荧光法测定乙酰水杨酸和水杨酸
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1、实验目的 （1）掌握荧光法测定药物中乙酰水杨酸
的方法 （2）了解Cary Eclipse型荧光光谱仪的
基本操作 （3）强化称量、移液、配溶液等基本操
作
2019/12/9
实验原理
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
If = 2.3 I0 l c = Kc
分子产生荧光必须具备的条件
1）具有合适的结构； 2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2019/12/9
仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
2019/12/9
溶液浓度与荧光强度的关系
有线性关系：
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3
lc)
浓度很低时，将括号项近似处理后：
2019/12/9
用移液管分别准确移取浓度为4.00 μg·mL-1的ASA溶液2、4、6、8、 10 mL至5只50mL容量瓶中，用1％醋酸—氯仿溶液稀至刻度，摇匀。分 别测量它们的荧光强度. (2) SA标准曲线的制作
用移液管分别准确移取浓度为7.5μg·mL-1 的SA溶液2、4、6、8、 l0mL至5只50mL容量瓶中，用 1％醋酸—氯仿溶液稀释至刻度，摇匀。 分别2019测/12/量9 它们的荧光强度．
4、阿斯匹林药片中乙酰水杨酸和水杨酸的测定 取5片阿司匹林药片磨成粉末，准确称取0.40mg用1％醋
酸—氯仿溶液溶解，全部转移至100mL容量瓶中，用1％Hale Waihona Puke Baidu 酸—氯仿溶液稀释至刻度。迅速通过定量滤纸干过滤，用 该滤液在与标准溶液同样的测定条件下测量SA荧光强度。
将上述滤液稀释1000倍(用三次稀释来完成)，在与标准溶 液同样的测定条件下测量ASA荧光强度。
数据处理
1、从绘制的ASA和SA激发光谱和荧光光谱曲线上，确定 它们的最大激发波长和最大发射波长。 2、分别绘制ASA和SA的标准曲线，从标准曲线上确定试 样溶液中ASA和SA的浓度，并计算每片阿斯匹林药片中 ASA和SA的含量(mg)，将ASA测定值与说明书上的值比 较。 2019/12/9
实验指导
l
‘ 2
>
l
2
>
l
1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-3～10 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2019/12/9
荧光分析方法
特点
1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
3）试样量少 缺点：应用范围小。
2019/12/9
仪器与试剂
仪器：Cary Eclipse荧光光谱仪，石英比 色皿，容量瓶，移液管，玻璃注射器， 漏斗，量筒，滤纸。
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l 1 2019/12/9
l 2 l 2
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长；
6、比色皿的检测面和放入检测腔的位置一定要 固定。
2019/12/9
试剂：乙酰水杨酸，水杨酸，乙醇，阿司 匹林药片。
2019/12/9
实验步骤
1、ASA和SA贮备溶液的配制 （1）ASA贮备液的配制：称取0.4000g乙酰水杨酸溶于1％醋酸-氯仿溶 液中，用 1％醋酸—氯仿溶液定容于1000mL容量瓶中，摇匀，备用； （2）SA贮备液的配制：称取0.750g水杨酸溶于1％醋酸—氯仿溶液中， 用 1％醋酸—氯仿溶液定容于1000mL容量瓶中，摇匀，备用。 2、ASA和SA激发光谱和荧光光谱的绘制 将ASA和SA贮备液分别稀释100倍(分二次完成，每次稀释10倍)。用得 到的溶液分别扫描ASA和SA的激发光谱和荧光光谱曲线，并分别确定 它们的最大激发波长和最大发射波长。 3、标准曲线的制作 (1) ASA标准曲线的制作
系间跨越 内转移 外转移 振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光20：19/112/90-3～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
1、溶剂用量控制在600mL，要求提高清洗效率， 减少移取溶剂时的损失，以节约试剂，同时保 护健康和环境。
2、用加长的胶头滴管移取少量的试剂，切忌直 接倾倒。
3、容量瓶使用25mL，注意相应液体体积的改动 4、要保证实验过程无水 5、在做标准曲线时，在做每一个点前，一定要
用这个点的溶液清洗比色皿至少三次，以保证 能作出曲线。
的方法 （2）了解Cary Eclipse型荧光光谱仪的
基本操作 （3）强化称量、移液、配溶液等基本操
作
2019/12/9
实验原理
电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射 跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；
传递途径
辐射跃迁
无辐射跃迁
荧光 延迟荧光 磷光
If = 2.3 I0 l c = Kc
分子产生荧光必须具备的条件
1）具有合适的结构； 2）具有一定的荧光量子产率。
荧光量子产率（）：
发射的光量子数
吸收的光量子数
荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关 ，如外转换过程速度快，不出现荧光发射；
2019/12/9
仪器结构流程
测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品 池、双单色器系统、检测器。
特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。 基本流程如图： 单色器：选择激发光波长 的第一单色器和选择发射 光(测量)波长的第二单色 器； 光源：灯和高压汞灯，染 料激光器(可见与紫外区) 检测器：光电倍增管。
2019/12/9
溶液浓度与荧光强度的关系
有线性关系：
荧光强度 If正比于吸收的光量Ia和荧光量子效率 ： If = Ia
由朗-比耳定律： Ia = I0(1-10- l c ) If = I0(1-10- l c ) = I0(1-e-2.3
lc)
浓度很低时，将括号项近似处理后：
2019/12/9
用移液管分别准确移取浓度为4.00 μg·mL-1的ASA溶液2、4、6、8、 10 mL至5只50mL容量瓶中，用1％醋酸—氯仿溶液稀至刻度，摇匀。分 别测量它们的荧光强度. (2) SA标准曲线的制作
用移液管分别准确移取浓度为7.5μg·mL-1 的SA溶液2、4、6、8、 l0mL至5只50mL容量瓶中，用 1％醋酸—氯仿溶液稀释至刻度，摇匀。 分别2019测/12/量9 它们的荧光强度．
4、阿斯匹林药片中乙酰水杨酸和水杨酸的测定 取5片阿司匹林药片磨成粉末，准确称取0.40mg用1％醋
酸—氯仿溶液溶解，全部转移至100mL容量瓶中，用1％Hale Waihona Puke Baidu 酸—氯仿溶液稀释至刻度。迅速通过定量滤纸干过滤，用 该滤液在与标准溶液同样的测定条件下测量SA荧光强度。
将上述滤液稀释1000倍(用三次稀释来完成)，在与标准溶 液同样的测定条件下测量ASA荧光强度。
数据处理
1、从绘制的ASA和SA激发光谱和荧光光谱曲线上，确定 它们的最大激发波长和最大发射波长。 2、分别绘制ASA和SA的标准曲线，从标准曲线上确定试 样溶液中ASA和SA的浓度，并计算每片阿斯匹林药片中 ASA和SA的含量(mg)，将ASA测定值与说明书上的值比 较。 2019/12/9
实验指导
l
‘ 2
>
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2
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1
；
磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（
T1 → S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 → T1禁阻跃迁）
S0 →激发→振动弛豫→内转移→系间跨越→振动弛豫→ T1 发光速度很慢： 10-3～10 s 。
光照停止后，可持续一段时间。
2019/12/9
荧光分析方法
特点
1）灵敏度高 比紫外-可见分光光度法高2～4个数量级；为什么？ 检测下限：0.1～0.1g/cm-3 相对灵敏度：0.05mol/L 奎宁硫酸氢盐的硫酸溶液。
2）选择性强 既可依据特征发射光谱，又可根据特征吸收光谱；
3）试样量少 缺点：应用范围小。
2019/12/9
仪器与试剂
仪器：Cary Eclipse荧光光谱仪，石英比 色皿，容量瓶，移液管，玻璃注射器， 漏斗，量筒，滤纸。
量
吸 收
发
射
外转换
荧
光
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l3
l 1 2019/12/9
l 2 l 2
辐射能量传递过程
荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（
多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光； 10-7～10 -9 s 。
由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长
长；
6、比色皿的检测面和放入检测腔的位置一定要 固定。
2019/12/9
试剂：乙酰水杨酸，水杨酸，乙醇，阿司 匹林药片。
2019/12/9
实验步骤
1、ASA和SA贮备溶液的配制 （1）ASA贮备液的配制：称取0.4000g乙酰水杨酸溶于1％醋酸-氯仿溶 液中，用 1％醋酸—氯仿溶液定容于1000mL容量瓶中，摇匀，备用； （2）SA贮备液的配制：称取0.750g水杨酸溶于1％醋酸—氯仿溶液中， 用 1％醋酸—氯仿溶液定容于1000mL容量瓶中，摇匀，备用。 2、ASA和SA激发光谱和荧光光谱的绘制 将ASA和SA贮备液分别稀释100倍(分二次完成，每次稀释10倍)。用得 到的溶液分别扫描ASA和SA的激发光谱和荧光光谱曲线，并分别确定 它们的最大激发波长和最大发射波长。 3、标准曲线的制作 (1) ASA标准曲线的制作
系间跨越 内转移 外转移 振动弛预
激发态停留时间短、返回速度快的途径，发生的几率大， 发光强度相对大； 荧光：10-7～10 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级→基态； 磷光20：19/112/90-3～10s；第一激发三重态的最低振动能级→基态；
内转换
振动弛豫 内转换
S2
系间跨越
S1
能
T1 T2
1、溶剂用量控制在600mL，要求提高清洗效率， 减少移取溶剂时的损失，以节约试剂，同时保 护健康和环境。
2、用加长的胶头滴管移取少量的试剂，切忌直 接倾倒。
3、容量瓶使用25mL，注意相应液体体积的改动 4、要保证实验过程无水 5、在做标准曲线时，在做每一个点前，一定要
用这个点的溶液清洗比色皿至少三次，以保证 能作出曲线。