免疫细胞分离及检测技术
免疫细胞的分离和保存技术
第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
第 免疫细胞的分 二 离和保存技术
十
章
何
印
蕾
概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身
免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞 或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用 体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋 巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所 显示的功能的强弱进行检测，是判断机体 细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临 床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情 变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等 方面均有重要意义。
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、 巴 CD25等 细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
(1)E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加 入分层液→T细胞形成E花环而沉 于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙毛分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤 维管→洗脱下来的是T细胞
胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll ) 其密度为1.020。可将血液分成四层， 从上到下依次是：血浆、单个核细胞、 粒细胞和红细胞。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液 密度为：1.135。可将血液分成四层， 从上到下依次是：死亡细胞和血小 板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞。
临床医学检验技师考试辅导临床免疫学和免疫检验 第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术练习题
第十四章免疫细胞的分离及其表面标志检测技术一、A11、已知细胞中的黏附能力最大的为A、树突状细胞B、单核细胞C、B细胞D、T细胞E、红细胞2、免疫细胞检测技术中外周血单个核细胞指的是A、有核细胞B、淋巴细胞C、单核细胞D、淋巴细胞和单核细胞E、幼稚细胞3、下列关于T细胞亚群的分离，说法错误的是A、原理是根据相应细胞的不同标志加以选择性纯化B、凡根据细胞的表面标志进行纯化得到所需要的细胞群是阳性选择法C、选择去除不需要的细胞群，仅留下所需要的细胞为阴性选择法D、E花环沉降法是最先进的细胞分选技术E、尼龙毛柱分离法是常用的分离方法4、下列有关转化的淋巴细胞的形态描述中，错误的是A、细胞变大B、出现空泡C、核仁消失D、染色质疏松E、胞质扩大5、检测T细胞数量的试验是A、溶血空斑试验B、SmIg荧光抗体染色试验C、巨噬细胞或白细胞移动抑制试验D、E玫瑰花环试验E、计算盘直接计数6、溶血空斑形成试验中，空斑的大小表示A、抗体生成细胞的多少B、抗体生成细胞的种类C、细胞的大小D、抗体生成细胞产生抗体的多少E、吞噬细胞的活性7、做自然杀伤细胞毒试验，敏感而常用的是哪种细胞株A、小鼠T细胞肿瘤细胞株B、人肺癌细胞C、K562细胞系D、小鼠细胞毒T细胞系E、L929细胞株8、具有抗肿瘤效应的第一道防线是A、TC细胞B、中性粒细胞C、TH细胞D、B细胞E、NK细胞9、下列不属于自然杀伤（NK）细胞检测方法的是A、酶释法和放射性核素法B、酶释法和荧光分析法C、放射性核素法和荧光分析法D、放射性核素法和荧光分析法和酶释法E、反向溶血空斑实验和酶释法10、可刺激B淋巴细胞增殖转化的刺激物是A、PWMB、PHAC、ConAD、MHCE、BCG11、用于临床评价病人免疫状况的试验中，评价T细胞功能的试验是A、血清免疫球蛋白检测B、溶血空斑试验C、淋巴细胞转化试验D、膜表面Ig测定E、EA花环试验12、关于单个核细胞说法错误的是A、单个核细胞包括淋巴细胞、单核细胞B、单个核细胞的体积、形态、比重与其他细胞不同C、可利用单个核细胞的体积不同，按照密度梯度来分离D、在进行密度梯度分离时，单个核细胞比重比溶液的比重大E、多核粒细胞比重比单个核细胞比重大13、采用密度梯度分离法分离得到的细胞主要为A、单核细胞和粒细胞B、单核细胞C、淋巴细胞D、淋巴细胞和单核细胞E、淋巴细胞和粒细胞14、利用E花环沉降法可分离A、单核细胞和B细胞B、浆细胞和粒细胞C、B细胞和T细胞D、B细胞和粒细胞E、B细胞和吞噬细胞15、对分离细胞的保存说法错误的是A、用适量的10%～20%小牛血清的Hanks等培养液重悬B、以二甲亚砜作为保护剂C、短期保存中，放4℃保存D、短期保存中，迅速改变细胞所处的温度，以免造成温度休克E、长期保存中，放在液氮中，-196℃16、从单个核细胞悬液中分离出单核细胞的方法不包括A、E花环沉降法B、贴壁黏附法C、吸附柱过滤法D、磁铁吸引法E、Percoll分离液法17、下列关于淋巴细胞分离的说法错误的是A、进行细胞免疫的检测，一般须将待检淋巴细胞从血液中或组织中分离出来B、外周血细胞单个核细胞包括淋巴细胞、粒细胞和红细胞C、利用外周血的细胞的理化特性的差异可以分离不同的细胞群体D、淋巴细胞的理化特性与其他细胞差异很小，用简单的方法不易分离纯化E、淋巴细胞的分离利用专门的淋巴细胞分离纯化技术18、细胞活力测定常用的简便方法是A、伊红染色B、美蓝染色C、台盼蓝染色D、抗酸染色E、HE染色19、LPS可激发哪种细胞转化A、B细胞B、T细胞C、自然杀伤（NK）细胞D、杀伤细胞E、巨噬细胞20、可刺激T细胞增殖的刺激物是A、ConAB、MHCC、SPAD、AFPE、LPS21、自然杀伤（NK）细胞具有A、对TI抗原应答效应B、ADCCC、对TD抗原应答D、主要分泌细胞因子作用E、特异杀伤肿瘤细胞作用22、属于非抗原刺激物的物质是A、SRBCB、BCGC、LPSD、类毒素E、抗毒素血清23、关于溶血空斑试验的叙述错误的是A、1个空斑代表1个抗体生成细胞B、需要绵羊红细胞和补体参与C、空斑大小代表抗体产生的多少D、是可检测B淋巴细胞功能的一种体外试验方法E、只可检测IgG类抗体24、下列哪项不是T细胞表面标志的检测方法A、SmIg的检测B、抗体致敏细胞花环法C、免疫金银染色法D、免疫荧光法E、ABC法25、溶血空斑试验检测的是哪类细胞的功能A、T淋巴细胞B、巨噬细胞C、自然杀伤（NK）细胞D、B淋巴细胞E、LAK细胞答案部分一、A11、【正确答案】B【答案解析】单核细胞具有在37℃和Ca2＋存在时，能主动黏附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性。
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
免疫细胞的分离及其表面标志检测技术试题_1
[单选]检测NK细胞不能采用的实验方法是（）A.酶联免疫斑点实验B.酶释法C.放射性核素法D.荧光分析法E.电泳分析[单选]Ts细胞的特性不包括（）A.具有免疫调节功能的细胞B.作用方式为非特异性C.受MHC分子的限制D.抑制自身反应性T细胞克隆E.抑制机体对非己抗原的免疫应答[单选]T细胞阳性选择的主要目的是（）A.选择出对自身抗原不发生免疫应答的细胞克隆超级通 云控 微信云控 / 好用的云控 云控官网B.选择掉对自身抗原发生免疫应答的细胞克隆C.实现自身免疫耐受D.实现对自身MHC分子的限制性E.实现TCR功能性成熟[单选]可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态的试验是（）A.噬菌体裂解实验B.溶血试验C.空斑形成试验D.T淋巴细胞转化试验E.T细胞表面标志检测[单选]T、B细胞表面共有的标志是（）A.CD3B.PWM－RC.绵羊红细胞受体D.补体受体E.CD80分子[单选]溶血空斑形成试验中，每一个空斑表示（）A.一种抗体B.一种抗体形成细胞C.一种细胞D.一个细胞E.一个抗体形成细胞[单选]胸腺细胞发生阴性选择时发生在（）A.双阳性期B.双阴性期C.单阳性期D.前T细胞期超级通 云控 微信云控 / 好用的云控 云控官网E.祖T细胞期[单选]以下受体中，哪一项是B细胞所特有的（）A.Fc受体B.补体受体C.SmIgD.EB病毒受体E.小鼠红细胞受体[单选]分离纯化淋巴细胞亚群的基本原理是（）A.相应细胞体积不同特点B.相应细胞具有不同的表面标志C.形态不同特点D.相应细胞贴壁生长特点E.相应细胞具有吞噬性的特点[单选]楼梯结构的一些细部构造在平面图中无法表示出来，需要绘制相同，应用的比例尺为()。
A、1:1000B、1:200C、1:00D、1:20[单选]屋顶平面图是屋顶的水平投影，可见轮廓线的投影均用()表示。
A、虚线B、中实线C、细实线D、粗实线[单选]某三层办公楼勒脚以上外围结构水平投影面积为500m2，首层车库层高为2.2m，二、三层层高均为3.2m。
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞分离技术
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人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
免疫学检验-免疫细胞及其功能检验技术
一、白细胞的分离 （一）自然沉降法
加抗凝血于试管中
室温或37℃中静置 （30-60min）
分层
结果示意图
（二）高分子聚合物沉降法
抗凝血与等量3%明胶或 6%右旋糖酐溶液混匀
室温或37℃中静置 （30～60min）
分层结果与自然沉降法 类似
四、吞噬细胞的分离
•吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞 噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器 官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中 性粒细胞。 •分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。
（一）单核细胞的分离
• Percoll密度梯度分离法 • 流式细胞术分离法（常用方法） • 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法
） • 黏附法
黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除 单核细胞。
（二）巨噬细胞的分离
• 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）
操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前 臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出 现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。
• 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）
优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加
二、外周血单个核细胞的分离
•外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴 细胞和单核细胞。 •PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 •PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。
人外周血中各类血细胞密度
（二） Percoll分层液法
连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离
15-免疫细胞的分离和保存技术
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、
巴
CD25等。
细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22、 CD29等。
1、E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+ SRBC悬液→加入 分层液→T细胞形成E花环而沉于管→ 悬液中为B细胞。
2、尼龙毛分离法
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管 →洗脱下来的是T细胞。
（二）斑螯敷法
•此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细胞。 •方法：
用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液 → 贴敷在臂内侧皮肤表面 → 4~5小时后皮肤局部充血 → 48小时后局部形成水泡 → 吸取水泡中的组织液，内 含大量巨噬细胞。 •但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感 染。
• 中性粒细胞的分离
→与磁珠结合的细胞运动将受限， 未与磁珠结合的细胞将先被洗脱
→再将该柱移出磁场
→与磁珠结合的细胞将被洗脱。
5、磁性激活细胞 分离器分离法
6、淘选法 (利用 表面标志分离淋 巴细胞亚群）
五、单核巨噬细胞的分离
（一）Percoll分离法 •此法从外周血中分离出单核-巨噬细 胞，但由于此类细胞在外周血中的含 量较低，分离时所需的血量较多。
人：静脉采血，抗凝剂抗凝。 动物：颈静脉采血法、尾部采血法、
眼眶采血法、心脏采血法等。
二、外周血中白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600:1~1000:1， ➢ 两者的比重不同，其沉降速度也不同，通常
用两种方法加以分离。 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉淀法 ➢ 或采用0.83%氯化铵分离法使红细胞破裂后， 洗涤得到白细胞。
2、吸附柱过滤法 •将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下 来的主要是淋巴细胞。
项目十六 免疫细胞的分离
项目十六免疫细胞的分离一、抗凝血的制备【实验原理】常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固。
实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法。
【试剂和器材】1．试剂肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等。
2．器材三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。
【步骤和方法】1．肝素抗凝法将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115℃灭菌10min(或112℃15min)，置-20℃可保存数月。
实验中常用的肝素抗凝浓度为20~50U/ml血液，实际当肝素浓度为5~10U/ml血液时已显出良好的抗凝效果。
2．EDTA法常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液。
配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解。
用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝。
EDTA-Na2有效抗凝浓度为1~2mg/ml血液。
3．脱纤维法在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放30~40粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。
4．Alsever液抗凝法血液与Aalsever液混合比例为1:1~1:2。
【结果判定】除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备。
【注意事项】1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。
2．加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止。
常采用旋转混合的方法混匀。
3．抗凝血放4℃保存。
【方法评价】肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)。
EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集。
脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少。
Alsever可较长时间保存血液，一般可保存2~3周。
免疫实验 免疫学及免疫检测技术试验
2、加于淋巴细胞分离液上层，离心：500g 20min
（小于1000rpm)
！沿管壁滴加
!淋巴细胞分离液取法
离心
单个核细胞 （斜面！）
3、吸出细胞，悬于营养缓冲液（1～2倍量含5IU/ml 肝素、2％灭活小牛血清的PBS液 ），离心：200g 10min，除去血小板。
4、洗涤：同样营养液洗涤2次，洗去淋巴细胞分离 液，离心： 500g 10min
免疫学实验
实验一、外周血单个核细胞的分离
单个核细胞： 一、基本原理 ?常用哪些方法分离细胞，免疫学可采用哪些方法 本实验是利用不同的细胞之间密度不同的性质，通过 速度沉降法来分离制备外周血中单个核细胞。 二、操作： 1、稀释血：1ml血+1ml缓冲液（含5～10IU/ml肝素的 PBS，无血清 ）（用滴管）
•荧光各孔：阴性对照：Ab-Ag-FITC-Ab，阳性对照用 200ng/ml，500ng/ml
37℃，1hr，洗涤液洗涤三次
3、加酶标抗体、荧光标记抗体：
•所有ELISA各孔均加100ul（已稀释好,稀释倍数：2000
•各荧光孔不加酶标抗体，加荧光标记抗体100ul,(已稀释 好，稀释倍数：50)
实验四、免疫荧光检测技术
一、基本原理：
荧光双抗夹心法定位与定量抗原
二、操作：
1、抗体包被：（同实验二） 2、加样本：同实验二，但在本实验中不做标准曲 线，样品加两个稀释浓度，如1：20，1：40，另外 加一个阳性对照（用人IgG标准），每孔做一个复 孔，加空白对照共计8孔。 3、加荧光抗体：从这里开始与实验二不同之处是 一定要记得避光操作。按照要求加入一定稀释度的 荧光标记抗人IgG抗体（一般为1：80倍左右），避 光37℃保温箱中保温30-45分钟。
免疫细胞提取方法-详细解释说明
免疫细胞提取方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述免疫细胞提取方法是一种技术手段，用于从生物样本中提取和分离免疫细胞。
免疫细胞是免疫系统中的重要组成部分，能够识别和消除入侵的病原体以及异常细胞，起到维护机体免疫平衡和保持正常生理功能的关键作用。
随着对免疫细胞的研究不断深入，越来越多的科研和临床应用需要对免疫细胞进行进一步的分析和研究。
免疫细胞提取方法的发展和优化对于免疫学领域的研究人员和医生来说具有重要意义。
本文旨在综述和分析免疫细胞提取方法的背景、问题以及未来的发展方向。
首先，我们将对免疫细胞提取方法的背景进行概述，包括该技术的起源、发展历程以及目前已有的主要提取方法。
其次，我们将探讨免疫细胞提取方法的重要性，包括在研究领域的应用前景和临床诊断治疗中的重要作用。
最后，我们将着重讨论目前存在的免疫细胞提取方法的问题，如提取效率、纯度、损伤等方面的局限性，并对未来的免疫细胞提取方法进行展望，探讨可能的改进和突破。
通过本文的分析和总结，我们将能够更全面地了解免疫细胞提取方法的现状和挑战，并为未来的研究和应用提供思路和参考。
希望本文能够对免疫学领域的研究人员和医学工作者提供有益的信息，推动免疫细胞提取方法的发展和应用。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以进行如下编写：文章结构部分旨在介绍本篇长文的组织和内容。
本篇文章主要探讨免疫细胞提取方法，并对该研究领域进行概述、分析和总结。
首先，在第一部分的引言中，我们将提供对本文的概述。
我们将对免疫细胞提取方法的背景和重要性进行简要介绍，并阐述本文的目的。
通过这一部分，读者可以对免疫细胞提取方法有一个整体的了解，以及对本文的研究目标有所把握。
接下来，在第二部分的正文中，我们将深入探讨免疫细胞提取方法的背景、重要性以及目前存在的问题。
我们将指出免疫细胞提取方法的基本原理和技术，并分析其在免疫学研究和临床应用中的重要性。
同时，我们也将讨论目前存在的免疫细胞提取方法的问题，如提取效率、纯度和可重复性等方面的种种挑战。
第十三章 免疫细胞分离及检测技术 一、选择题 A1 型题(标 …
三、名词解释 1．PBMC：即外周血单个核细胞,包括淋巴细胞和单核细胞。 2．SmIg：是 B 细胞表面的膜免疫球蛋白，是 B 细胞特有的表面标志，是鉴定 B 细胞可靠的 指标。
15.下列哪种是 NK 细胞特有的表面抗原？ A.CD2 B.CD16 C.CD56 D.CD39 E.无特异表面抗原 16.仅作用于 T 细胞的非特异性刺激物是： A.PWM B.PHA C.LPS D.ConA E.EBV 17．既作用于 T 细胞又作用 B 细胞的非特异性刺激物是： A.PWM B.PHA C.LPS D.可溶性 SPA E.EBV 18．T 细胞亚群功能的判定主要根据： A.CD4/CD8 B.T 细胞亚群计数 C.T 细胞表面标志数目的多少 D.T 细胞浆内酸性磷酸酶的水平 E.T 细胞分泌的有关细胞因子水平 19．溶血空斑试验主要是用来检测何种细胞的的功能？ A.T 细胞 B.B 细胞 C.中性粒细胞 D.吞噬细胞 E.NK 细胞 20．淋巴细胞功能体内试验的方法主要是： A.转化试验 B.对异物排斥反应的能力 C.迟发型超敏反应 D.淋巴细胞计数 E.血清中 Ig 浓度的检测 21．正常情况下，健康人外周血经 PHA 刺激后，淋巴细胞转化率为： A.<40% B.40%-50% C.60%-80% D.80%± E.>90% 22．采用放射性核素法检测 T 淋巴细胞转化功能时，3H-TdR 加入至培养基的时间是： A.G0 期
细胞大小直径m1220细胞核大小染色质核仁有丝分裂细胞浆胞质着色空泡伪足转化的淋巴细胞原淋巴细胞过渡型1216增大疏松有或无无增多嗜碱有或无有或无未转化淋巴细胞68不增大密集无无极少天青色无无增大疏松清晰14个有或无增多嗜碱有或无有或无五论述题五论述题1
免疫细胞的分离技术
CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、
CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)
髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、
CD257(BAFF)、CD312(EMR2)
血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、
➢ 不同细胞密度不同 ➢ 不同细胞表面生物学特性不同 ➢ 不同细胞表面分化抗原不同
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免疫细胞的分离技术
根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法） 3、磁性分离法 4、荧光激活分离法 5、其他分离法（花环沉降法）
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（一）外周血单个核细胞分离
加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的 一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细 胞、树突状细胞、B细胞
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其他细胞
自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中 性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等
NK细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板
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免疫细胞的特征
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方法 （以CD4+T细胞为例）
1. 羊抗兔Ig包被平皿 2. CD4 一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时； 3. 收集未粘附的CD4-T细胞 4. PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞 5. 收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微
镜下观察
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免疫磁珠法 （Magnetic activated cell
CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、
免疫细胞检测技术
免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其他抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、肥大细胞等。
各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中的作用及相互关系有着重要意义。
免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，藉以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有一定意义。
本综述将就免疫细胞的分离、免疫细胞功能的检测和细胞凋亡的检测三个方面主要方法的基本原理作简要介绍。
一．免疫细胞的分离免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。
它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是分离各种免疫细胞的基础。
细胞的形态特征反映在其物理性质上，如各种细胞的大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异;而细胞的功能特征往往由该细胞膜表面的蛋白质(表面标记)来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的受体等。
根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离出来。
免疫细胞分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于细胞表面标记的分离方法。
基于细胞物理性状的分离方法(一)根据各种细胞比重的差异1.自然沉降法2.密度梯度离心法人外周血单个核细胞(PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为1.00左右，而淋巴细胞和单个核细胞比重为 1.075左右。
利用密度在l.077万±0.001之间近于等渗的Ficoll-Hypque混合溶液(称为淋巴细胞分层液)作密度梯度离心时，各种血液成分将按密度梯度重新分布聚集。
血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层被的上部;红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层液，故位于分层被界面上，这样就可获得PBMC o（如图1-1所示）图1-1 淋巴细胞分离示意图3.改变细胞密度法巨噬细胞能够吞噬铁粉，增加其比重，通过密度梯度离心或磁场将其分离;T 细胞能够与绵羊红细胞形成花环，形成的花环复合物比重大，借助密度梯度离心将T细胞分离。
免疫细胞分离技术
免疫细胞分离技术免疫细胞分离技术是一种重要的生物学和医学研究工具，广泛应用于生物样本中细胞的分离和纯化。
通过利用细胞表面的特异性标记，免疫细胞分离技术可以实现对不同类型细胞的高灵敏度、高特异性的分离。
在免疫学研究领域，免疫细胞分离技术被广泛应用于研究免疫细胞的功能和相互作用，对于深入理解免疫系统的机制具有重要意义。
免疫细胞分离技术的基本原理是利用抗体与特定细胞表面标记结合的高度特异性，通过各种分离方法将该细胞与其他非特异性细胞分离开来。
免疫细胞分离技术通常包括两个关键步骤：抗体与目标细胞的特异性结合和分离纯化。
在抗体结合的过程中，通过将抗体与目标细胞共孵育，使抗体与目标细胞表面标记结合形成抗原-抗体复合物。
而在分离纯化的过程中，可以通过多种方法将抗原-抗体复合物与其他非特异性细胞分离开来，如磁性珠分离、流式细胞仪分离等。
免疫细胞分离技术的关键是选择合适的特异性抗体。
抗体是由机体免疫系统产生的一种高度特异性的蛋白质，具有与目标抗原结合的能力。
在选择抗体时，需要考虑以下几个因素：第一，抗体的特异性；第二，抗体的亲和力和亲和常数；第三，抗体的结合位点；第四，抗体的格式和标记。
合理选择和设计抗体可以提高免疫细胞分离技术的效率和准确性。
在免疫细胞分离技术中，常用的方法之一是磁性珠分离法。
该方法利用表面覆有特定抗体的磁性珠与目标细胞结合，通过磁外场将目标细胞分离出来。
磁性珠分离法具有分离效率高、操作简便、适用范围广等优点，被广泛用于体外培养细胞、临床诊断和基础研究等领域。
另一种常用的免疫细胞分离技术是流式细胞仪分离法。
流式细胞仪是一种高速流动和高灵敏度激光共聚焦技术，可以对单个细胞进行多参数检测和鉴定。
在流式细胞仪分离中，通过合适的荧光染料或荧光标记抗体，结合流式细胞仪对细胞进行定量、快速分析和筛选。
流式细胞仪分离技术具有分离速度快、高通量、对样本体积要求小等优点，广泛应用于细胞表型分析和免疫学研究。
除了磁性珠分离法和流式细胞仪分离法，还有其他依赖于抗体与抗原结合的分离方法，如免疫磁珠分离法、免疫离心法、免疫亲和层析法等。
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第十三章免疫细胞分离及检测技术本章考点1.免疫细胞的分离2.淋巴细胞表面标志的检测3.淋巴细胞功能检测技术4.免疫细胞检测的临床意义第一节免疫细胞的分离一、外周血单个核细胞的分离1.原理：外周血中单个核细胞（淋巴细胞和单核细胞）的比重与红细胞、多核白细胞及血小板不同，介于1.075～1.090之间，红细胞及粒细胞在1.092左右，血小板在1.030～1.035之间。
因而可利用一种比重介于1.075～1.092之间，而近于等渗的溶液作密度梯度离心，使一定比重的细胞按相应密度梯度分布而加以分离。
2.试剂：常用的分层液有Ficoll与Percoll两种（1）Ficoll分层液法：主要用于分离外周血中单个核细胞，是一种单次密度梯度离心分离法，其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
Ficoll分层液即聚蔗糖-泛影葡胺，是一种较理想的细胞分层液，其主要成分是一种合成的蔗糖聚合物，具有高密度、低渗透压、无毒性的特点。
操作时，将分层液置于试管下层，然后将肝素化的全血或白细胞悬液以Hanks或PBS液稀释后，轻轻铺于分层液面上，经2000rpm15-20min离心后，红细胞与粒细胞因比重大于分层液，故较快沉于管底。
血小板则比重小于分层液而悬浮于血浆中。
唯有与分层液比重相当的单核细胞和淋巴细胞密集于血浆层和分层液的界面中。
其分布由上到下依次为：稀释的血浆层，单个核细胞层，粒细胞层和红细胞层。
见下图。
图聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法外周血小分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷（2）Percoll分层液法：是一种连续密度梯度离心分离法，其分布由上至下依次为：死细胞层，富含单核细胞组分层，富含淋巴细胞的组分层及红细胞与粒细胞组分层。
图连续密度梯度离心法分离单个核细胞中各细胞成分的分布示意图引自陶义训主编：免疫学和免疫学检验，人民卫生出版社1995年9月第1版第4次印刷二、淋巴细胞的分离1.纯淋巴细胞群的采集：利用单核细胞在37℃和Ca2+存在时，能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，从单个核细胞悬液中除去单核细胞，从而获得纯淋巴细胞群。
主要的方法有：①粘附贴壁法；②吸附柱过滤法；③磁铁吸引法。
2.淋巴细胞亚群的分离原则：根据相应细胞的特性和不同的标志加以选择性纯化。
根据细胞的特性和标志选择纯化所需细胞的方法是阳性选择法，而选择性去除不要的细胞，仅留下所需的细胞为阴性选择。
常用的方法包括：①E花环沉降法；②尼龙毛柱分离法；③亲和板结合分离法；④磁性微球分离法及荧光激活细胞分离仪分离法。
三、淋巴细胞的保存与活力测定1.淋巴细胞的保存技术（1）短期保存技术：将分离的细胞用适量含10%～20%灭活小牛血清的Hanks、Tc-199、RPMIl640或其他培养液稀释重悬。
短期保存可置于4℃保存。
（2）长期保存技术：液氮深低温（-196℃）环境保存细胞，加入二甲亚砜作为保护剂。
2.活力测定：最简便常用的为台盼蓝染色法。
台盼蓝又称锥蓝，是一种阴离子型染料，这种染料不能透过活细胞正常完整的细胞膜，故活细胞不着色，但死亡细胞的细胞膜通透性增加，可使染料通过细胞膜进入细胞内，使死细胞着色呈蓝色，通过死亡细胞与活细胞的百分比可反映细胞活力。
第二节淋巴细胞表面标志的检测一、T细胞表面标志的检测1.特异性抗原检测：用单克隆抗体检测T细胞表面抗原的方法有两大类：一类是用标记抗体染色，如免疫荧光法、酶免疫法、ABC法及免疫金银染色法；另一类用抗体致敏的红细胞作花环试验。
2.特异性受体的检测原理：T细胞表面有特异性绵羊红细胞（E）受体，当人的T细胞与绵羊红细胞悬液按一定比例混合后，置4℃至少2小时或过夜，T细胞表面的E受体可与绵羊红细胞结合形成玫瑰花样的花环，称为活性E（Ea）花环。
检测Ea花环形成细胞可反映受检者的细胞免疫水平。
3.T细胞亚群检测：见第二十二章流式细胞仪分析技术。
二、B细胞表面标志的检测B细胞具有多种特异性抗原和受体，据此建立了相应的检测方法，一般用以研究B细胞各分化发育阶段的特性，也可藉以鉴定和计数各阶段B细胞在人外周血和淋巴样组织的分布以及疾病时的变化动态，为临床提供诊治相关疾病的有用信息。
1.B细胞表面抗原的检测：B细胞表面有CD19、CD20、CD21、CD22和CD29等分化抗原，其中有些系全部B细胞所共有，而有些仅活化B细胞所特有，据此可用相应的CD系列单克隆抗体，通过间接荧光免疫法、酶免疫组化或ABC法加以检测。
2.SmIg的检测：大多采用间接荧光免疫法或包括ABC法在内的酶免疫组化法，关键是选用高效价、高特异性和高亲和力的荧光或酶标记的多价抗人Ig抗体，也可分别用各种类型的Ig，即IgM、IgG、IgA、IgE 等抗血清，检测带有各种类型Ig的B细胞，在人外周血中以带有SmIgM的细胞数为最多。
B细胞经荧光标记的抗Ig抗体染色，细胞膜表面呈现的荧光着色可有不同的形式，开始均匀分布呈环状，其后集中在某些部位呈斑点状，然后又可集在一个部位呈帽状，最后可被吞饮入胞浆直至荧光消失。
这一现象是由于淋巴细胞膜由双层类脂组成，上嵌有蛋白分子，在体温条件下，膜呈半液体状，而镶嵌物能在其中移动。
当SmIg 抗体发生结合时，由于抗血清为双价，使SmIg出现交联现象，这种抗原与抗体结合物可连成斑点和帽状，时间过长，帽状结合物可脱落或被吞饮而消失，因此染色后，观察时间不能超过30min，或在染色时加叠氮钠防止帽状物形成或被吞饮。
三、自然杀伤细胞（NK）及功能的检测NK细胞表面至少存在CD2、CD11b、CD11c、CDl6、CD56和CD69等多种抗原，但均非NK细胞所特有，因此极少以CD系列抗原为指标鉴定和计数NK细胞，现多检测NK细胞活性，因NK细胞具有细胞介导的细胞毒作用，它能直接杀伤靶细胞。
测定人NK细胞活性多以K562细胞株作为靶细胞，而测小鼠NK细胞活性则用YAC细胞株，检测方法多种多样。
1.形态法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合温育，继用台盼蓝或伊红Y等活细胞拒染的染料处理，然后分别计数着染的死细胞和不着染的活细胞，推算NK细胞活性。
2.酶释放法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合温育，离心沉淀，取上清液检测靶细胞遭破坏后释放出的酶含量。
3.荧光法：用荧光素标记靶细胞，经与效应细胞共温后，离心去上清，用荧光计检测剩余的活靶细胞的荧光。
4.核素法：将效应细胞与靶细胞按一定比例混合共温后，离心检测上清液或剩余靶细胞放射性的量，间接反映其活性。
方法有靶细胞胞浆释放法和胞核释放法两种。
5.化学发光法：当效应细胞与靶细胞接触时，效应细胞呼吸暴发，生成极不稳定的O2-及OH-，放出光子，在发光剂存在条件下，可被光电倍增管接受和计数，发光量与NK细胞杀伤能力相关。
第三节淋巴细胞功能检测技术一、T细胞功能的检测1.T细胞增殖试验：又称T细胞转化试验。
T细胞在体外经某种物质刺激，细胞代谢和形态相继发生变化，在24～48h内细胞内蛋白质和核酸的合成增加，产生一系列增殖的变化，如细胞变大、细胞浆扩大、出现空泡、核仁明显、核染色质疏松等，由淋巴细胞转变为淋巴母细胞。
因此，这种淋巴细胞增殖又称为淋巴细胞转化。
据此可判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。
（1）非抗原性刺激物：如植物血凝素（PHA）、刀豆素A（ConA）、美洲商陆（PWM）、脂多糖（LPS），通称促有丝分裂原。
其中LPS刺激B细胞，PWM可刺激T和B类细胞，PHA和ConA刺激T细胞增殖。
（2）抗原性刺激物：如结核菌素、葡萄球菌毒素、破伤风类毒素、链球菌激酶、肿瘤抗原、同种异型组织抗原等。
2.T细胞增殖试验类型（1）形态法：其原则是将外周血液或分离的单个细胞与适量的植物血凝素（PHA）混合，置37℃培养72h，取培养细胞作涂片染色镜检。
据细胞的大小、核与胞浆的比例、胞浆的染色性和核结构以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡性母细胞和核有丝分裂相以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞，计算转化率。
（2）核素法：绝大多数外周血T细胞通常处于细胞周期的G0期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从G0期进入G1期，开始合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准备物质基础，然后进入S期，细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加入3H标记的TdR，后者掺入新合成的DNA中，据掺入的多少推测细胞增殖程度。
3.T细胞介导的细胞毒试验：T细胞介导的细胞毒试验是细胞毒性T细胞的特性，凡致敏T细胞再次遇相应靶细胞抗原，可表现出破坏和溶解靶细胞，它是评价机体细胞免疫水平的一种常用指标。
该试验原则是选用适当的靶细胞（常用可传代的已建株的人肿瘤细胞如人肝癌、食管癌、胃癌等细胞株），经培养后制成一定浓度的细胞悬液，按一定比例与待检的淋巴细胞混合，共温育一定时间，观察肿瘤细胞杀伤的情况。
二、B细胞功能的检测1.B细胞早期活性指标的测定：B细胞经不同抗原激发即开始分化增殖，初期表现为体积增大，可用仪器加以检测。
激活的B细胞表面MHCⅡ类抗原的表达增多，可用相应的单克隆抗体通过荧光免疫或ABC法检测。
2.溶血空斑形成试验：经典的溶血斑试验用于检测实验动物抗体形成细胞的功能，其原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫小鼠，4天后取出脾细胞，加入SRBC及补体，混合在温热的琼脂溶液中，浇在平皿内或玻片上，使成一蒲层，置37℃温育。
由于脾细胞内的抗体生成细胞可释放抗SRBC抗体，使其周围的SRBC 致敏，在补体参与下导致SRBC溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaque）。
每一个空斑表示一个抗体形成细胞，空斑大小表示抗体生成细胞产生抗体的多少。
这种直接法所测的细胞为IgM生成细胞，其他类型Ig由于溶血效应较低，不能直接检测，可用间接检测法，即在小鼠脾细胞和SRBC 混合时，再加抗鼠Ig抗体（如兔抗鼠Ig），使抗体生成细胞所产生的IgG或IgA与抗Ig抗体结合成复合物，此时能活化补体导致溶血，称间接空斑试验。
但是上述直接和间接空斑形成试验都只能检测抗红细胞抗体的产生细胞，而且需要事先免疫，难以检测人类的抗体产生情况。
如果用一定方法将SRBC用其它抗原包被，则可检查与该抗原相应的抗体产生细胞，这种非红细胞抗体溶血空斑试验称为空斑形成试验，它的应用范围较大。
现在常用的为SPA-SRBC溶血空斑试验。
SBA能与人及多数哺乳动物IgG的Fc段呈非特异性结合，利用这一特征，首先将SPA包被SRBC，然后进行溶血空斑测定，可提高敏感度和应用范围。
在该测试系统中，加入抗人Ig抗体，可与受检细胞产生的免疫球蛋白结合形成复合物，复合物上的Fc段可与连接在SRBC上的SPA结合，同时激活补体，使SRBC溶解形成空斑。