医学免疫学实验指导：免疫细胞的检测
免疫细胞检测方式免疫组织化学
免疫细胞检测方式免疫组织化学下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢!本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!免疫细胞检测方式：免疫组织化学导言免疫组织化学是一种广泛应用于生物医学领域的技术，通过检测细胞或组织中特定的抗原或蛋白质，来了解细胞状态、疾病诊断以及药物治疗效果等方面的信息。
免疫细胞功能检测技术
免疫细胞功能检测技术传统的免疫细胞功能检测方法主要包括流式细胞术、细胞增殖试验和细胞毒性试验等。
其中，流式细胞术是一种常用的细胞表面标记物检测方法，可以通过检测细胞表面标记物的表达情况来评估免疫细胞的活性和状态。
细胞增殖试验可以评估免疫细胞的增殖能力，常用的方法包括MTT法和BrdU法等。
细胞毒性试验可以评估免疫细胞对靶细胞的杀伤能力，常用的方法包括细胞色素释放试验和细胞活性检测试剂盒等。
然而，传统的免疫细胞功能检测方法存在一些局限性。
首先，这些方法往往需要大量的细胞数目，且操作繁琐，不适用于临床应用。
其次，这些方法只能评估其中一方面的免疫功能，无法全面评估免疫细胞的整体功能状态。
此外，传统方法对于一些免疫细胞功能的检测灵敏度较低，无法满足一些特殊研究和临床需求。
近年来，随着生物技术的发展，一些新的免疫细胞功能检测技术逐渐崭露头角。
其中，高通量测序技术的应用为免疫细胞功能检测带来了革命性的突破。
高通量测序可以同时检测上千个基因的表达水平，可以用来评估免疫细胞的基因表达谱，并通过生物信息学方法分析不同样本的差异。
通过这种方法，可以全面了解免疫细胞的活性和功能状态。
另外，单细胞技术也是一种新兴的免疫细胞功能检测技术。
传统的免疫细胞功能检测方法通常是对大量细胞进行分析，无法检测到细胞群体中不同细胞的异质性。
而单细胞技术可以对单个细胞进行检测和分析，可以检测到不同细胞的功能差异，并研究细胞在群体中的相互作用。
单细胞技术可以通过扩增检测目标区域的方法，同时检测多个指标，可以全面评估免疫细胞的功能状态。
除了高通量测序和单细胞技术，还有一些新兴的免疫细胞功能检测技术值得关注。
例如，质谱技术可以定量检测细胞因子的分泌水平，可以评估免疫细胞的功能状态。
另外，光学显微镜技术可以直接观察免疫细胞的活动过程，可以评估细胞的运动能力和活跃度。
总而言之，免疫细胞功能检测技术的发展为了解免疫细胞的功能状态提供了新的手段。
高通量测序、单细胞技术、质谱技术和光学显微镜技术等新兴技术可以全面、准确地评估免疫细胞的功能状态，有望在临床和科研领域发挥重要作用。
免疫细胞因子检测方法
免疫细胞因子检测方法
下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!
Download Tip: This document has been carefully written by the editor. I hope that after you download, they can help you solve practical problems. After downloading, the document can be customized and modified. Please adjust and use it according to actual needs. Thank you!
免疫细胞因子检测方法：
①生物学测定：利用细胞因子的特定生物活性，通过靶细胞反应测定其活性水平，如细胞增殖、抗病毒试验等，结果以活性单位表示。
②免疫学测定：凭借细胞因子的抗原性，采用抗体与其特异性结合的原理，常用方法包括ELISA（酶联免疫吸附试验）、流式细胞分析、ELISPOT（酶联免疫斑点试验），适用于可溶性及细胞内细胞因子的定量检测。
③分子生物学测定：检测细胞因子的基因表达水平，包括mRNA（如RT-PCR、Northern blot）和DNA分析（如PCR、Southern blot），间接反映细胞因子浓度，适用于早期表达变化及细胞内机制研究。
这些方法各有优势，生物学测定直接反映活性但操作复杂；免疫学测定简便灵敏，广泛应用于科研与临床；分子生物学测定灵敏度高，适用于深层次机制探索。
选择合适的检测方法需依据研究目的、样本类型及实验条件。
医学免疫学实验指导
医学免疫学实验指导病原生物与免疫学教研室实验一免疫系统组织和细胞形态学一、实验目的观察小鼠胸腺、脾脏等免疫器官及免疫细胞二、实验内容机体免疫系统由免疫器官、免疫细胞、免疫分子组成。
该系统具有识别和排除抗原性异物、维持机体内环境稳定和生理平衡的功能是执行体液免疫和细胞免疫的物质基础。
本次实验主要观察免疫器官大体解剖学、免疫细胞的形态学特征。
小鼠是啮齿目中体形较小的动物淋巴系统很发达包括胸腺、脾脏、淋巴管、外周淋巴结及肠道派氏集合淋巴结。
本实验在带教老师?傅枷陆馄市∈蠊鄄煨叵佟⑵⒃嗟让庖咂鞴俨⒅蒲 科 鄄煨∈竺庖呦赴 ?一小鼠免疫器官解剖学观察【材料】动物昆明种小白鼠。
试剂3来苏尔水瑞特氏染液。
器材眼科镊眼科剪玻片。
【方法】小鼠脱臼处死投入盛有3来苏尔水的缸内浸泡5分钟。
取出小鼠仰卧位置于试验台上使动物腹部朝上。
以镊子提起耻骨处皮肤用剪刀沿正中线直剪开至下颌部然后钝性分离皮肤再把皮肤向四肢剪开。
注意观察腹壁用剪刀沿正中线自阴部至膈肌为止剪开观察腹腔液量及性状观察脾脏。
切开膈肌剪断胸骨翻起胸骨观察胸腺、心脏及肺脏胸腺位于小鼠胸腔心脏前上方内有许多大淋巴细胞即前胸腺细胞及特定的上皮网状细胞分泌胸腺激素。
解剖结束深埋动物。
二免疫细胞的形态观察【材料】动物昆明种小白鼠。
试剂3来苏尔水瑞特氏染液pH8.6硫酸盐缓冲液20盐酸甲醇。
器材眼科镊眼科剪玻片。
【方法】准备洁净玻片两张一张用于推片另一张用于固定标本。
剪断小鼠尾巴取血或小鼠眼球取血迅速在玻片上涂血膜制备血涂片自然干燥。
瑞氏染色染色甲醇固定标本分钟亦可省略滴加瑞氏染液数滴覆盖血膜染色分钟再加等量的pH8.6硫酸盐缓冲液或新制蒸馏水用洗耳球吹打使之与染液混匀静置染色810分钟弃去染料水洗。
脱色用20盐酸甲醇脱色肉眼观察玻片呈粉红色为宜显微镜下观察结果。
细胞特征细胞细胞是由胸腺内的淋巴干细胞分化而成的是淋巴细胞中数量最多、功能最复杂的一类细胞占外周血液淋巴细胞总数的7580。
免疫学检验-免疫细胞及其功能检验技术
一、白细胞的分离 （一）自然沉降法
加抗凝血于试管中
室温或37℃中静置 （30-60min）
分层
结果示意图
（二）高分子聚合物沉降法
抗凝血与等量3%明胶或 6%右旋糖酐溶液混匀
室温或37℃中静置 （30～60min）
分层结果与自然沉降法 类似
四、吞噬细胞的分离
•吞噬细胞包括两类：一类是大吞噬细胞即单核吞 噬细胞系统（包括血液中的单核细胞以及组织器 官中的巨噬细胞）；另一类是小吞噬细胞，即中 性粒细胞。 •分离原理：主要根据其表面标志和生物学特性。
（一）单核细胞的分离
• Percoll密度梯度分离法 • 流式细胞术分离法（常用方法） • 免疫磁珠分离法：分选CD14+细胞（常用方法
） • 黏附法
黏附法会影响单核细胞的功能，仅适用于去除 单核细胞。
（二）巨噬细胞的分离
• 斑蝥敷贴法：（用于分离人巨噬细胞）
操作要点：10%斑蝥酒精浸液浸泡后的滤纸帖敷在前 臂内侧皮肤，4~5小时后见皮肤局部充血，48小时后出 现水泡，吸取渗出液（主要为巨噬细胞）、离心洗涤。
• 腹腔渗出液分离法：（用于分离动物巨噬细胞）
优点：速度快、得率高 不足：白细胞黏性增加
二、外周血单个核细胞的分离
•外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）主要是指淋巴 细胞和单核细胞。 •PBMC是免疫学实验中最常用的细胞群 •PBMC也是T、B细胞分离纯化的细胞来源。
人外周血中各类血细胞密度
（二） Percoll分层液法
连续密度梯度分离液 （Percoll液+PBS，离
皖南医学院：医学免疫学(实验指导)
医学免疫学实验指导皖南医学院微生物学免疫学教研室2004年12月实验室规则实验是映证理论，对学生进行基本技能训练和培养科学研究能力的手段，为保证实验效果，同时避免病原微生物的实验室内传染，保障实验操作者的安全，特制定如下规则：一、尽量不带个人生活、学习用品入实验室，必要的用具带入后，应放在远离操作的位置。
二、进入实验室后穿上工作衣，离室时脱下反叠带走。
在实验室内应保持安静、整洁、有秩序，不得高声谈笑，随便走动或拆卸仪器、搬弄标本。
三、实验室内严禁吸烟、进食、饮水，严禁用嘴吸移液及润湿标签，尽量不要用手触摸头面部及身体其他暴露部位。
四、如遇不慎而打破菌种管或使有菌材料污染皮肤、衣物、桌面等情况，应立即报告指导教师，切勿隐瞒或自行处理。
五、被污染过且需要回收的吸管、滴管、试管、玻片等物应用完后立即投入已准备的消毒液中，不得放在桌面上或水槽内。
六、爱护公物，节约试剂材料，不得将实验室任何物品私自带走。
如遇仪器、用品损坏，应报告指导教师并按规定予以赔偿。
七、实验完毕，整理桌面，值日生打扫室内卫生，最后离开的同学应注意关好水电、门窗，洗手后离室。
第一单元体外抗原抗体反应实验目的掌握体外抗原抗体反应的特点和影响因素；掌握经典的体外抗原抗体反应的原理、方法和应用。
凝集反应基本原理颗粒性抗原与相应抗体在一定条件下特异性结合而出现肉眼可见的凝集现象。
实验一直接凝集反应一、玻片凝集试验（一）血型鉴定目的掌握玻片凝集反应的原理和应用；熟悉ABO血型的鉴定方法。
原理将已知标准抗A和抗B血型抗体分别与待测红细胞混合。
如果抗原与抗体相对应，则引起红细胞凝集，反之则不凝集，据其凝集现象可判断血型。
材料1、标准的抗A和抗B单克隆抗体（抗A为蓝色，抗B为黄色）2、酒精棉球、采血针、生理盐水、试管、滴管、载玻片、蜡笔。
方法1、酒精棉球消毒耳垂或手指末端后，用采血针刺破皮肤，取1—2滴血放入盛有0.5ml生理盐水的试管中，混匀制成红细胞悬液。
医学实验教案细胞免疫实验与技术
环保处理
02
03
减少废弃物产生
废弃物需交由专业机构进行无害 化处理，确保不对环境和人体健 康造成影响。
合理规划实验步骤和试剂用量， 减少不必要的浪费和废弃物产生 。
个人防护措施及应急处理
个人防护
实验人员需定期进行健康检查，了解自身健康状况，并采 取相应的防护措施，如接种疫苗、避免接触有害物质等。
应急处理
02
应用细胞免疫技术开发特异性高、灵敏度好的免疫检测试剂盒
，用于临床诊断和科研。
细胞免疫治疗技术转化
03
将细胞免疫治疗技术转化为临床应用，推动生物医药产业的发
展。
05
细胞免疫实验注意事 项及安全规范
实验室安全操作规范
01
02
03
04
实验前准备
熟悉实验流程，检查实验器材 和试剂的完整性和有效性，确 保实验环境符合安全标准。
实验步骤与操作规范
细胞培养
将所需的免疫细胞在适宜条件 下进行培养，保持细胞状态良 好。
细胞处理
在特定时间点收集细胞，进行 相应的处理，如， 如培养基、抗体、细胞株、显 微镜、离心机等。
免疫刺激
向培养体系中加入特定的抗原 或抗体，模拟免疫应答过程。
结果观察
02
细胞免疫实验技术与 方法
细胞培养技术
细胞培养基本概念
细胞培养是指将细胞从机体中取 出，在人工模拟体内环境的条件 下，使其生长、繁殖并维持主要
结构和功能的技术。
细胞培养类型
包括原代细胞培养、传代细胞培养 、细胞株与细胞系培养等。
培养条件与方法
包括培养基的选择与配制、培养环 境的控制（温度、湿度、pH值等） 、细胞传代与冻存等。
免疫学与病原生物学实验报告
免疫学与病原生物学实验报告免疫学与病原生物学实验报告引言：免疫学与病原生物学是生命科学中非常重要的领域，研究人类和动植物的免疫系统以及病原微生物对宿主的侵袭和致病机制。
本次实验旨在通过一系列的实验操作和观察，深入了解免疫学和病原生物学的基本原理和实验技术。
实验一：细胞免疫学实验细胞免疫学是研究机体免疫系统中各种细胞的类型、功能和相互作用的学科。
本实验的目的是通过流式细胞术分析免疫细胞的表型和功能。
实验步骤：1. 采集小鼠外周血，离心分离出单个核细胞。
2. 使用荧光标记的抗体，对细胞进行染色。
3. 使用流式细胞仪进行细胞的分析和检测。
实验结果：通过流式细胞仪的分析，我们成功地鉴定了不同类型的免疫细胞，如T细胞、B 细胞和巨噬细胞，并且进一步分析了它们的功能和表型特征。
这对于深入了解机体的免疫系统以及疾病的发生和发展具有重要意义。
实验二：病原微生物的培养和鉴定病原微生物是引起各种传染病的致病因子，研究其培养和鉴定技术对于预防和治疗传染病具有重要意义。
本实验的目的是通过培养和鉴定细菌，了解病原微生物的基本特征和致病机制。
实验步骤：1. 采集疑似感染的样本，如血液、尿液或分泌物。
2. 进行细菌的培养，包括选择适当的培养基和条件。
3. 使用不同的鉴定方法，如形态学观察、生化试验和分子生物学技术，对细菌进行鉴定。
实验结果：通过对细菌的培养和鉴定，我们成功地确定了病原微生物的种类和致病特征。
这对于临床医学的诊断和治疗具有重要意义，也为疫苗和抗生素的研发提供了基础数据。
实验三：免疫反应的检测和分析免疫反应是机体对抗病原微生物的重要防御机制，研究其检测和分析方法对于了解免疫系统的功能和调控具有重要意义。
本实验的目的是通过ELISA实验检测和分析免疫反应中的抗体和细胞因子。
实验步骤：1. 准备样本，如血清或细胞培养上清液。
2. 使用ELISA实验进行抗体或细胞因子的检测，包括制备试剂盒、反应液和检测方法。
3. 分析实验结果，包括抗体或细胞因子的浓度和活性。
细胞免疫功能测定
项目14：细胞免疫功能测定【目的要求】1、熟悉非特异性免疫细胞功能的测定方法2、了解特异性免疫细胞的测定方法和应用【实验内容】一、吞噬细胞吞噬功能测定【原理】具有吞噬功能的细胞称为吞噬细胞，包括小吞噬细胞和大吞噬细胞二类。
小吞噬细胞一般指血液中的中性粒细胞，大吞噬细胞则是存在于组织中的巨噬细胞和血液中的大单核细胞。
病原微生物、红细胞等异物侵入机体或在体外与吞噬细胞接触，吞噬细胞即进行吞噬。
取细胞作涂片，镜检计算吞噬百分率和吞噬指数，可估计吞噬细胞的吞噬功能。
吞噬细胞（巨噬细胞）在体液免疫和细胞免疫中均起着重要作用，吞噬细胞（巨噬细胞）与抗肿瘤免疫也有重要的关系。
因此，测定吞噬细胞的吞噬和消化功能，可在一定程度上反映机体的免疫状态，也可作为判断疗效的指标之一。
【实验动物与试剂】1、实验动物：小白鼠2、实验试剂：无菌生理盐水、5%无菌可溶性淀粉溶液、瑞氏染液、白色葡萄球菌培养物3、实验器材：无菌注射器、吸管、载玻片、解剖器械、显微镜等。
【方法】1、试验前3天，小鼠腹腔注射5%无菌可溶性淀粉溶液1ml。
2、试验当天，小鼠腹腔注射1mL白色葡萄球菌悬液。
3、注射后30min，断颈处死小鼠，仰位固定小鼠，正中剪开腹部皮肤，吸出腹腔液制定涂片，自然干燥后瑞氏染液染色。
4、瑞氏染液染色：在涂片上滴3~5滴瑞氏甲液，30~60sec后,滴加瑞氏乙液,并用洗耳球吹数下,将乙液与甲液充分混均,5~10min后,水洗,干燥,镜检.5、镜检：低倍对光，用油镜下观察巨噬细胞吞噬细菌的情况。
【结果观察】1、吞噬细胞吞噬现象镜下观：如染色结果正确，可见细胞核及被吞噬的细菌染成紫色，而白细胞浆则为淡红色。
2、吞噬细胞吞噬功能的测定（1）吞噬百分率：观察100个吞噬细胞，计数被吞噬百分率以表示吞噬细胞的吞噬功能。
（2）吞噬指数：观察100个中性粒细胞，计数被吞噬的细菌总数，平均每个中性粒细咆吞噬的细菌数即为吞噬指数。
三、特异免疫细胞功能测定（一）T淋巴细胞数量测定——E花环试验【原理】人成熟T淋巴细胞表面的CD2分子，即为绵羊红细胞受体（ER）。
免疫细胞功能检测技术
免疫细胞功能检测技术免疫细胞功能检测技术是当今医学研究和临床应用中一个至关重要的领域。
随着对免疫系统理解的深入，科学家们不断探索如何更有效地评估免疫细胞的功能状态，以便更好地应对各种疾病，尤其是癌症和自身免疫病。
一、免疫细胞的基本功能1.1 免疫细胞的种类和功能免疫系统中有多种类型的细胞，包括T细胞、B细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和巨噬细胞等。
每种细胞都有其独特的功能。
T细胞主要负责识别和消灭感染细胞，而B细胞则通过产生抗体来中和病原体。
NK细胞则在抗肿瘤和抗病毒反应中发挥重要作用。
1.2 功能检测的意义通过检测这些细胞的功能，我们可以了解个体的免疫状态，帮助医生制定个性化的治疗方案。
比如，对于癌症患者，评估T细胞的活性可以判断肿瘤免疫治疗的效果，从而调整治疗策略。
二、常用的免疫细胞功能检测技术2.1 细胞因子测定细胞因子是免疫细胞之间交流的重要信号。
我们可以通过酶联免疫吸附测定（ELISA）等技术，定量分析血液或细胞培养液中的细胞因子水平。
这不仅能评估免疫细胞的活性，还能反映出机体的炎症状态。
2.2 细胞增殖测定细胞增殖是评估免疫细胞功能的另一种方法。
常见的技术有流式细胞术和MTS法。
这些方法能够检测细胞在特定刺激下的增殖能力，提供细胞对抗原或刺激物的反应能力的信息。
2.3 细胞毒性检测对于抗肿瘤免疫反应的评估，细胞毒性检测尤为重要。
通过检测NK细胞或细胞毒性T细胞对靶细胞的杀伤能力，我们能直观地了解免疫系统在抵御肿瘤时的表现。
常用的检测方法包括Cr51释放实验和LDH释放实验。
三、技术的局限与展望3.1 技术的局限性尽管目前的检测技术已经相当成熟，但仍存在一些局限性。
例如，细胞因子的测定可能受样本处理和保存条件的影响，从而导致结果的不稳定性。
此外，单一指标的检测往往难以全面反映免疫状态。
3.2 未来的发展方向未来的研究应朝着更加综合和精准的方向发展。
结合多种检测技术，可能会提升对免疫细胞功能的全面理解。
免疫细胞的检测方法
免疫细胞的检测方法
《免疫细胞的检测方法》
嘿，你知道吗？我们身体里有一群超级厉害的“战士”，那就是免疫细胞。
它们可是保护我们健康的重要力量呢！那怎么才能知道这些“战士”的情况呢？这就涉及到免疫细胞的检测方法啦。
一种常见的方法就是流式细胞术。
简单来说，就是让细胞一个一个地通过检测通道，然后仪器就像个超级侦探一样，能分辨出不同类型的免疫细胞，还能知道它们的数量和状态。
这可真是个神奇的技术呀！
还有一种叫免疫组化的方法。
它就像是给免疫细胞“上色”，通过特定的染色剂，让我们能在显微镜下清楚地看到免疫细胞在哪里，它们在干什么。
另外，细胞因子检测也很重要哦。
因为细胞因子就像是免疫细胞之间传递信号的“小信使”，检测它们的水平，就能知道免疫细胞的活动情况啦。
酶联免疫吸附测定也是常用的，它能很准确地检测出一些特定的免疫细胞相关物质。
总之，这些检测方法都各有各的厉害之处，能帮助我们更好地了解身体里免疫细胞的状况。
免疫细胞的检测非常重要，只有清楚地知道它们的状态，我们才能更好地保护自己的健康呀！。
免疫细胞鉴定 方法
免疫细胞鉴定方法
免疫细胞鉴定是一种用于鉴定和表征免疫系统中的特定细胞类型的方法。
以下是常用的免疫细胞鉴定方法：
1. 免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）：该方法使用特异性的抗体与细胞表面或细胞内的特定抗原结合，从而确定细胞的类型和位置。
可以通过免疫荧光方法或酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）检测特定抗原。
2. 流式细胞术（Flow cytometry）：该方法利用双标记或多标
记的抗体与细胞表面或细胞内的不同抗原相结合，通过激光器照射细胞溶液，测定细胞颗粒物的散射光谱和荧光强度，进而对不同免疫细胞进行定量和鉴定。
3. 分子方法：如聚合酶链反应（PCR）和实时荧光定量PCR （qPCR）等技术，可以检测细胞内的特定基因或表达物，从
而确定细胞类型。
4. 免疫组学：这是一种鉴定免疫细胞类型的研究方法，利用免疫学的原理和技术，结合组织学和细胞学的方法，进行细胞类型的鉴定和表征。
这些方法在研究和临床诊断中广泛应用，帮助科学家和医生了解免疫系统的功能和异常变化。
免疫细胞功能检测技术
2021/11/14
27
Hale Waihona Puke 三、NK细胞活性测定➢形态法 ➢酶释法 ➢荧光法 ➢同位素法 ➢化学发光法
染色计数
靶 离心取上清
细 测LDH或AKP
胞 溶 解
离心取沉淀 测活细胞荧光
测CPM值
测发光强度
常用靶细胞: K562细胞株
2021/11/14
28
二 吞噬细胞功能检测技术
按其形态大小分为两类： 大吞噬细胞—单核-吞噬细胞系统 小吞噬细胞—中性粒细胞
40
(五) 巨噬细胞促凝血活性测定
激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的 凝血活性因子，加速正常血浆的凝固，为 此取已经37℃预温的正常兔血浆和CaCl2 混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试 管中，移置37℃，即时记录血浆凝固时间。
2021/11/14
41
Thanks！
2021/11/14
42
2021/11/14
去除游离 的51Cr
效应细胞
测量上清液中 释放的51Cr
混合培养4-6小时
18
(四) 体内试验
➢特异性抗原皮肤试验 ➢PHA皮肤试验
2021/11/14
19
二、B细胞功能检测
➢B细胞增殖能力的试验 ➢溶血空斑试验 ➢B细胞抗体形成功能的检测 ➢体内试验
2021/11/14
20
NBT还原试验
原理：
N-N-
C
+ H+
N=N-R-
四氮唑基（淡黄色）
2021/11/14
N-NH2 C N=NH
甲臜（紫黑色）
35
中性粒细胞 NBT 甲臜颗粒沉积于胞质中
2021/11/14
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
医学免疫学实验指导：免疫细胞的检测
内容
实验、外周血单个核细胞的分离与纯化
试验、E玫瑰花结试验
试验、溶血空斑试验
试验、外周血单个核细胞的分离与纯化—密度梯度离心法
（isolation and purification of peripheral blood mononuclear cell）
人体外周血单个核细胞（主要包括淋巴细胞和单核细胞）与血液中的其它成分存在密度差异，红细胞与中性粒细胞的比重是1.092，单个核细胞约为1.075~1.090，血小板约为1.032。
市售的淋巴细胞分层液的比重为1.077±0.002g/L，与单个核细胞比重相近。
通过离心后，各种血液成分将按其密度梯度重新分布聚集，从而将单个核细胞与其他血细胞分离。
[材料]
1．淋巴细胞分层液（Ficoll-Hypaque，比重为1.077±0.002g/L）、肝素溶液（200U/ml）、无Ca2+ 、Mg2+ Hank’s液，2%的台盼蓝染液。
2．离心管、毛细吸管、水平离心机、注射器等。
[方法]
1．无菌采集人静脉血2ml，用肝素溶液抗凝（每1ml 全血加20U肝素），加Hank’s 液2ml作等倍稀释。
2．用毛细吸管将稀释的抗凝血沿管壁轻缓地加入盛有2~3ml淋巴细胞分层液的离心管中，使血液重叠于分层液上，两者间保持界面清晰。
3．将加好血液的离心管置水平离心机，2000rpm离心20min后，小心取出。
离心后的血液成分分布如图。
图密度梯度离心法分离前后血细胞分层示意图
4．将毛细吸管轻轻插入，吸出白色云雾状的单个核细胞层；或先吸去上层的血浆、稀释液及血小板后，再用另一支毛细吸管仔细吸出单个核细胞层，用5倍体积的Hank’s液洗涤3次，每次1500rpm，离心10min。
5．细胞计数：将洗涤后的细胞加0.5ml的完全RPMI-1640培养基（含10%灭活的小牛血清）制成细胞悬液。
取0.1ml细胞悬液与2%冰醋酸等量混合，用血球计数板按白细胞计数法计数，并按下式计算出4个大方格内的细胞数：
细胞数（/ml）= 4个大方格细胞数×104×稀释倍数
4
6．细胞活力检查：取2滴细胞悬液与1滴2%台盼蓝染液混匀，5min后在高倍镜下观察，活细胞不着色，死细胞染成蓝色，计算活细胞百分率。
[注意事项]
1．操作应轻柔，细胞悬液应充分混匀，避免损伤细胞活性及细胞丢失。
2．将稀释血加入分层液上时，动作一定要轻缓，切不可冲散分层液而使血液与之混合，以免影响分离效果。
3．此法分离所得的细胞悬液中含有少数单核细胞，利用单核细胞对玻璃具有粘附力的特点，可用以下粘附去除法去除：
（1）玻璃平皿吸附法：将单个核细胞悬液倒入玻璃平皿中，置37℃温育30min，单核细胞便粘附在平皿上。
吸出未粘附细胞，即可获得大于95%的淋巴细胞。
（2）玻璃纤维柱法：将单个核细胞悬液倒入装有玻璃纤维的柱层中，置37℃温育45min，用预温的37℃的Hank’s液冲洗，收集洗脱细胞，即主要为淋巴细胞。
实验、E玫瑰花结试验
（erythrocyte rosette test）
人体T淋巴细胞表面具有绵羊红细胞（sheep red blood cell，SRBC）受体，它是T 细胞的特异性标志。
在体外一定条件下，将T细胞与SRBC混合，SRBC能结合于T细胞周围，形成以T细胞为中心，四周环绕SRBC的玫瑰花样的花结，称为E玫瑰花结。
本试验可用于计数T细胞，了解机体的细胞免疫状态；也可将SRBC用溴化二氨基异硫氢化物（AET）处理后与T细胞形成大花结，再经淋巴细胞分层液离心花结形成细胞，并经低渗溶液溶解其中的SRBC而分离T淋巴细胞。
E玫瑰花结试验分为总E（Et）花结试验和活性E（Ea）花结试验。
前者检测的是标本中T淋巴细胞的总数，而后者检测的是对SRBC具有高度亲和力的那部分T淋巴细胞。
Ea 花结试验更能敏感反映机体的细胞免疫功能。
根据所需血量的多少，E玫瑰花结试验分为常量法和微量法。
以下介绍常量法。
[材料]
1．淋巴细胞分层液（比重为1.077±0.002g/L）、Hank＇s（无Ca2+ 、Mg2+）、Alsever 溶液。
2．SRBC悬液：自绵羊颈静脉无菌采血，放入盛有玻璃珠的无菌三角烧瓶，摇动数分钟，使之脱纤维。
每10ml血加5mlAlsever溶液混合，置4℃冰箱备用。
3．吸收灭活的小牛血清：小牛血清置56℃水浴30min灭活。
取2体积灭活的小牛血清，加1体积压积的SRBC，混匀后置37℃温育30min，离心沉淀SRBC，吸取上清液放4℃冰箱备用。
4．瑞氏染液、0.8%戊二醛。
5．离心机、毛细吸管、载玻片等。
[方法]
1．无菌采集人静脉血1ml，肝素溶液抗凝，用Hank’s液等倍稀释，经密度梯度离心分离淋巴细胞，用含20%小牛血清的Hank＇s液将细胞调整为2×106/ml的浓度。
2．将Alsever液保存的SRBC吸去上清，然后吸取0.02ml的沉淀细胞，用Hank’s液洗涤3次，每次1500rpm离心10min，将压积的SRBC用Hank’s液配成浓度约为8×107个/ml的1%SRBC悬液。
3．按以下流程图进行操作：
Et、Ea试验流程图
Et Ea
淋巴细胞悬液0.1ml 淋巴细胞悬液0.1ml
+ +
1%SRBC0.1ml 1%SRBC0.1ml
置37℃水浴10min 低速离心500rpm/5min
低速离心500rpm/5min
置4℃冰箱2h或过夜
4．取出后吸去部分上清液，轻轻摇匀，加0.8%戊二醛2滴，固定15分钟。
然后取1滴液体涂片，自然干燥后作瑞氏染色，油镜或高倍镜下观察结果。
[结果]
凡1个淋巴细胞周围吸附3个或3个以上SRBC者，为E花结形成细胞。
计数200个淋巴细胞，计算Et和Ea花结形成细胞的百分率。
E玫瑰花结形成率（%）=形成E花结细胞数×100
200
正常值一般为：Et是60%~80%，Ea为25%~40%。
[注意事项]
1．用Alsever溶液保存的SRBC在2周以内可以使用。
2．检测的血液标本要新鲜，放置时间不超过3~4h，分离的淋巴细胞用台盼蓝染色法计数，活细胞率不能低于95%。
3．重悬花环时，只宜轻缓旋转试管，使细胞团块散开即可，不能强力吹打，否则花环会减少或消失。
实验、溶血空斑试验—琼脂溶血空斑技术
（hemolysis plaque test）
溶血空斑试验是体外检测抗体产生细胞（B细胞）的一种方法。
其基本原理是将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾脏制成细胞悬液，与一定量的SRBC混合，在补体的参与下，使抗体产生细胞周围的SRBC溶解，从而在每一个抗体产生细胞周围形成一个肉眼可见的溶血空斑。
本试验主要分为琼脂溶血空斑技术和液相单层溶血空斑技术，每一类又可分为直接法和间接法两种。
以下介绍琼脂溶血空斑技术。
该技术是以一定浓度的琼脂为支持物，将一定浓度的SRBC和经SRBC免疫过的小鼠脾细胞悬液在45℃下混匀，倾注平皿，然后加入一定
量的补体，经37℃温育后，在琼脂平皿中观察溶血空斑。
[材料]
1．玻璃平皿（5.5×1.5cm）、剪刀、镊子、青霉素小瓶、水浴箱等。
2．1８～2５g小白鼠。
3．pH7.2的Hank＇s（含Ca2+ 、Mg2+ ）、SRBC悬液、1%DEAE-右旋糖酐、补体（1∶30）。
4．１.4%琼脂5ml、0.7%琼脂1.5ml。
［方法］
１．免疫脾细胞的制备
（１）免疫小白鼠：每只小白鼠经尾静脉注入2×109 /ml的SRBC悬液0.2ml，或腹腔注射4×108 /ml的SRBC 悬液1ml。
（２）制备脾细胞悬液：将免疫4天后的小白鼠断颈处死，解剖取出脾脏，放入冷Hank＇s液中漂洗，然后置无菌青霉素小瓶内，用剪刀剪碎，加入适量的Hank＇s液，用毛细吸管吹打，使细胞分散成悬液，静置3min。
待大块组织下沉后，取上层液体移至小试管中，1500rpm离心5min，弃上清，加入3ml 的Hank＇s液，吹打混匀，调整细胞浓度为1×107 /ml，放4℃冰箱备用。
2．底层琼脂的制备：将１.4%的琼脂5ml加热溶化后，倾注到置水平位的平皿内，将平皿反扣，放37℃温箱1h后使用。
3．顶层琼脂的制备：将0.7%的琼脂1.5ml加热溶化后，置于45℃水浴箱中，依次加入1%DEAE-右旋糖酐0.05ml，2×109 /ml 的SRBC悬液0.1ml，1×107 /ml的脾细胞悬液0.1ml，迅速将上述小试管中的各成分在水浴中振荡混匀，立即倾入已铺好底层琼脂的平皿中，于水平位轻轻旋转平皿，使之均匀平铺，凝固后，放37℃温箱1h。
4．加补体：取出平皿，加入1∶30的新鲜豚鼠血清1.5ml，继续放37℃温箱30min，取出后室温下放1h，再放4℃冰箱过夜，次日倒去补体，进行空斑计数。
[结果]
将平皿划分小方格，用放大镜观察并计数溶血空斑总数，再换算出每百万脾细胞中所含的抗体形成细胞数。
如用于药物的筛选，可比较给药组和对照组每百万脾细胞中抗体形成细胞的平均值，以表示药物的刺激作用或抑制作用。
[思考题]
1.为什么Ea试验比Et试验更能准确地反映机体的细胞免疫状况？
2.溶血空斑形成的原理是什么？。