种耐药基因。

结果检测出4类,计7种耐药基因。

分别为β-内酰胺酶基因blaTEM、blaS HV;碳青酶烯酶基因blaKPC-2;氨基糖苷修饰酶基因aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ;整合子遗传标记基因intⅠ1;消毒剂磺胺耐药qacE■1-sul1。

2.3　KPC-2基因测序序列　KPC扩增产物经DNA测序,基因序列长度为873个碱基,经上网(w w /BLAST n)比对为KPC-2型(与登录号为EU784136序列符合率99%)。

测序图见图1。

3　讨　论
目前,肺炎克雷伯菌多药耐药株越来越常见,常引起医院感染暴发。

肺炎克雷伯菌耐药机制主要包括产生β-内酰胺酶、生物被膜形成、外膜孔蛋白缺失、gy rAt和parC基因变异、抗菌药物主动外排等,抗菌药物耐药基因水平播散是多药耐药菌株在临床加剧的重要原因[3-7]。

超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)是临床肠杆菌科细菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药的重要机制。

近年来国内外产ESBLs肺炎克雷伯菌,在临床分离株中的检出率快速上升其所产的ESBLs种类也不断增多,给临床医疗带来了严峻的挑战[3,8]。

国内外报道以TEM、C TX-M和SH V型SBLs最为常见,并且这些菌株经常携带多个耐药基因[9,10]。

本试验菌株共检验出两种β-内酰胺酶基因有blaT EM、blaSHV。

碳青酶烯类抗菌药物常用于治疗产ESBLs的肺炎克雷伯菌,因此,近年来国内外耐碳青酶烯类抗菌药物肺炎克雷伯菌感染报道逐渐增多。

由质粒介导碳青酶烯酶基因blaKPC是肺炎克雷伯菌耐碳青酶烯类抗菌药物的重要原因[11-14],KPC型碳青酶烯酶可水解碳青酶烯类、青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗菌药物,有文献报道,KPC碳青酶烯酶有多个亚型[15]。

本次分离菌株检测出的碳青酶烯酶基因blaKPC经测序后为KPC-2基因。

经w w w. ncbi.nlm.nih.g ov/BLASTn网上比对发现,此KPC-2基因与发现在铜绿假单胞菌(EU176013),阴沟肠杆菌(DQ989640),大肠埃希菌(DQ989639),弗氏柠檬酸杆菌(EF062508)等菌种的检测出的质粒基因同源性达99%,可见此质粒可在不同的菌种间水平传播,国内外相继报道在多种肠杆菌科细菌中检测出KPC-2基因。

耐药基因在细菌间的水平转移,除了与质粒、转座子这些可移动遗传元件有关外,整合子的作用正日益受到重视。

整合子具有位点特异性基因重组系
表1　36种耐药基因PCR引物序列
基因名称 引物序列(5′※3′)　产物长度(bp) b laTEM P1:AGGAAGAGTA TGAT TCAACA P2:CTCG TCGT TTGGT ATGGC535
b laS H V P1:TGCGCAAGCTGC TGACC AGC P2:T TAGCG(T/C)TGC CAG TGCTCGA305
b laLEN P1:ATGCGT T(A/T)T(A/G)T TCGCC TGTG P2:GGCGCT CAGATGCTGCGC591
b laOKP P1:A(A/G)GCGCT TCCCGGCGACGTG P2:T TAGCG(T/C)TGC CAG TGCTCGA362
b laC TX-M-1群P1:ATGGT TAAAAAA TCACTGCGC P2:TCCCGACGGCT T TCCGC CT T833
b laC TX-M-2群P1:ATGA TGAC TCAGAGCAT TCG P2:TCCCGACGGCT T TCCGC CT T833
b laC TX-M-9群P1:CGGCC TGTA TT TCGCT GTTG P2:TCCCGACGGCT T TCCGC CT T793
b laOXA-1群P1:CTG TTG TT TGGG TT TCGCAAG P2:CT TGGC T TT TA TGC T TGATG440
b laOXA-2群P1:CAGGCGC(T/C)GTT CG(T/C)GATGAGT T P2:GC C(T/C)TCT ATCCAGT AATCGCC233
b laOXA-10群P1:GTC TT TC(A/G)AGTACGGCAT TA P2:GAT TT TC TTAGCGGCAACT TA822
ant(2″)-ⅠP1:GAGCGAAAT CTGCCGCT CTGG P2:CTG TT AC AACGGAC TGGCCGC320 qacE■1-sul1P1:T AGCGAGGGC TT TAC TAAGC P2:AT TCAGAATGCCGAACACCG300
dfrA1P1:T TGTGAAAC TATC AC TAA TGG TAG P2:CT TGT TAACCC TT T TGCC AGA480
dfrA17P1:T TGAAAAT ATCA TTGA TT TCT GC AG TG P2:GT TAGCC T TT T TTCC AAATC TGG TATG475
ant(3″)-ⅠP1:TGA TT TGCTGGT TACGGTGAC P2:CGCTA TGT TCTC T TGCT TT TG284
b laIM P P1:CGGCC(G/T)CAG GAG(A/C)G(G/T)C T TT P2:AACCAGT TT TGC(C/T)T TAC(C/T)AT587
b laCM Y/M OX P1:GC TGCTC AAGGAGCACAGGAT P2:CACAT TGACAT AGGT GTGGTGC520
b laVIM P1:AT TCCGGTCGG(A/G)GAGGTCCG P2:GAGCAAGT CTAGACCGCCCG633
b laPE R P1:AGTCAGCGGC T TAGATA P2:CGTA TGAAAAGGACAA TC978
b laGES P1:ATGCGCT TCA TTC ACGC AC P2:CT AT TTG TCCGTGCT CAGG846
b laVEB P1:GCGGT AAT TT AAC CAGA P2:GC CTA TGAGCC AG TGT T961
b laC ARB P1:AAAGC AGA TCT TGTGACC TA TTC P2:TC AGCGCGACTG TGATGT ATAAAC588
b laDH A P1:AACT T TCACAGG TGTGCT GGGT P2:CCGTACGCA TACTGGCT T TGC405
b laAC T/M IR P1:TCGGT AAAGCCGA TGT TGCGG P2:CT TCCAC TGCGGC TGCC AG TT303
aac(3)-ⅠP1:ACCT AC TCCCAAC ATCAGCC P2:AT ATAGATC TCAC TACGCGC169
aac(3)-ⅡP1:ACTG TGATGGGA TACGCGTC P2:CTCCG TCAGCGT TTC AGC TA237
aac(6′)-Ⅰb P1:ATGAC TGAGCA TGACCT TGC P2:T TAGGC ATCAC TGCGTGT TC519
aac(6′)-ⅡP1:T TCA TGTCCGCGAGC ACCC C P2:CGCTA TGT TCTC T TGCT TT TG178
intⅠ1P1:CCGAGGAT GCGAACCAC TT C P2:CCGCCACTGCGCCGT TACCA373
intⅠ2P1:CACGGA TATGCGACAAAAAGGT P2:GTAGCAAACGAGTGACGAAATG789
intⅠ3P1:GCC TCCGGCAGCGAC TT TCAG P2:ACGGA TCTGCC AAACC TGACT433
m erA P1:GACC AGCCGCAGT TCGT CTA P2:GC AGCA(G/C)GAAAGCTGCT TCA462
ant(3″)-ⅠP1:TGA TT TGCTGGT TACGGTGAC P2:CGCTA TGT TCTC T TGCT TT TG284
b laKPC P1:ATG TCACTG TATCGCCG TCT A P2:T TAC TGCCCG TTGACGCCCAA822
b laCM Y/LAT P1:TGGCCAGAACTGACAGGCAAA P2:T TT CTCC TGAACGTGGCTGGC462
qn rA P1:CAAGAGGAT T TCT CACGCC AG P2:GAAC TC TATGCCA AAGCAGT TGG240
统,可特异性地俘获和表达外源基因盒,并能够以质粒或转座子为载体在细菌间移动,导致耐药基因的快速和广泛播散[16]。

目前公认的整合子有Ⅳ类,其中Ⅰ类整合子是在捕获和表达耐药基因中最常见的,可携带多种耐药基因盒,包括对氨基糖苷类、喹喏酮类、磺胺和消毒剂等耐药的基因。

Ⅰ类整合子是最早被发现的整合子,其3′端保守片段含3个开放读码框(ORF):季铵盐化合物及溴乙锭的耐药基因(qacE■1),磺胺耐药基因(sul1),功能不明的开放读码框ORF5。

本次分离菌株检测出Ⅰ类整合子及qacE■1-sul1,氨基糖苷修饰酶基因aac(3)-Ⅱ、ant(3″)-Ⅰ,与磺胺类及氨基糖苷类抗菌药物耐药表型相符。

国内外报道,Ⅰ类整合子引起磺胺类及氨基糖苷类抗菌药物多药耐药[17]。

质粒和整合子-基因盒系统可能是耐药菌株多
表2　K PN抗菌药物的抑菌环直径及M IC值
抗菌药物抑菌环直径(mm)M IC值(μg/ml)氨苄西林6≥256
哌拉西林/他唑巴坦6128
头孢西丁6≥256
头孢唑林6≥256
头孢曲松6≥256
头孢他啶6128
头孢吡肟6128
头孢哌酮/舒巴坦6128
氨曲南6≥256
庆大霉素616
妥布霉素632
阿米卡星616
左氧氟沙星6≥16
复方新诺明21≥320
美罗培南1232
亚胺培南1316
图1　肺炎克雷伯菌K PC-2基因测序图
药耐药性产生和水平播散的重要原因。

本次试验仅从耐药基因方面对耐药性进行检测,未能检测出喹诺酮耐药和TM P耐药等耐药基因,可见该菌株的耐药机制还有待进一步研究。

了解泛耐药肺炎克雷伯菌的耐药机制,可以进一步指导临床合理使用抗菌药物,控制泛耐肺炎克雷伯菌流行。

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