仲安全性试验(100ml)

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药品质量标准中安全性项目的设定

毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验;
当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
细菌内毒素检查
注意点：
✓ 最大有效稀释倍数是指供试品溶液被允许稀释的最大倍数，它和具体选用的鲎试剂的灵敏度有关。
✓ 由于不同厂商生产的鲎试剂其生产工艺、配方、质量参数等存在一定的差异，鲎试剂其抗干扰能力存在差别，因此应重视对鲎试剂的选择，或对鲎试剂灵敏度的考察。
某些抗生素、抗肿瘤药品、放射性药品等影响家兔正常体温, 因此不适宜采用热原检查法。
目前存在着细菌内毒素检查逐步替代热原检查的趋势。
热原检查
三、剂量限值的确定
➢ 家兔美1Kg体重注射体积不得少于0.5ml； ➢ 注射给药体积不超过10ml/kg； ➢ 如果供试品溶液浓度太低，给药体积需超过10ml/kg才
降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。
降压物质检查
二、适用品种
➢ 有可能产生类组织胺样急性降血压反应的静脉注射剂，如生化药注射剂(肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质等)及抗生素注射剂；
➢ 在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中，正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胺类质，均为这类杂质的来源。
降压物质检查
取对照品稀释液按动物体重每1kg注射组胺 0.1ug的剂量(ds)，供试品溶液按品种项下规定的剂量(dT),照下列次序注射一组4个剂量： ds、dT、dT、ds。
然后以第一与第三、第二与第四剂量所致的反应分别比较；如dT致的反应值均不大于ds 所致反应值的一半，即认为供试品的降压物质检查符合规定。

中石化集团公司标准08版《醇胺类脱硫剂技术要求》

B.4 仪器与设备
B.4.1 分析天平：准确至 0.0001g B.4.2 滴定管：25mL B.4.3 锥形瓶：250 mL
B.5 试剂与材料
B.5.1 指示剂：溴甲酚绿──甲基红混合指示剂，配制方法：称取 0.075g 溴甲酚绿和 0.05g 甲基红，混合后溶解于 100mL 的 95%乙醇中，摇匀，即得溴甲酚绿──甲基红混合指示剂。 B.5.2 无水碳酸钠：分析纯，作为基准试剂； B.5.3 硫酸：分析纯，稀释至 0.1mol/L；
119.2 – MDEA 的摩尔质量，g/mol
1000 – L 与 mL 的换算系数
B.8 报告
取重复测定 2 次结果的算术平均值作为测定结果，保留 2 位小数。
B.9 精密度
重复性：同一操作者在同一实验室重复测定 2 次结果之差不大于其算术平均值的 0.5%。
6
2
Q/SH 0210—2008
附录A （规范性附录）醇胺类脱硫剂光谱特征测定法
A.1 范围
A.1.1 本方法适用于测定醇胺类脱硫剂的醇胺类型。 A.1.2 本方法采用红外光谱法确认醇胺类脱硫剂的主成分是MDEA（N-甲基二乙醇胺）。 A.1.3 本方法涉及某些有危险的材料、操作和设备，但并未对与此有关的所有安全问题提出建议。因此，用户在使用本方法之前有必要建立适当的安全防范措施，并确定适当的管理制度。
醇胺类脱硫剂技术要求
Q/SH 0210—2008
1 范围
本标准规定了以有机醇胺为主要成分制成的醇胺类脱硫剂的要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输、贮存和安全。
本标准所属产品适用于脱除液化石油气、炼厂气或天然气中的硫化氢。本标准适用于醇胺类脱硫剂的准入、采购、质量监督检验、入库验收和性能评价。

阿尔茨海默病治疗药物临床研究技术指导原则

指导原则编号:【】治疗阿尔茨海默病药物临床试验技术指导原则（第二稿）二○○七年三月目录一、概述 (3)二、有效性和安全性评价要点 (5)（一）适应症定位 (5)（二）受试人群 (5)（三）有效性评价 (8)（四）安全性评价 (10)（五）临床试验的质量控制 (11)三、分期试验设计 (11)（一）Ⅰ期临床试验： (11)（二）Ⅱ期临床试验 (13)（三）Ⅲ期临床试验 (15)四、预防和控制疾病进展药物的临床试验 (16)（一）轻度认知功能损害（MCI）者的临床试验 (16)（二）控制疾病进展药物的临床试验 (17)五、缩略语 (17)六、参考文献 (19)七、著者 (20)治疗阿尔茨海默病药物临床试验技术指导原则一、概述痴呆是一种以认知功能缺损为核心症状的获得性临床综合征，如进行性记忆、思维、语言、行为和人格障碍等，可伴随精神和运动功能障碍，其认知损害的程度足以影响日常生活、社交或职业功能或与个人以前相比有显著下降。

痴呆的病因很多，病理生理过程复杂，其中常见的为阿尔茨海默病（AD）、血管性痴呆（VaD）和混合性痴呆。

阿尔茨海默病是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病。

多起病于老年期，病程缓慢且不可逆，临床上以智能损害为主，是老年常见病之一。

虽然目前尚无“抗痴呆”药物可以治愈此病，但是已有多种对症治疗药物用于临床，一些新的药物也处于研发阶段。

药物临床试验是药物研发中的一个重要环节，是一个目的性和逻辑性极强，并渐次推进的探索循证过程。

内容主要包括人体耐受性、药代动力学、药物相互作用、人体药效学、剂量效应探索、疗效确证研究等，按照试验的时间进程又可以分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期等几个阶段。

在试验进程中，每项试验均有其特定的目的和研究方法，同时各项试验之间又有着紧密的联系。

早期小规模试验的信息用于支持规模更大、目的性更强的后续试验，不同时期或同一时期进行的各项临床试验的信息互为补充，共同构成药物的安全有效性基础。

药物分析习题与参考答案

药物分析习题与参考答案一、单选题（A1型题-最佳选择题）（本大题共22小题，共22分）1. 我国现行药品质量标准有A、国家药典和地方标准B、国家药典、部颁标准和国家药监局标准C、国家药典、国家药监局标准（部标准）和地方标准D、国家药监局标准和地方标准E、国家药典和国家药品标准（国家药监局标准）2. 中国药典主要内容分为A、正文、含量测定、索引B、凡例、制剂、原料C、鉴别、检查、含量测定D、前言、正文、附录E、凡例、正文、附录3. 滴定液的浓度系指：A.mol/LB.mmol/LC.g /100mlD.%（ml/ml）4. 凡例、正文、附录是A.药典内容组成的三部分B.英文缩写ChP代表C.药品必须符合质量标准的要求D.表明原料药质量优、劣E.药品检验、流通、生产质量控制的依据5. 2009年以前，中华人民共和国共出版了几版药典A.6版B.7版C.8版D.9版6. 关于中国药典，最正确的说法是A.一部药物分析的书B.收载所有药物的法典C.一部药物词典D.国家监督管理药品质量的法定技术标准E.我国中草药的法典7. 我国药典修订一次是A.10年B.7年C.5年D.3年E.1年8. 酸碱性试验时未指明指示剂名称的是指A、1~14的PH试纸B、酚酞指示剂C、石蕊试纸D、甲基红指示剂E、6~9PH试纸9. 注射液中抗氧化剂亚硫酸氢钠对碘量法有干扰，可采用下列哪一试剂与其生成加成物而排除干扰？A、硼酸B、草酸C、甲醛D、酒石酸E、丙醇10. 中国药典规定，凡检查溶出度的制剂，可不再进行A、崩解时限检查B、主药含量检查C、热原实验D、含量均匀度检查E、重（装）量检查11. 用碘量法测定加有亚硫酸氢钠的维生素C注射液，在滴定前应加入A.氯仿B.丙酮C.乙醇D.乙醚12. 片剂中含量均匀度检查的目的是A.检查片剂中的单剂含量偏离标示量的程度B.检查片剂中杂质的含量C.检查片剂中主药含量是否均匀D.检查片剂的主药溶出情况13. 测定硫酸亚铁片的含量时，为防强氧化剂滴定时带来误差，常用下列哪种方法进行测定A.高锰酸钾法B.碘量法C.重铬酸钾法D.硫酸铈法14. 下列关于中药制剂含量测定项目的选定原则的说法，哪一个是不正确的：A.单方制剂所含成分类别必须基本清楚B.毒剧药及贵重药若不是君药或臣药，可不建立含量测定项C.所测成分应归属于某一单一药味D.含量过低的成分一般不宜选做含量测定的指标15. 中药制剂分析的一般程序为A.取样→鉴别→检查→含量测定→写出检验报告B.检查→取样→鉴别→含量测定→写出检验报告C.鉴别→检查→取样→含量测定→写出检验报告D.检查→取样→含量测定→鉴别→写出检验报告16. 下列关于中药制剂特点的说法，不正确的是：A.有效成分难以确定；B.化学成分单一，结构简单；C.是严格按照中医理论和用药原则组方的；D.各种成分的含量高低不一17. 为了保证药品的质量，必须对药品进行严格的检验，检验工作应遵循A.药物分析B.国家药典C.物理化学手册D.地方标准18. 中国药典中对于原料药含量限度的规定中，不订上限指标的，均指A.上限不超过100.0%B.下限不少于98.5%C.上限不超过101.0%D.下限不少于99.0%19. 药品的质量标准是下列部门（方面）共同遵循的法定依据：A.生产和经营B.生产、经营和使用C.生产、经营、使用和行政监督管理D.生产、经营、使用和行政、技术监督管理20. 质量标准中[鉴别]试验的作用是：A.考察药物的纯杂程度B.评价药物的药效C.评价药物的安全性D.确认药物与标签相符21. 原料药（西药）的含量测定首选的分析方法是A.容量法B.色谱法C.分光光度法D.重量分析法22. 下列不属于物理常数的有：A.熔点B.沸点C.呈色反应D.比旋度二、多选题（X型题-多选题）（本大题共19小题，共38分）1. 原始记录：A.只能划改B.被划改数据仍能辨认C.改正的数据写在划改数据的上方D.不得就字涂改E.在划改处不必签字或盖检测人印章2. 对照品是A、色谱中应用的内标物B、由国务院药品监督部门指定的单位制备、标定和供应C、按效价单位（或μg）计D、按干燥品（或无水物）进行计算后使用E、制剂的原料药物3. 药物的稳定性考察包括A、强光照射试验B、高温试验C、高压试验D、高湿度试验E、长期留样考察4. 药典正文中所收载的药品或制剂的质量标准的内容包括A.性状B.检查C.鉴别D.含量测定E.类别5. 药物制剂的检查中A.杂质检查项目应与原料药的检查项目相同B.杂质检查项目应与辅料的检查项目相同C.杂质检查主要是检查制剂生产、贮存过程中引入或产生的杂质D.不再进行杂质检查E.除杂质检查外还应进行制剂学方面的有关检查6. 需作含量均匀度检查的药品有A、主药单剂含量在10mg以下的片剂或胶囊剂B、主药单剂含量在2mg以下的其他制剂C、溶解性能差，或体内吸收不良的口服固体制剂D、主药含量小于每片重量5%的片剂E、主药含量小于5mg的注射剂和糖浆剂7. 片剂的标示量即A、百分含量B、相对百分含量C、规格量D、每片平均含量E、生产时的处方量8. 单剂量固体制剂检查溶出度是保证：A.制剂的药效B.制剂含药量的均匀性C.制剂含药量与标示量的符合程度D.制剂中药物的释放程度E.制剂中药物能被利用的程度9. 制剂检验中片剂按规定常作A.鉴别试验B.片剂通则规定的检验项目C.主药的含量测定D.热原检查E.性状检验10. 对中药制剂取样的要求为：A.要有科学性B.要有真实性C.要有代表性D.应均匀合理E.要有针对性11. 中药制剂的鉴别方法有A、显微鉴别B、薄层色谱C、化学鉴别D、指纹图谱E、红外图谱12. 中药制剂定性鉴别方法一般包括：A.性状鉴别B.显微鉴别C.微生物法D.电泳法E.物理化学方法13. 中药制剂的薄层色谱鉴别，常采用什么对照品？A、标准制剂B、药材对照品C、样品稀释液D、有效成分对照品E、对照R f值14. 下列关于中药制剂特点的说法，正确的是：A.有效成分难以确定B.化学成分单一，结构简单C.是严格按照中医理论和用药原则组方的D.各种成分的含量高低不一E.中药材中有效成分与无效成分的概念是相对的15. 被国家药典收载的药品必须是A、价格合理B、疗效确切C、生产稳定D、有合理的质量标准E、服用方便16. 在制订药品质量标准的原则中，叙述正确的有：A.同一品种原则上只能制订一个国家标准B.两个以上研制单位先后申报同一新药，若后申报的药品标准比已申报的药品标准先进，则按后申报的药品标准修订C.外用药、内服药及麻醉用药的制订标准一样D.两个以上研制单位在同一时期内申报同一新药，对不同的药品标准要求可不统一E.从健康需要出发，坚持质量第一的观点17. 我国药典对"熔点"测定规定如下A、记录初熔至全熔时温度B、"初熔"系指出现明显液滴时温度C、测定熔融分解的样品时，升温速度较一般测定慢D、测定熔点可考察药物的纯度E、测定熔点只有毛细管法18. 下列关于药品质量标准的说法，正确的有：A.制订药品质量标准，必须坚持质量第一，充分体现"安全有效、技术先进、经济合理"的原则B.药品质量标准应该反映药品的理化性质的研究、药理毒理的研究、制剂的研究等几个方面的研究结果C.药品质量标准的内容一经确认，便不能改变D.在制订药品标准时，要考虑药品的生理效用和临床应用的方法，不同制剂，要求应不同E.所选方法应具有适用性和先进性19. 原料药的纯度由以下指标说明：A.杂质含量B.光谱特征C.理化常数D.性状E.含量三、判断题（本大题共20小题，共20分）1. 药典凡例中的有关规定具有法定约束力。

药品质量标准中安全性项目的设定

K为人每千克体重每小时最大可接受的
内毒素剂量以EU/(Kg· h）表示，注射
剂K=5EU/(Kg· h），放射性药品注射
剂K=2.5EU/(Kg· h），鞘内注射剂
K=0.25EU/(Kg· h）
M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/(Kg· h） mg/(Kg· h）
细菌内毒素检查
异常毒性检查剂量应低于样品正常毒性剂量（LD5），并应高于人临床最大用药剂量；
对于未测出LD50的注射液，以每只小鼠0.8ml的剂量按
常规速度（3-5秒）静脉注射，仍未见死亡或毒性反应，
可以该剂量作为异常毒性检查限值。
异常毒性检查
四、相关进展
目前异常毒性检查法仅中国药典和英国药典有收载；国外药典中，对大多数生物提取的生化药或由现代生物技术得到的组份单一、结构明确的产品,一般不设定异常毒性检查项； WHO 生物测定专家委员会在1997年曾开会讨论异常毒性检查的必要性问题，认为其缺乏专属性和科学性，在实施GMP条件下生产的药品应当取消该项检查。
降压物质检查
一、方法
系比较组胺对照品与供试品引起麻醉猫血压下降的程度，以判定供试品中所含降压物质的限度是否符合规定。降压物质是指某些药物中含有的能导致血压降低的杂质，包括组胺、类组胺或其他导致血压降低的物质。
降压物质检查
二、适用品种
有可能产生类组织胺样急性降血压反应的静脉注射剂，如生化药注射剂(肽、蛋白质、酶及辅酶、多糖、脂质等)及抗生素注射剂；在用动物脏器或组织为原料制备生化药物的过程中，正常组织内存在的组胺及部分氨基酸脱羧形成的组胺、酪胺等胺类物质，均为这类杂质的来源。
细菌内毒素检查
凝胶法分为：限量试验和半定量试验；光度测定法包括：动态浊度法、终点浊度法、动态显色法、终点显色法两种方法可任选一种进行内毒素的检测当测定结果有争议时，除有另有规定外，以凝胶法结果为准

中和抗体检测应用于新型冠状病毒mRNA_疫苗效力分析

国家药监局重点实验室专栏[重点实验室简介]国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室是国家药监局２０１９年首批认定的重点实验室ꎬ依托单位为中国食品药品检定研究院生物制品检定所ꎮ生物制品检定所主要开展应用基础研究ꎬ方向包括:治疗类生物技术产品㊁预防类菌苗/疫苗及其创新性产品和一些重要的体内外诊断试剂(血液筛查)的质量控制和质量评价研究ꎻ建立符合国际规范的质量检定用标准物质㊁生产与检定用菌种库和细胞库等ꎮ通过提供疫苗及生物技术产品等国家标准物质㊁建立标准的检验技术㊁研究与制定完善的药品质量标准ꎬ生物制品检定所在我国药品质量控制㊁创新性药品研究与产业化发展中起到不可或缺的技术支撑作用ꎮ生物制品质量研究与评价重点实验室具备完善的生物制品检验检测体系ꎬ检测技术范围与检测能力在国内相同领域是唯一的也是最全面的ꎬ共获得的ＣＮＡＳ实验室资质认定的项目２２２项ꎮ２０１３年生物制品检定所被评估认定成为ＷＨＯ生物制品标准化和评价合作中心ꎬ２０１７年通过ＷＨＯ生物制品标准化和评价合作中心再认定ꎮ通过广泛的国际药交流(ＷＨＯ㊁英国ＮＩＢＳＣ㊁美国药学会㊁美国ＦＤＡ和人用药物注册技术要求国际协调会议ＩＣＨ等)ꎬ重点实验室不仅引进国外先进的药品质量监管理念和技术ꎬ还将我国的一些优势技术运用于国际标准品和国际药品质量标准的建立中ꎬ在相关领域的国际标准制定中发挥重要作用ꎮ实验室主任:徐苗ꎬ女ꎬ医学博士ꎬ研究员ꎬ博士生导师ꎬ中国食品药品检定研究院生物制品检定所所长ꎮ主要从事疫苗等生物制品质量控制与评价的研究和管理工作ꎮ先后主持国家级课题４项ꎬ参与省部级以上课题６项ꎬ以第一或通信作者在«Ｎａｔｕｒａｌｐｒｏｔｏｃｏｌｓ»«ＥｍｅｒｇｉｎｇＭｉｃｒｏｂｅｓ＆Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ»等杂志上发表论文８０余篇ꎬ编写专著５部ꎬ获授权专利６项ꎬ其中３项已经完成转化ꎬ先后获得中华预防医学会科学技术一等奖㊁中国防痨协会科学技术奖一等奖㊁中国药学会科学技术奖二等奖㊁北京市科学技术二等奖等多个奖项ꎮ获国家市场监管总局抗击新冠疫情先进个人㊁中国药学会以岭生物青年生物奖等ꎮ㊀基金项目:国家重点研发计划(Ｎｏ.２０２１ＹＦＣ２３０２４０４)作者简介:吴小红ꎬ女ꎬ硕士ꎬ副研究员ꎬ研究方向:新型冠状病毒ｍＲＮＡ疫苗及狂犬病疫苗质量控制ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｗｕｘｉａｏｈｏｎｇ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ通信作者:刘欣玉ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向:疫苗质量控制ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１７８０ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｉｕｘｉｎｙｕ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ中和抗体检测应用于新型冠状病毒ｍＲＮＡ疫苗效力分析吴小红ꎬ赵丹华ꎬ所玥ꎬ彭沁华ꎬ王红玉ꎬ刘欣玉ꎬ李玉华(中国食品药品检定研究院虫媒病毒疫苗室ꎬ国家药品监督管理局生物制品质量研究与评价重点实验室ꎬ北京１０２６２９)摘要:目的㊀通过对新型冠状病毒(２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓꎬ２０１９－ｎＣｏＶ)ｍＲＮＡ疫苗(新冠ｍＲＮＡ疫苗)免疫小鼠后产生的中和抗体进行检测ꎬ探索中和抗体检测法应用于ｍＲＮＡ疫苗体内效力评价的可行性ꎮ方法㊀采用６~８周ＢＡＬＢ/ｃ小鼠进行后肢肌肉免疫ꎬ检测不同免疫剂量和不同免疫程序的中和抗体滴度ꎮ并对８家企业生产的新冠ｍＲＮＡ疫苗免疫的小鼠血清进行中和抗体和ＩｇＧ抗体检测ꎮ结果㊀２㊁５㊁１０μｇ不同剂量ｍＲＮＡ疫苗按照不同免疫程序免疫小鼠后中和抗体检测结果显示ꎬ抗体阳转率均为１００％ꎬ中和抗体反应有明显的剂量－效应关系ꎮ２针间隔１４ｄ加强免疫组抗体滴度显著高于间隔７ｄ加强免疫组及１针组(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１)ꎮ２μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体几何平均滴度(ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒꎬＧＭＴ)分别为２１８和４６８ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻ５μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为４９９和１４３６ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻ１０μｇ剂量间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为６０８和１９０９ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５)ꎮ国内８家企业生产的新冠ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后均可产生高滴度的ＩｇＧ抗体(１０４.５~１０７.５)和中和抗体(１０２.６~１０４.８)ꎬ效力测定结果均符合企业质量标准ꎮ各企业生产的ｍＲＮＡ疫苗的中和抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎮ结论㊀小鼠免疫后中和抗体检测可用于ｍＲＮＡ疫苗的体内效力评价ꎮ关键词:新型冠状病毒ꎻｍＲＮＡ疫苗ꎻ中和抗体ꎻＩｇＧ抗体ꎻ效力中图分类号:Ｒ９１７㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)１１－０８９６－００６ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.１１.００９ＳｔｕｄｙｏｎｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏｕｓｉｎｇｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙＷＵＸｉａｏｈｏｎｇꎬＺＨＡＯＤａｎｈｕａꎬＳＵＯＹｕｅꎬＰＥＮＧＱｉｎｈｕａꎬＷＡＮＧＨｏｎｇｙｕꎬＬＩＵＸｉｎｙｕꎬＬＩＹｕｈｕａ(ＮＭＰＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＱｕａｌｉｔｙＣｏｎｔｒｏｌａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＰｒｏｄｕｃｔｓꎬＤｉｖｉｓｉｏｎｏｆＡｒｂｏｖｉｒｕｓＶａｃｃｉｎｅꎬＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０２６２９ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏｂｙｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙａｆ￣ｔｅｒｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎꎬａｎｄｅｓｔａｂｌｉｓｈａｍｅｔｈｏｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇｔｈｅｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅｖａｃｃｉｎｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＢＡＬＢ/ｃｍｉｃｅａｔ６~８ｗｅｅｋｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｍＲＮＡＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅａｎｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｍｍｕｎｅｄｏｓａｇｅａｎｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎｓｃｈｅｄｕｌｅｓｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ.Ｔｈｅｖａｒｉａｎｔｖａｃｃｉｎｅｓｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｓｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄａｔｉｎｔｅｒｖａｌｓｏｆ７ｄｏｒ１４ｄꎬａｎｄｓｅｒｕｍｓａｍｐｌｅｓｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄａｔ７ｄａｆｔｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｄｏｓｅｏｆｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ.２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒ￣ｕｓ(２０１９－ｎＣｏＶ)ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒａｎｄＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｔｅｓｔａｎｄｅｎ￣ｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｓｅｐａｒａｔｅｌｙ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｍｍｕｎｅｄｏｓａｇｅｏｆ２ꎬ５ꎬ１０μｇｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｓｅｒｏｐｏｓｉｔｉｖｅｒａｔｅｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｍｉｃｅｗａｓ１００％ａｎｄｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｒｅａｃ￣ｔｉｏｎｈａｄａｎｏｂｖｉｏｕｓｄｏｓｅ－ｅｆｆｅｃｔｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ.Ｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｏｆｔｈｅ１４－ｄａｙｉｎｔｅｒｖａｌｇｒｏｕｐｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｏｆｔｈｅ７－ｄａｙｉｎｔｅｒｖａｌｇｒｏｕｐａｎｄｏｎｅｄｏｓｅｇｒｏｕｐ(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１).Ｔｈｅｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒｓ(ＧＭＴ)ｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙ２μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ２１８ａｎｄ４６８ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉ￣ｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻＴｈｅＧＭＴｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｄｕｃｅｄｂｙ５μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ４９９ａｎｄ１４３６ꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻＴｈｅＧＭＴｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙ１０μｇｄｏｓａｇｅｉｎｔｅｒｖａｌｏｆ７－ｄａｙａｎｄ１４－ｄａｙｗｅｒｅ６０８ａｎｄ１９０９ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬｗｉｔｈｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５).ＨｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙ(１０４.５~１０７.５)ａｎｄｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ(１０２.６~１０４.８)ｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚｉｎｇｍｉｃｅｗｉｔｈｔｈｅＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎬｐｏｔｅｎｃｙｏｆｔｈｅｖａｃｃｉｎｅｓｗｅｒｅａｌｌｍｅｔｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｗｉｔｈｇｏｏｄｌｏｔｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｅꎬｔｈｅｒｅｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒｓａｍｏｎｇｔｈｅｖａｒｉｏｕｓｖａｃｃｉｎｅｐｒｏｄｕｃｅｄｂｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｍａｎ￣ｕｆａｃｔｕｒｅｒｓ(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１).Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｔｅｓｔｏｆｔｈｅｍｉｃｅａｆｔｅｒｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎｃａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｐｏｔｅｎｃｙｏｆＣＯＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｉｎｖｉｖｏ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:２０１９ｎｏｖｅｌｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓꎻｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎻＮｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙꎻＩｇＧａｎｔｉｂｏｄｙꎻＰｏｔｅｎｃｙ㊀㊀新型冠状病毒感染(ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓｄｉｓｅａｓｅ２０１９ꎬＣＯＶＩＤ－１９)的流行对人类健康造成了严重影响ꎮ疫苗接种已被证实对严重疾病㊁降低住院率和死亡率非常有效[１－２]ꎮ其中ｍＲＮＡ疫苗由于具有能够同时诱导体液免疫和细胞免疫㊁研发和生产周期短㊁容易实现量产等优势ꎬ成为国际上主要采用的ＣＯＶＩＤ－１９疫苗研发技术ꎮ随着新型冠状病毒(２０１９－ｎＣｏＶ)变异株的不断出现ꎬ单价变异株疫苗及多价变异株疫苗可作为加强免疫以及异源序贯免疫来应对病毒变异造成的感染威胁[３]ꎮ新冠ｍＲＮＡ疫苗的效力评价目前尚无国际标准ꎬ欧洲及世界卫生组织(ＷＨＯ)专家多推荐体外活性研究作为该疫苗效力评价的主要方法[４－６]ꎮ鉴于ｍＲＮＡ疫苗为创新技术疫苗ꎬ缺乏系统的疫苗质量研究经验ꎬ我国现阶段采用体内和体外双效力指标进行评价[７]ꎬ体内效力的评价可利用动物免疫后检测中和抗体和/或总抗体的方法来进行[８]ꎮ本研究对新冠ｍＲＮＡ疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序诱导的中和抗体反应进行初步研究ꎬ并对新冠变异株ｍＲＮＡ疫苗及二价ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后的抗体阳性率和抗体水平进行体内效力分析ꎬ从而评价ｍＲＮＡ疫苗的质量ꎮ１㊀材料与方法１.１㊀实验动物㊀ＳＰＦ级ＢＡＬＢ/ｃ小鼠ꎬ６~８周龄ꎬ体重１８~２２ｇꎬ雌雄不限ꎬ由中国食品药品检定研究院动物所提供ꎬ实验动物生产许可证号:ＳＣＸＫ(京)２０２２－０００２ꎬ使用许可证号:ＳＹＸＫ(京)２０２２－００１４ꎬ动物实验伦理批准文号:中检动(福)第２０２２(Ｂ)００８号ꎮ１.２㊀主要试剂及仪器㊀１０ˑＰＢＳ㊁ＴＭＢ㊁终止液购自索莱宝公司ꎻＨＲＰ标记的羊抗小鼠ＩｇＧ购自美国Ｊａｃｋｓｏｎ公司ꎻＢＳＡ购自美国Ｓｉｇｍａ公司ꎻＤＭＥＭ㊁胎牛血清㊁胰酶㊁ＨＥＰＥＳ㊁双抗均购自美国Ｇｉｂｃｏ公司ꎻ荧光素酶检测试剂购自美国普洛麦格Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻＰｒｏｍｅｇａＧｌｏＭａｘ９６微孔板化学发光检测仪(Ｇｌｏｍａｘｎａｖｉｇａｔｏｒ)购自美国普洛麦格Ｐｒｏｍｅｇａ公司ꎻ酶标仪(ＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００)购自美国蒂肯公司ꎮ１.３㊀实验用疫苗㊁细胞㊁不同型别假病毒㊀实验用疫苗为国内企业生产的ｍＲＮＡ疫苗ꎬ编号Ｖ１~Ｖ９ꎮ其中Ｖ１为原型株疫苗ꎬＶ２~Ｖ７为二价２０１９－ｎＣｏＶ变异株ｍＲＮＡ疫苗(ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５株和Ｄｅｌｔａ株双价㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５株和Ｂｅｔａ株双价㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.２株和原型株双价以及ＯｍｉｃｒｏｎＸＢＢ.１.５株和ＢＱ.１.７株双价)ꎬＶ８~Ｖ９是２０１９－ｎＣｏＶ变异株ｍＲＮＡ疫苗(ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.１)ꎻＶｅｒｏ细胞购自ＡＴＣＣꎬ本室传代保存ꎻ假病毒原型株㊁Ｄｅｌｔａ株㊁Ｂｅｔａ株㊁Ｏ￣ｍｉｃｒｏｎＢＡ.１㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.２㊁ＯｍｉｃｒｏｎＢＡ.４/５㊁ＯｍｉｃｒｏｎＸＢＢ.１.５购自北京云菱生物技术公司ꎻ不同株２０１９－ｎＣｏＶＳ蛋白抗原分别购自北京义翘神州生物技术有限公司和北京百普赛斯公司ꎮ１.４㊀免疫剂量及免疫程序１.４.１㊀ｍＲＮＡ疫苗免疫剂量和免疫程序研究㊀将Ｖ１ｍＲＮＡ疫苗(原型株)配制成不同浓度后ꎬ按照不同的免疫程序分成Ａ㊁Ｂ㊁Ｃ３组:Ａ组程序为免疫１针ꎬ１４ｄ采血ꎻＢ组程序为间隔７ｄ加强免疫１针后７ｄ采血ꎻＣ组程序为间隔１４ｄ加强免疫１针后７ｄ采血ꎮ每种免疫程序按照不同的免疫剂量分成３个小组ꎬ分别是每只小鼠注射２㊁５和１０μｇꎬ共计９组ꎬ每组１０只小鼠ꎮ同时１０只小鼠注射生理盐水作为阴性对照组ꎮ每只小鼠后肢肌肉注射１００μＬ疫苗ꎬ眼球取血分离血清ꎬ－２０ħ保存备用ꎮ用假病毒中和试验法检测抗２０１９－ｎＣｏＶ中和抗体ꎮ１.４.２㊀实验疫苗免疫和检测㊀ｍＲＮＡ变异株疫苗及二价疫苗均按照企业的免疫剂量和免疫程序进行免疫和采血ꎬ分离血清后于－２０ħ保存ꎮ分别进行中和抗体和ＩｇＧ结合抗体的检测ꎮ１.５㊀假病毒中和试验(ＰＢＮＡ法)㊀按照操作规程进行[９－１０]ꎬ在９６孔板上３倍系列稀释的血清１００μＬꎬ分别加入各型假病毒[用ＤＭＥＭ培养基稀释至１.３ˑ１０４半数组织培养感染剂量(ＴＣＩＤ５０)/ｍＬ]ꎬ每孔加入５０μＬꎬ同时设立病毒对照和细胞对照ꎮ３７ħ５％ＣＯ２培养箱中和１ｈꎬ加入２ˑ１０５个/ｍＬ的Ｖｅｒｏ细胞悬液ꎬ每孔１００μＬꎬ３７ħ５％ＣＯ２培养箱培养２０~２８ｈ后ꎬ从细胞培养箱中取出９６孔板ꎬ用多道移液器从每个上样孔中吸弃１５０μＬ上清ꎬ然后加入１００μＬ荧光素酶检测试剂ꎬ室温避光反应２ｍｉｎꎮ反应结束后ꎬ用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸６~８次ꎬ使细胞充分裂解ꎬ从每孔中吸出１００μＬ液体ꎬ加于对应９６孔化学发光检测板中ꎬ置于化学发光检测仪中读取发光值ꎮ计算抑制率＝{１－[样品组的发光强度均值－空白对照ＣＣ(ＣｅｌｌＣｏｎｔｒｏｌꎬＣＣ)均值]/[阴性组的发光强度ＶＣ(ＶｉｒｕｓＣｏｎｔｒｏｌꎬＶＣ)均值－空白对照值ＣＣ均值]}ˑ１００％ꎮ根据中和抑制率结果ꎬ按照ＲｅｅｄＭｕｅｎｃｈ法计算中和抗体滴度半数效应剂量(５０％ｍａｘｉｍａｌｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎꎬＥＣ５０)ꎬＥＣ５０>３０为抗体阳性ꎮ１.６㊀特异性抗２０１９－ｎＣｏＶＳｐｉｋｅ蛋白ＩｇＧ抗体检测㊀将２０１９－ｎＣｏＶ各株抗原分别用１ˑＰＢＳ稀释至２μｇｍＬ－１ꎬ取９６孔板每孔加１００μＬꎬ(５ʃ３)ħ条件下包被过夜１６ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ拍干后加入封闭液(２％ＢＳＡ溶液)ꎬ１００μＬ/孔ꎬ３７ħ孵箱里封闭２ｈꎬ加入系列稀释后的待检测血清样本ꎬ３７ħ孵箱里孵育后１ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入辣根过氧化物酶(ＨＲＰ)标记的羊抗小鼠ＩｇＧ抗体ꎬ每孔１００μＬꎬ３７ħ孵育后１ｈꎬＰＢＳＴ洗板３次ꎬ加入底物ＴＭＢ５０μＬꎬ室温避光显色３~５ｍｉｎꎬ加入１ｍｏｌＬ－１硫酸溶液终止液终止ꎬ１５０μＬ/孔ꎬ在酶标仪上检测波长４５０ｎｍ/６３０ｎｍ的ＯＤ值ꎬ以阴性小鼠吸光度均值的２.１倍为ｃｕｔｏｆｆ值ꎮ血清Ａ值大于ｃｕｔｏｆｆ值为抗体阳性ꎬ取阳性Ａ值最大的血清稀释度为血清的ＩｇＧ抗体滴度ꎮ１.７㊀统计学方法㊀使用ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８.０进行数据分析ꎬ相同免疫剂量不同免疫程序以及相同免疫程序不同免疫剂量间中和抗体滴度以及不同企业ｍＲＮＡ疫苗免疫后中和抗体之间比较采用单因素方差分析评估组间差异ꎬ中和抗体和ＩｇＧ抗体之间差异采用ｔ检验分析ꎬＰ<０.０５表示差异有统计学意义ꎮ２㊀结果２.１㊀不同免疫剂量和不同免疫程序的抗体反应㊀针对原型株ｍＲＮＡ疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体检测结果显示ꎬ２㊁５㊁１０μｇｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后ꎬ１针免疫组和２针免疫组抗体阳性率均为１００％ꎮ２㊁５㊁１０μｇ首针免疫后１４ｄ或２１ｄ中和抗体反应具有明显的剂量－效应关系ꎮ相同免疫剂量㊁不同免疫程序结果显示ꎬ２针免疫组高于１针免疫组ꎬ其中２μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝２０.６４ꎬＰ<０.００１)ꎻ５μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝１８.２７ꎬＰ<０.００１)ꎻ１０μｇ剂量组不同针次之间抗体滴度结果差异有统计学意义(Ｆ＝１１.３７ꎬＰ<０.００１)ꎮ２针免疫组中１４ｄ加强免疫组高于７ｄ加强免疫组及１针组(Ｆ＝５７.１３ꎬＰ<０.００１)ꎮ其中２μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫组产生的中和抗体几何平均滴度(ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｍｅａｎｔｉｔｅｒꎬＧＭＴ)分别为２１８和４６８ꎬ１４ｄ为７ｄ的２.１５倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.４０ꎬＰ＝０.００３)ꎻ５μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为４９９和１４３６ꎬ１４ｄ为７ｄ的２.８８倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.６２ꎬＰ＝０.００２)ꎻ１０μｇ间隔７ｄ加强免疫和间隔１４ｄ加强免疫产生的中和抗体ＧＭＴ分别为６０８和１９０９ꎬ１４ｄ为７ｄ的３.１４倍ꎬ差异有统计学意义(ｔ＝３.２３ꎬＰ＝０.００５)ꎮ相同免疫程序㊁不同免疫剂量诱导的抗体反应结果显示ꎬ１针免疫组不同剂量间相比(Ｆ＝７.３３ꎬＰ＝０.００３)ꎻ２针免疫组ꎬ间隔７ｄ不同剂量间相比(Ｆ＝６.４０ꎬＰ＝０.００５)ꎻ２针免疫组ꎬ间隔１４ｄ不同剂量间相比(Ｆ＝７.６４ꎬＰ＝０.００２)ꎬ差异均有统计学意义ꎬ结果见表１ꎮ表１㊀Ｖ１疫苗不同免疫剂量和免疫程序的中和抗体滴度及阳性率剂量/μｇＧＭＴ(９５％ＣＩ)Ａ组Ｂ组Ｃ组Ｆ值Ｐ值阳性率(％)２６０(４６~７３)２１８(１６７~６２９)４６８(２６３~６７４)２０.６４Ｐ<０.００１１００.０５１８７(１０２~２７１)４９９(３１１~６８８)１４３６(７５９~２１１２)１８.２７Ｐ<０.００１１００.０１０３４９(５２~６４６)６０８(２６９~９４８)１９０９(７０９~３１０９)１１.３７Ｐ<０.００１１００.０Ｆ值７.３３６.４０７.６４３.４０ａ３.６２ｂ３.２３ｃＰ值０.００３０.００５０.００２０.００３ａ０.００２ｂ０.００５ｃ阳性率(％)１００.０１００.０１００.０///㊀注:ＧＭＴ为几何平均滴度:９５％ＣＩ:９５％可信区间ꎻ/表示无统计ꎻａｂｃ２㊁５㊁１０μｇ间隔７ｄ和间隔１４ｄ中和抗体滴度分别进行ｔ检验ꎮ２.２㊀８家企业生产的新冠变异株ｍＲＮＡ疫苗体内效力检测结果㊀８家企业生产的疫苗Ｖ２~Ｖ９按照企业的免疫剂量和免疫程序免疫ＢＡＬＢ/ｃ小鼠后ꎬ中和抗体及特异性ＩｇＧ抗体检测结果见表２ꎮ表２㊀不同企业生产的ｍＲＮＡ疫苗抗体检测结果生产者免疫程序检测批数ＬｇＩｇＧ(ＧＭＴ)中和抗体ＥＣ５０(ＧＭＴ)(ＬｇＥＣ５０)Ｖ３７ｄ２针免疫１４ｄ采血Ｖ４７ｄ２针免疫１４ｄ采血Ｖ５１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ６１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ７１４ｄ２针免疫２１ｄ采血Ｖ８１４ｄ２针免疫２８ｄ采血Ｖ９１４ｄ２针免疫２８ｄ采血２５.９５.６１２０２(３.１)Ｎ/Ａ３５.６５.７１２６８(３.１)Ｎ/Ａ１５.９６.０４１０(２.６)９６６(３.０)２６.０５.７６１７(２.８)１４５６(３.２)３６.０５.７６４４(２.８)１６７１(３.２)４６.９６.６６６７(２.８)３９３５(３.６)１４.５４.８１２９１(３.１)２０８０(３.３)２４.７４.９１５５６(３.２)２３５３(３.４)３４.７４.８１３６１(３.１)２５８２(３.４)４４.６４.９１０５０(３.０)１９３１(３.３)１６.０６.１１２７４(３.１)３８１２(３.６)２６.１５.８１１７０(３.１)２７９８(３.４)３６.０５.８１５８９(３.２)３０９７(３.５)４６.０６.０１２９８(３.１)４０７４(３.６)１５.０４.８７４９５(３.９)１４２７(３.２)２５.１５.０６２３０(３.８)１２５７(３.１)３５.３５.２９５８０(４.０)２８０６(３.４)１７.１/２４４５３(４.４)/２７.５/２７９７６(４.４)/３７.５/２６９７９(４.４)/１５.６/６５６３０(４.８)/２５.６/４０４４５(４.６)/３５.６/２５３４３(４.４)/Ｆ值或ｔ值１１.４７ａ１７.５６ｂ７０.０３ｃＰ值Ｐ<０.００１ａＰ<０.００１ｂＰ<０.００１ｃ㊀注: / 代表该疫苗为单价疫苗ꎻ Ｎ/Ａ代表该组分未检测ꎻ １㊁２㊁３㊁４分别代表检测批数ꎮａ代表组分１ＩｇＧ结合抗体和中和抗体滴度ｔ检验结果ꎻｂ代表组分２ＩｇＧ结合抗体和中和抗体滴度ｔ检验结果ꎻｃ代表各企业之间中和抗体滴度方差分析结果ꎮ组分１和组分２代表双价疫苗中的单价组分ꎬ如Ｖ７疫苗:组分１为德尔塔株ꎬ组分２为奥密克戎ＢＡ.４/５株ꎮ２.３㊀特异性ＩｇＧ结合抗体和中和抗体结果分析㊀检测结果以对数转换后进行ｔ检验ꎬ组份１ＩｇＧ和ＥＣ５０比较ｔ＝１１.４７ꎬＰ<０.００１ꎻ组份２ＩｇＧ和ＥＣ５０比较ｔ＝１７.５６ꎬＰ<０.００１ꎬ均显示中和抗体检测结果和ＩｇＧ结合抗体检测差异有统计学意义ꎮＰｅａｒｓｏｎ相关系数ｒ分别为０.４２和０.２２ꎮ虽然两种方法抗体检测结果相关性较差ꎬ但均可以检测到高水平的抗体特异性反应ꎮ两种方法检测各企业３~４批疫苗ꎬＩｇＧ抗体结果批间变异系数在１.０％~７.６％ꎬ中和抗体结果批间变异系数在２.０％~７.９％ꎬ提示两种抗体检测方法均可以用于评价疫苗体内效价的批间一致性ꎮ各企业ｍＲＮＡ疫苗的中和抗体结果对数转换后进行组间方差分析ꎬ差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎮ３㊀讨论新冠ｍＲＮＡ疫苗临床前和临床研究中均证实疫苗的有效性与动物或人群保护力之间有一定的量效关系[１１－１４]ꎮ中和抗体是最重要的保护性抗体ꎬ与２０１９－ｎＣｏＶ感染者症状严重程度之间也有一定的相关性[１５－１６]ꎮ因此建立标准的中和抗体检测平台技术对ＣＯＶＩＤ－１９疫苗进行评价尤为重要[１７]ꎮ本研究采用的假病毒中和方法经国内多家实验室联合验证[９ꎬ１８]ꎬ抗体检测结果相对客观ꎬ与ＩｇＧ结合抗体检测相比更能体现疫苗的免疫原性ꎮ尤其对于多价疫苗ꎬ假病毒中和抗体检测方法可实现对不同变异株抗体分别进行检测ꎬ能较好的反映出针对多价疫苗各毒株组份疫苗诱导的抗体中和活性ꎮ通过对１批ｍＲＮＡ原型株疫苗不同免疫剂量和不同免疫程序的分析ꎬ提示ｍＲＮＡ疫苗免疫小鼠后的中和抗体水平与免疫剂量和免疫程序有密切关系ꎮ本研究发现ꎬ同等剂量下(２㊁５㊁１０μｇ)间隔７ｄ与间隔１４ｄ２针免疫的抗体结果差异有统计学意义ꎬ对于ｍＲＮＡ疫苗来说ꎬ间隔７ｄ的第２针加强免疫不是产生高滴度中和抗体的最适宜的程序ꎬ疫苗实际使用过程中第２针加强免疫的时间选择在２１ｄ或２８ｄ[１１－１２]ꎮ因此ｍＲＮＡ疫苗体内效力的评价应适当关注免疫程序的设计ꎮ研究结果显示ｍＲＮＡ变异株单价疫苗或二价疫苗中针对不同组分的ＩｇＧ抗体滴度均在１０４.５~１０７.５间ꎬ符合各企业的质量标准(不低于１０３或１０４)ꎬ且各企业生产的疫苗ＩｇＧ抗体结果批间一致性良好ꎬ变异系数在１.０％~７.６％之间ꎮ假病毒法检测中和抗体滴度在１０２.６~１０４.８之间ꎬ不同企业生产的疫苗免疫后中和抗体水平差异有统计学意义(Ｆ＝７０.０３ꎬＰ<０.００１)ꎬ与国产ｍＲＮＡ疫苗已公布的Ⅰ~Ⅱ期临床研究数据一致ꎬ不同企业新冠ｍＲＮＡ疫苗在人体内产生的中和抗体滴度有差异[１２－１５]ꎮ各企业不同批次中和抗体检测结果变异系数为２.０％~７.９％ꎮ因此中和抗体检测可用于不同企业ｍＲＮＡ疫苗效力的比较研究以及疫苗批间一致性的评价ꎮ辉瑞公司生产的ＢＮＴ１６２ｂ为３０μｇ/剂ꎬ莫德纳公司ｍＲＮＡ－１２７３为１００μｇ/剂ꎮ两款疫苗对２０１９－ｎＣｏＶ感染的保护效力分别达到了９４.６％和９４.１％ꎬ不同的人用剂量和免疫程序可产生相同的临床保护力[１９－２１]ꎮｍＲＮＡ－１２７３Ⅲ期临床研究结果显示接种该疫苗后假病毒法检测中和抗体滴度半数抑制稀释(５０％ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｄｉｌｕｔｉｏｎꎬＩＤ５０)为１０㊁１００和１０００ꎬ测算疫苗保护效力分别为７８％㊁９１％和９６％[２２]ꎻ新冠灭活疫苗ＮＶＸ－ＣｏＶ２３７３中和抗体滴度ＩＤ５０为５０㊁１００和７２３０(ＩＵ５０ｍＬ－１)ꎬ疫苗保护效力分别为７５.７％㊁８１.７％和９６.８％[２３]ꎮ本研究结果显示国产新冠ｍＲＮＡ疫苗小鼠免疫后中和抗体均达到较高水平ꎬ无论是１针免疫还是２针免疫ＥＣ５０除个别企业因单价组分配比含量低ꎬ造成滴度偏低(Ｖ４)外ꎬ其余企业中和抗体滴度均在在１０００以上甚至更高ꎬ提示国产新冠ｍＲＮＡ疫苗的体内效力结果已达到较高的标准要求ꎮ虽然本研究未利用上述新冠ｍＲＮＡ疫苗进一步开展攻毒保护力研究ꎬ但随着ｍＲＮＡ疫苗大量的临床研究数据以及真实世界的保护力数据公布ꎬ会对疫苗的效力评价标准提供更有效的数据支持ꎮ尽快建立效力评价用疫苗参考品和血清检测用标准物质ꎬ提高国产ｍＲＮＡ疫苗的质量评价水平是下一步研究方向ꎮ参考文献:[１]㊀ＥＡＲＬＥＫＡꎬＡＭＢＲＯＳＩＮＯＤＭꎬＦＩＯＲＥ－ＧＡＲＴＬＡＮＤＡꎬｅｔａｌ.ＥｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒａｎｔｉｂｏｄｙａｓａｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｆｏｒＣＯ￣ＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｓ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０２１ꎬ３９(３２):４４２３－４４２８. 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[９]ＮＩＥＪꎬＬＩＱꎬＷＵＪꎬｅｔａｌ.Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔａｎｄｖａｌｉｄａｔｉｏｎｏｆａｐｓｅｕｄｏ－ｖｉｒｕｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２[Ｊ].ＥｍｅｒｇＭｉｃｒｏｂｅｓＩｎｆｅｃｔꎬ２０２０ꎬ９(１):６８０－６８６.[１０]ＮＩＥＪꎬＬＩＱꎬＷＵＪꎬｅｔａｌ.ＱｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｂｙａｐｓｅｕｄｏ－ｔｙｐｅｄｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄａｓｓａｙ[Ｊ].ＮａｔＰｒｏｔｏｃꎬ２０２０ꎬ１５(１１):３６９９－３７１５.[１１]ＬＩＪＬꎬＬＩＵＱꎬＬＩＵＪꎬｅｔａｌ.ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＢｉｖａｌｅｎｔｍＲＮＡＶａｃｃｉｎｅｓａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２Ｖａｒｉａｎｔｓ[Ｊ].Ｖａｃ￣ｃｉｎｅｓ(Ｂａｓｅｌ)ꎬ２０２２ꎬ１０(１１):１８０７.[１２]ＹＡＮＧＲꎬＤＥＮＧＹꎬＨＵＡＮＧＢＹꎬｅｔａｌ.Ａｃｏｒｅ－ｓｈｅｌｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅｄＣＯＶＩＤ－１９ｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｗｉｔｈｆａｖｏｒａｂｌｅｂｉｏ￣ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｐａｔｔｅｒｎａｎｄｐｒｏｍｉｓｉｎｇｉｍｍｕｎｉｔｙ[Ｊ].ＳｉｇｎａｌＴｒａｎｓｄｕｃｔＴａｒｇｅｔＴｈｅｒꎬ２０２１ꎬ６(１):２１３.[１３]ＣＨＥＮＧＬꎬＬＩＸＦꎬＤＡＩＸＨꎬｅｔａｌ.Ｓａｆｅｔｙａｎｄｉｍｍｕｎｏｇｅ￣ｎｉｃｉｔｙｏｆｔｈｅＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ＡＲＣｏＶｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅｉｎＣｈｉｎｅｓｅａｄｕｌｔｓ:ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄꎬｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄꎬｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎ￣ｔｒｏｌｌｅｄꎬｐｈａｓｅ１ｔｒｉａｌ[Ｊ].ＬａｎｃｅｔＭｉｃｒｏｂｅꎬ２０２２ꎬ３(３):ｅ１９３－ｅ２０２.[１４]ＸＵＫꎬＬＥＩＷＷꎬＫＡＮＧＢꎬｅｔａｌ.ＡｎｏｖｅｌｍＲＮＡｖａｃｃｉｎｅꎬＳＹＳ６００６ꎬａｇａｉｎｓｔＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２[Ｊ].ＦｒｏｎｔＩｍｍｕｎｏｌꎬ２０２３(１３):１０５１５７６.[１５]ＧＡＲＣＩＡ－ＢＥＬＴＲＡＮＷＦꎬＬＡＭＥＣꎬＡＳＴＵＤＩＬＬＯＭＧꎬｅｔａｌ.ＣＯＶＩＤ－１９－ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｐｒｅｄｉｃｔｄｉｓｅａｓｅｓｅｖｅｒｉｔｙａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０２１ꎬ１８４(２):４７６－４８８. [１６]ＫＨＯＵＲＹＤＳꎬＣＲＯＭＥＲＤꎬＲＥＹＮＡＬＤＩＡꎬｅｔａｌ.Ｎｅｕ￣ｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｌｅｖｅｌｓａｒｅｈｉｇｈｌｙｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅｏｆｉｍｍｕｎｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｆｒｏｍｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].ＮａｔＭｅｄꎬ２０２１ꎬ２７(７):１２０５－１２１１.[１７]ＷＡＮＧＹＣ.ＳｔａｎｄａｒｄｉｚｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｓｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙａｓｓａｙｓａｒｅｎｅｅｄｅｄｆｏｒｅｖａｌｕａｔｉｎｇＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｓ[Ｊ].ＥＢｉｏＭｅｄｉ￣ｃｉｎｅꎬ２０２１(７３):１０３６７７.[１８]ＧＵＡＮＬＤꎬＹＵＹＬꎬＷＵＸＨꎬｅｔａｌ.ＴｈｅｆｉｒｓｔＣｈｉｎｅｓｅｎａ￣ｔｉｏｎａｌｓｔａｎｄａｒｄｓｆｏｒＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙ[Ｊ].Ｖａｃｃｉｎｅꎬ２０２１ꎬ３９(２８):３７２４－３７３０.[１９]ＰＯＬＡＣＫＦＰꎬＴＨＯＭＡＳＳＪꎬＫＩＴＣＨＩＮＮꎬｅｔａｌ.ＳａｆｅｔｙａｎｄＥｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅＢＮＴ１６２ｂ２ｍＲＮＡＣｏｖｉｄ－１９Ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２０ꎬ３８３(２７):２６０３－２６１５.[２０]ＳＫＯＷＲＯＮＳＫＩＤＭꎬＤＥＳＥＲＲＥＳＧ.ＳａｆｅｔｙａｎｄｅｆｆｉｃａｃｙｏｆｔｈｅＢＮＴ１６２ｂ２ｍＲＮＡｃｏｖｉｄ－１９ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２１ꎬ３８４(１６):１５７６－１５７７.[２１]ＢＡＤＥＮＬＲꎬＥＬＳＡＨＬＹＨＭꎬＥＳＳＩＮＫＢꎬｅｔａｌ.ＥｆｆｉｃａｃｙａｎｄｓａｆｅｔｙｏｆｔｈｅｍＲＮＡ－１２７３ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ｖａｃｃｉｎｅ[Ｊ].ＮＥｎｇｌＪＭｅｄꎬ２０２１ꎬ３８４(５):４０３－４１６.[２２]ＧＩＬＢＥＲＴＰＢꎬＭＯＮＴＥＦＩＲＲＩＤＣꎬＭＣＤＥＲＭＯＴＴＡＢꎬｅｔａｌ.ＩｍｍｕｎｅｃｏｒｒｅｌａｔｅｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｍＲＮＡ－１２７３ＣＯ￣ＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ[Ｊ].Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ２０２２ꎬ３７５(６５７６):４３－５０.[２３]ＦＯＮＧＹꎬＨＵＡＮＧＹꎬＢＥＮＫＥＳＥＲＤꎬｅｔａｌ.Ｉｍｍｕｎｅｃｏｒｒｅ￣ｌａｔｅｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅＰＲＥＶＥＮＴ－１９ＣＯＶＩＤ－１９ｖａｃｃｉｎｅｅｆｆｉｃａｃｙｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌ[Ｊ].ＮａｔＣｏｍｍｕｎꎬ２０２３ꎬ１４(１):３３１.(收稿日期:２０２３－１０－１３)(上接第８８３页)[１５]ＷＵＹＢꎬＰＥＮＧＭＣꎬＺＨＡＮＧＣꎬｅｔａｌ.Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｄｅｔｅｒ￣ｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｍｕｌｔｉ－ｃｌａｓｓｂｉｏａｃｔｉｖｅｃｏｎｓｔｉｔｕｅｎｔｓｆｏｒｑｕａｌｉｔｙａｓｓｅｓｓｍｅｎｔｏｆｔｅｎＡｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓꎬｆｏｕｒＧｏｏｄｙｅｒａａｎｄｏｎｅＬｕｄｉｓｉａｓｐｅｃｉｅｓｉｎＣｈｉｎａ[Ｊ].ＣｈｉｎＨｅｒｂＭｅｄꎬ２０２０ꎬ１２(４):４３０－４３９.[１６]ＤＵＸＭꎬＩＲＩＮＯＮꎬＦＵＲＵＳＨＯＮꎬｅｔａｌ.ＰｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌｌｙａｃｔｉｖｅｃｏｍｐｏｕｎｄｓｉｎｔｈｅＡｎｏｅｃｔｏｃｈｉｌｕｓａｎｄＧｏｏｄｙｅｒａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＪＮａｔＭｅｄꎬ２００８ꎬ６２(２):１３２－１４８.[１７]ＤＵＸＭꎬＳＵＮＮＹꎬＣＨＥＮＹꎬｅｔａｌ.Ｈｅｐａｔｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅａｌｉ￣ｐｈａｔｉｃｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓｆｒｏｍｔｈｒｅｅＧｏｏｄｙｅｒａｓｐｅｃｉｅｓ[Ｊ].ＢｉｏｌＰｈａｒｍＢｕｌｌꎬ２０００ꎬ２３(６):７３１－７３４.[１８]张婉菁ꎬ刘量ꎬ胡荣ꎬ等.斑叶兰抗氧化活性组分研究及其乳膏的制备[Ｊ].中医药导报ꎬ２０１７ꎬ２３(１):５９－６２. 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气相色谱法快速检测白酒中醇和酯

气相色谱法快速检测白酒中醇和酯摘要：白酒作为我国特色酒种，长期受到国内外广大消费者的青睐。

为了进一步迎合市场需求，提升白酒质量，吸引更多消费者，对白酒中的醇和酯类成分进行研究是具有一定的必要性的。

气相色谱法可以对白酒中各种成分进行定性及定量的有效检测，这些成分的含量与配比是决定白酒香型和风味的决定性因素。

尤其是醇与酯这两类物质，与白酒的口感、香气都有着密切的关系。

因此，本研究以气相色谱法为研究方法，对白酒中的醇与酯进行了检测，并从测定条件、定量检测、回收率实验、经密度测定和适用性检测几个角度对试验方法进行了分析，以期为我国白酒质量检测的方法优化提供参考。

关键词：气相色谱法；白酒；醇类物质；酯类物质有效掌握白酒中的醇类物质与酯类物质的机理，是白酒生产厂家提升白酒质量的最优途径之一。

甲醇是白酒在实际生产中产生的一种对人体具有不良影响的毒性物质，若人体在短时间内摄入的白酒总量过多，就会导致大量的甲醇在人体内积累，对人体健康产生维系。

之类物质是白酒产生香气的最主要的物质，是决定白酒品质的关键物质之一。

合理的调控把握白酒中醇和酯类物质的含量，能够直接影响白酒产品的质量与健康安全性。

1 材料与方法1.1 实验仪器以气相色谱法进行白酒中醇和酯的检测，其所需要的应用到的仪器包括：气相色谱仪、超纯水处理器、电子天平、移液枪、1μL微量进样器等。

其中气相色谱仪应选择具有氢火焰离子化监测器的型号，如4890D气相色谱仪等，色谱柱需要满足对白酒的分析需求。

1.2 实验试剂实验所需要使用的实验试剂如表1所示。

表1 实验试剂实验试剂化学式规格甲醇CH4O色谱纯仲丁醇C4H10O色谱纯正丙醇C3H8O色谱纯异丁醇C4H10O色谱纯正丁醇C4H10O色谱纯异戊醇C5H12O色谱纯乙酸乙酯C4H8O2色谱纯己酸乙酯C8H16O2色谱纯乙醇C2H6O优级纯样品的制备：（1）使用移液管将600mL的无水乙醇转移于1L的容量瓶中，使用纯水进行定容，在达到刻度线后进行摇匀，溶液均匀后即得到了浓度为60％的乙醇溶液，放置以备后续标样等的制使用；（2）取甲醇0.3g，并将其置于50mL的容量瓶中，以60％乙醇溶液进行定容，配置成标准样品——6g/L，贴标签备用，同理制作仲丁醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、异戊醇、乙酸乙酯、己酸乙酯等其余7种标准样；（3）在8瓶标样中分别取1mL置于50mL容量瓶中，以60％乙醇定容后摇匀，后将其稀释到标准浓度（6g/L），得到混合标准样品，放置备用。

食品卫生学稳定性试验要求

功效/标志性成分试验存在的问题
产品申报单位的问题主要由于申报者在功效(标志)成分检验方法上技术投入不足： • 功效(标志)成分的确定不合理或依据不足；如：配方中加入吡啶甲酸铬作为原料，选择总铬作为功效成份不合理; • 未能向试验机构提供功效(标志)成分检验方法；
卫生学试验
确定卫生学试验检验项目的主要依据之一是GB16740《保健（功能）食品通用标准》： • 感官指标 • 净含量 • 铅、总砷、总汞 • 微生物
单件定量包装产品净含量允许负偏差
净含量 Q 5g～50g 5mL～50mL 50g～100g 50mL～100mL 100g～200g 100mL～200mL 200g～300g 200mL～300mL 300g～500g 300mL～500mL 500g～1kg 500mL～1L 1kg～10kg 1L～10L 负偏差 Q的百分比 9 — 4.5 — 3 — 1.5 g或mL — 4.5 — 9 — 15 —
GB/T5009.37 GB/T5009.56 GB/T5009.22等 GB/T5009.24 GB/T18980
不同剂型水分指标要求
剂型蜜丸和浓缩蜜丸水蜜丸和浓缩水蜜丸硬胶囊水分指标要求 ≤15% ≤ 12%
≤9 %（除另有规定外） (内容物为液体或半固体不检查水分) 对水分不做要求软胶囊 — 茶剂（袋装茶剂与煎煮茶剂） ≤12%（除另有规定外）颗粒剂片剂 ≤6%（除另有规定外）除另有规定外，对水分不做具体要求。
部分原料的功效/标志性成分（仅供参考）
原料葡萄籽提取物功效/标志成分原花青素可以参考的检验方法
红曲洛伐它丁山楂、蜂黄酮类胶、花粉低聚糖异麦芽低聚糖、低聚果糖、大豆低聚糖动物性蛋白质、氨基酸原料角鲨烯角鲨烯绞股蓝绞股蓝总皂苷

检验标准操作规程

ABC 有限公司 GMP 标准操作规程目的：建立检验操作通则和药典范例，保证结果准确。

应用范围：适宜于药品检验标准依据。

责任人： QC 、QA 。

内容：1 化验室所有人员必须严格按照检验标准操作规程中规定的方法和步骤对所有检品进行检验。

2 化验员按照下列通则使用检验样品：2.1 鉴别试验和限度试验作单一性试验。

2.2 含量测定作双份平行试验。

2.3 若样品由两个或者两个以上混合样品组成，鉴别试验和限度试验作单一性试验，试样由混合样品各取等量混合而成，含量测定分别取混合样品进行平行试验。

3 检验时，应核对试剂、试液的名称、级别/浓度是否符合要求，是否在规定有效期内，仪器设备是否正常，仪器量器校正、操作的正确性，时间限制 (加热、恒温、灭菌等)，确认无误则检验有效。

4 检验过程中，使用仪器设备时，应按其标准操作规程执行。

检验过程中浮现异常情况(含量不平行、不合格、仪器故障、停电、停水等) 须复检。

5 QC 在检验的同时，应认真、如实的填写化验记录。

6 凡例6.1 总则一、《中华人民共和国药典》简称《中国药典》，依据《中华人民共和国药品管理法》组织制定和颁布实施。

《中国药典》一经颁布实施，其同品种的上版标准或者其原国家标准即同时住手使用。

《中国药典》由一部、二部、三部及其增补本组成，内容包括凡例、正文和附录。

除特殊注明班次外，《中国药典》均指现行版《中国药典》。

本部为《中国药典》二部。

检验标准操作规程审核审核日期质量部颁发数量份质量部、 QC 公司组织机构变更、重新修订文件编码：共 10 页第1页批准批准日期生效日期题目制定制定日期颁发部门分发部门修订原因二、国家药品标准由凡例与正文及其引用的附录共同构成。

本部药典收载的凡例、附录对药典以外的其他化学药品国家标准具同等效力。

三、“凡例”为正确使用《中国药典》进行药品质量检定的基本原则，是对《中国药典》正文、附录及与质量检定有关的共性问题的统一规定。

药理实验课讲义(药学专业)

药理学实验须知一、明确药理实验的目的要求药理学实验课是药理学教学的一个重要组成部分。

它的目的任务一方面是验证理论，巩固并加强对理论知识的理解；另一方面是通过实验掌握研究药物作用的基本操作方法和技能，培养对科学工作严肃的态度，严肃的方法和严格的要求，培养根据客观实际分析问题和解决问题的能力，为今后进行科学研究，打下初步基础，以便为实现中西医药结合作出贡献。

药理实验包括进行实验操作(有些部分可进行病例讨论)、整理实验结果写出实验报告等环节。

为了提高实验效果，实验前应作好预习，明确本次实验目的、方法步骤和原理，做到心中有数，避免实验中出现忙乱和差错。

实验过程中要在教师指导下加强培养独力操作能力，克服对教师的依赖性。

通过实验操作要求在生理生化实验的基础上掌握固定动物和各种给药方法，掌握剂量换算和麻醉方法，学会观察记录主要生理生化指标，掌握注射器、天平、磅秤、二导生理记录仪、药理生理多用仪及描记装置等用法，掌握离体心脏、肠管、子宫和在体动物血压、呼吸及各系统药物的主要实验方法。

二、作好实验结果的处理药理实验结果有生理记录仪等记录的曲线、测量资料(如血压、心率、瞳孔大小、睡眠时间等测量的数据)和计数资料（如动物死活数、阴性和阳性反应数等数据）等几种。

要如实地准确地对观察到的数据及时加以记录，决不可想当然地用主要观想象或书本理论代替实验观察到的客观事实。

实验完毕对结果分别加以整理。

记录曲线要加以剪裁。

注明动物性别、体重、日期、实验题目、给药剂量等。

计数资料和测量资料应酌情列表或画图以便比较，使结果一目了解。

三、写好实验报告写实验报告是培养文字表达能力和概括综合分析问题能力的重要训练方法。

每次实验后要求用统—实验报告本写好报告，交负责教师评阅。

在实验报告中要求列出实验题目、实验方法和实验结果。

有时要对实验结果产生的原理或对实验结果异常的原因略加讨论。

讨论不可离开实验结果去抄书。

实验指导所列思考题或讨论题是为加深对实验的理解，如果与实验结果无关，不必写入实验报告。

保健食品毒理学安全性评价

• 从生物医学角度研究化学物质对生物机体损害作用及其机制科学。
• 任何一个化学物在一定条件下都可能是对机体产生任有害作用。
保健食品毒理学安全性评价
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毒理学
• 描述毒理学、机制毒理学、管理毒理学 • （法规毒理学） • 毒作用谱: • 系统毒性；致突变；致畸；致癌
保健食品毒理学安全性评价
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○
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50
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15 30
60
NOAEL LOAEL
阈
mg/kg
保健食品毒理学安全性评价
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描述毒理学试验基础标准
○化学物在试验动物产生作用, 能够外推于人。
○试验动物必须暴露于高剂量, 这是发觉对人潜在危害必需和可靠方法。
○成年健康（雄性和雌性未孕）试验动物和人可能暴露路径是基础选择。
保健食品毒理学安全性评价
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保健食品原料
药食同源（附件1）可用于保健食品（附件2）？？？？禁用于保健食品（附件3）。
保健食品毒理学安全性评价
第31页
？？？
• 以普通食品、卫生部要求药食同源物质和允许用作保健食品物质以外动植物或动植物提取物、微生物、化学合成物为原料生产保健食品, 应对该原料和用该原料生产保健食品分别进行安全性评价。
保健食品毒理学安全性评价
第28页
附件2 可用于保健食品物品名单
人参、人参叶、人参果、三七、土茯苓、大蓟、女贞子、山
茱萸、川牛膝、川贝母、川芎、马鹿胎、马鹿茸、马鹿骨、
丹参、五加皮、五味子、升麻、天门冬、天麻、太子参、巴

药物临床试验期间安全性评价要点

药物临床试验期间安全性评价要点众所周知，药物临床试验安全性评价在临床试验的生命周期中尤为重要，临床试验讲究的无非是安全性、有效性，随着近年来国内临床试验的体量不断增大，国家监管部门的力度也在不段加强，陆续发布了多个临床试验安全评价与报告要求相关的指导原则，对不断规范和指导申办者在临床试验期间、甚至上市后的不良反应监测等方面起到了极大的推动作用。

2022年10月25日国家药品监督管理局药品审评中心公布了《新药临床安全性评价技术指导原则》征求意见稿，本期结合该意见稿内容及药物临床试验中安全性评价的相关知识点进行了梳理。

一、药物临床试验安全性评价的目的及意义1）目的不同的临床试验安全性评价的侧重点均有不同，常见分类及目的如下：临床试验期间安全性评价--主要目的是及时发现潜在的严重风险。

对临床试验期间发生的严重不良事件，应通过对药物和严重不良事件的因果关系分析，以识别出应快速报告的情况，例如可疑且非预期严重不良反应（SUSAR）。

判断严重不良事件是否满足SUSAR的定义，对于避免提交无意义的加速报告非常重要。

申报上市申请时的安全性评价--主要目的是基于多项临床试验的安全性数据，评估药物的总体安全性特征，为获益-风险充分评估提供支持。

2）意义药物安全性评价是贯穿新药临床前研究、临床试验、上市后再评价全生命周期的一项工作。

在不同研发阶段，评价的重点和难点会有所不同，比如在I-III期临床试验中需收集受试者的疗效及可耐受的安全性数据进行安全性评价，为上市后能够广泛应用提供了最重要的安全保障。

二、新药临床试验期间进行安全性评价的方法新药临床安全性评价是新药获益-风险评估的重要基础，此原则旨在进一步科学指导新药安全性评价。

临床试验期间发现单个病例事件、发生一次或多次的事件、或很难或无法根据个例或少量病例确定因果关系的严重不良事件、以及发生率明显高于预期的已知严重不良反应，以上情况经个例分析或汇总分析后，判定与药物有因果关系的，可确定为可疑且非预期严重不良反应（SUSAR），并按程序进行快速报告。

药物的安全性评价试验方法

药物的安全性评价试验方法药物的安全性评价试验方法是一种通过实验来评估药物在人体内的安全性和耐受性的方法。

在药物研究和开发过程中，安全性评价是非常重要的一步，旨在确保研发的药物对人体不会产生严重的不良反应或毒副作用。

下面是一些常见的药物安全性评价试验方法：1.动物实验：这是药物安全性评价的最早的步骤，一般在小型动物模型（如小鼠和大鼠）进行。

通过给动物灌胃、注射或外用给药，观察药物的死亡率、体重变化、生化指标、脏器病变等指标，来判断药物的安全性。

2.生物样本检测：在药物研发过程中，需要对人体样本进行分析，以了解药物在人体内的代谢和分布情况。

例如，通过测定药物在人体血液、尿液和粪便中的浓度和代谢产物，来评估药物的安全性。

3.临床前研究：在药物进入临床阶段之前，需要进行一系列临床前研究，以评估药物的安全性和有效性。

这些研究包括体外试验（如细胞毒性评价、细胞转化和突变性试验等）和体内试验（如亚慢性和慢性毒性试验，致畸、致癌和生殖毒性试验等）。

4.临床试验：在药物研发的最后阶段，需要进行临床试验来评价药物的安全性和有效性。

临床试验分为多个阶段，包括I期、II期、III期和IV期临床试验。

在这些试验中，研究人员会对药物进行不同剂量的给药，在大量的单个或群体中观察并记录药物的不良反应和效果。

5.不良事件报告：药物上市后，研究人员会持续监测和评估药物的安全性。

不良事件报告系统是一种被动的药物监测系统，用于监测和报告不良反应和药物事件。

医生、患者和药企可以通过不良事件报告系统向药物监管机构报告不良反应，从而帮助提高药物的安全性。

综上所述，药物的安全性评价试验方法是一个多方面、多层次的过程，包括动物实验、生物样本检测、临床前研究、临床试验和不良事件报告等。

这些方法的目标是评估和确保药物对人体的安全性和耐受性，从而保障药物的质量和可靠性。

农用微生物菌剂[GB20287_2006]

农用微生物菌剂（GB 20287-2006）前言本标准的5.1、5.3和第8章条文为强制性条款，其余为推荐性条款。

本标准的附录A、附录C和附录D为规范性附录，附录B为资料性附录。

农用微生物菌剂1 范围本标准规定了农用微生物菌剂（即微生物接种剂）的术语和定义、产品分类、要求、试验方法、检验规则、包装、标识、运输和贮存。

本标准适用于农用微生物菌剂类产品。

2 规范性引用文件（略）3 术语和定义（略）4 产品分类产品按剂型可分为液体、粉剂、颗粒型；按内含的微生物种类或功能特性可分为根瘤菌菌剂、固氮菌菌剂、解磷类微生物菌剂、硅酸盐微生物菌剂、光合细菌菌剂、有机物料腐熟剂、促生菌剂、菌根菌剂、生物修复菌剂等。

5 要求5.1 菌种生产用的微生物菌种应安全、有效。

生产者应提供菌种的分类鉴定报告，包括属及种的学名、形态、生理生化特性及鉴定依据等完整资料。

生产者应提供菌种安全性评价资料。

采用生物工程菌，应具有允许大面积释放的生物安全性有关批文。

5.2 产品外观（略）5.3 产品技术指标5.3.1 农用微生物菌剂产品的技术指标见表1，其中有机物料腐熟剂产品的技术指标按表2执行。

表1 农用微生物菌剂产品的技术指标表2 有机物料腐熟剂产品的技术指标5.3.2 农用微生物菌剂产品中无害化指标见表3。

表3 农用微生物菌剂产品的无害化技术指标6 试验方法6.1 仪器设备（略）6.2 试剂（略）6.3 产品参数的检测6.3.1 外观(感官)的测定取少量样品放到白色搪瓷盘(或白色塑料调色板)中，仔细观察样品的颜色、形状、质地。

6.3.2 有效活菌数的测定采用平板计数法，根据所测微生物的种类选用适宜的培养基。

若采用最大可能数（Most Probable Number，MPN）5管法，遵照附录C的规定。

6.3.2.1 系列稀释称取样品10 g（精确到0.01 g），加入带玻璃珠的100 mL的无菌水中(液体菌剂取l0.0 mL加入90 mL的无菌水中)，静置20 min，在旋转式摇床上200 r/min充分振荡30 min，即成母液菌悬液（基础液）。

药物分析习题与参考答案

一、单选题（A1型题-最佳选择题）（本大题共22小题，共22分）1. 我国现行药品质量标准有A、国家药典和地方标准B、国家药典、部颁标准和国家药监局标准C、国家药典、国家药监局标准（部标准）和地方标准D、国家药监局标准和地方标准E、国家药典和国家药品标准（国家药监局标准）2. 中国药典主要内容分为A、正文、含量测定、索引B、凡例、制剂、原料C、鉴别、检查、含量测定D、前言、正文、附录E、凡例、正文、附录3. 滴定液的浓度系指：A.mol/LB.mmol/LC.g /100mlD.%（ml/ml）4. 凡例、正文、附录是A.药典内容组成的三部分B.英文缩写ChP代表C.药品必须符合质量标准的要求D.表明原料药质量优、劣E.药品检验、流通、生产质量控制的依据5. 2009年以前，中华人民共和国共出版了几版药典A.6版B.7版C.8版D.9版6. 关于中国药典，最正确的说法是A.一部药物分析的书B.收载所有药物的法典C.一部药物词典D.国家监督管理药品质量的法定技术标准E.我国中草药的法典7. 我国药典修订一次是A.10年B.7年C.5年D.3年E.1年8. 酸碱性试验时未指明指示剂名称的是指A、1~14的PH试纸B、酚酞指示剂C、石蕊试纸D、甲基红指示剂E、6~9PH试纸9. 注射液中抗氧化剂亚硫酸氢钠对碘量法有干扰，可采用下列哪一试剂与其生成加成物而排除干扰？A、硼酸B、草酸C、甲醛D、酒石酸E、丙醇10. 中国药典规定，凡检查溶出度的制剂，可不再进行A、崩解时限检查B、主药含量检查C、热原实验D、含量均匀度检查E、重（装）量检查11. 用碘量法测定加有亚硫酸氢钠的维生素C注射液，在滴定前应加入A.氯仿B.丙酮C.乙醇D.乙醚12. 片剂中含量均匀度检查的目的是A.检查片剂中的单剂含量偏离标示量的程度B.检查片剂中杂质的含量C.检查片剂中主药含量是否均匀D.检查片剂的主药溶出情况13. 测定硫酸亚铁片的含量时，为防强氧化剂滴定时带来误差，常用下列哪种方法进行测定A.高锰酸钾法B.碘量法C.重铬酸钾法D.硫酸铈法14. 下列关于中药制剂含量测定项目的选定原则的说法，哪一个是不正确的：A.单方制剂所含成分类别必须基本清楚B.毒剧药及贵重药若不是君药或臣药，可不建立含量测定项C.所测成分应归属于某一单一药味D.含量过低的成分一般不宜选做含量测定的指标15. 中药制剂分析的一般程序为A.取样→鉴别→检查→含量测定→写出检验报告B.检查→取样→鉴别→含量测定→写出检验报告C.鉴别→检查→取样→含量测定→写出检验报告D.检查→取样→含量测定→鉴别→写出检验报告16. 下列关于中药制剂特点的说法，不正确的是：A.有效成分难以确定；B.化学成分单一，结构简单；C.是严格按照中医理论和用药原则组方的；D.各种成分的含量高低不一17. 为了保证药品的质量，必须对药品进行严格的检验，检验工作应遵循A.药物分析B.国家药典C.物理化学手册D.地方标准18. 中国药典中对于原料药含量限度的规定中，不订上限指标的，均指A.上限不超过100.0%B.下限不少于98.5%C.上限不超过101.0%D.下限不少于99.0%19. 药品的质量标准是下列部门（方面）共同遵循的法定依据：A.生产和经营B.生产、经营和使用C.生产、经营、使用和行政监督管理D.生产、经营、使用和行政、技术监督管理20. 质量标准中[鉴别]试验的作用是：A.考察药物的纯杂程度B.评价药物的药效C.评价药物的安全性D.确认药物与标签相符21. 原料药（西药）的含量测定首选的分析方法是A.容量法B.色谱法C.分光光度法D.重量分析法22. 下列不属于物理常数的有：A.熔点B.沸点C.呈色反应D.比旋度二、多选题（X型题-多选题）（本大题共19小题，共38分）1. 原始记录：A.只能划改B.被划改数据仍能辨认C.改正的数据写在划改数据的上方D.不得就字涂改E.在划改处不必签字或盖检测人印章2. 对照品是A、色谱中应用的内标物B、由国务院药品监督部门指定的单位制备、标定和供应C、按效价单位（或μg）计D、按干燥品（或无水物）进行计算后使用E、制剂的原料药物3. 药物的稳定性考察包括A、强光照射试验B、高温试验C、高压试验D、高湿度试验E、长期留样考察4. 药典正文中所收载的药品或制剂的质量标准的内容包括A.性状B.检查C.鉴别D.含量测定E.类别5. 药物制剂的检查中A.杂质检查项目应与原料药的检查项目相同B.杂质检查项目应与辅料的检查项目相同C.杂质检查主要是检查制剂生产、贮存过程中引入或产生的杂质D.不再进行杂质检查E.除杂质检查外还应进行制剂学方面的有关检查6. 需作含量均匀度检查的药品有A、主药单剂含量在10mg以下的片剂或胶囊剂B、主药单剂含量在2mg以下的其他制剂C、溶解性能差，或体内吸收不良的口服固体制剂D、主药含量小于每片重量5%的片剂E、主药含量小于5mg的注射剂和糖浆剂7. 片剂的标示量即A、百分含量B、相对百分含量C、规格量D、每片平均含量E、生产时的处方量8. 单剂量固体制剂检查溶出度是保证：A.制剂的药效B.制剂含药量的均匀性C.制剂含药量与标示量的符合程度D.制剂中药物的释放程度E.制剂中药物能被利用的程度9. 制剂检验中片剂按规定常作A.鉴别试验B.片剂通则规定的检验项目C.主药的含量测定D.热原检查E.性状检验10. 对中药制剂取样的要求为：A.要有科学性B.要有真实性C.要有代表性D.应均匀合理E.要有针对性11. 中药制剂的鉴别方法有A、显微鉴别B、薄层色谱C、化学鉴别D、指纹图谱E、红外图谱12. 中药制剂定性鉴别方法一般包括：A.性状鉴别B.显微鉴别C.微生物法D.电泳法E.物理化学方法13. 中药制剂的薄层色谱鉴别，常采用什么对照品？A、标准制剂B、药材对照品C、样品稀释液D、有效成分对照品E、对照R f值14. 下列关于中药制剂特点的说法，正确的是：A.有效成分难以确定B.化学成分单一，结构简单C.是严格按照中医理论和用药原则组方的D.各种成分的含量高低不一E.中药材中有效成分与无效成分的概念是相对的15. 被国家药典收载的药品必须是A、价格合理B、疗效确切C、生产稳定D、有合理的质量标准E、服用方便16. 在制订药品质量标准的原则中，叙述正确的有：A.同一品种原则上只能制订一个国家标准B.两个以上研制单位先后申报同一新药，若后申报的药品标准比已申报的药品标准先进，则按后申报的药品标准修订C.外用药、内服药及麻醉用药的制订标准一样D.两个以上研制单位在同一时期内申报同一新药，对不同的药品标准要求可不统一E.从健康需要出发，坚持质量第一的观点17. 我国药典对"熔点"测定规定如下A、记录初熔至全熔时温度B、"初熔"系指出现明显液滴时温度C、测定熔融分解的样品时，升温速度较一般测定慢D、测定熔点可考察药物的纯度E、测定熔点只有毛细管法18. 下列关于药品质量标准的说法，正确的有：A.制订药品质量标准，必须坚持质量第一，充分体现"安全有效、技术先进、经济合理"的原则B.药品质量标准应该反映药品的理化性质的研究、药理毒理的研究、制剂的研究等几个方面的研究结果C.药品质量标准的内容一经确认，便不能改变D.在制订药品标准时，要考虑药品的生理效用和临床应用的方法，不同制剂，要求应不同E.所选方法应具有适用性和先进性19. 原料药的纯度由以下指标说明：A.杂质含量B.光谱特征C.理化常数D.性状E.含量三、判断题（本大题共20小题，共20分）1. 药典凡例中的有关规定具有法定约束力。

试诉新药临床前安全性评价的内容

1.试诉新药临床前安全性评价的内容。

答:新药临床前安全性评价的内容分为两大类，一是一般毒性试验,二是特殊毒性试验。

所谓特殊毒性试验，是指以观察和测定新药能否会引起某种或某些特定的毒性反应为目的而设计的毒性试验，即此类毒件试验观测的毒性指标是明确的。

广义的特殊毒性试验包含的面比较广。

如遗传毒性试验、生殖毒性试验、依赖性毒性试验、过敏性试验、局部刺激性试验、免疫毒性试验、眼毒试验、耳毒试验及致癌试验等，而狭义的特殊毒性主要是指遗传毒性、生殖毒性和致癌性,即-般常说的“三致”试验。

所谓一般毒性试验，是指那些不以观察和测定某种特定的毒性反应为目的而设计的毒性试验,这意味着观测的毒性指标具有广谱性和不确定性的特点、包括生理学、血液学、血液生化及病理形态学等多方面的综合性指标。

如用不同种属的动物及不同给药途径进行的急性毒性试验、反复多次给药的长期毒性试验。

一般药理学试验,是观察新药在一定的剂量条件下，除了主要药效学以外的对机体各系统的影响，国外称为安全性药理试验，理所当然的属于安全性研究的内容，我们国家的新药审评办法，对一般药理试验的要求比较简单，仅要求观察药物对神经、心血管及呼吸系统的影响，而且各系统的试验观察指标也很有限。

另外，除了一般常用的口服、肌内注射、皮下注射、静脉注射途径外,新开发的结药途径及其剂型,其安全性试验的内容，陈了一般性的要求外,尚应根据其具体特点设计能说明问题的毒性试验。

2、试述新药安全性评价的局限性。

答：临床前毒理学评价的基本手段是动物试验，动物实验的第一个局限是而动物由于缺乏第二信号系统,不能象人一样能述说主观感觉性质的毒性反应，如疼痛、腹胀、视物不清、头晕、头昏、耳鸣、疲乏等，这些反应在动物上是难于发现或者是不可能发现的。

另外,由于生物进化上的差异,致使有的反应只出现于人．有的则只出现于动物.人和动物共同都出现的反应仅占一部分。

动物实验的第二个局限是实验动物的数量有限,那些发生率很低的毒性反应，在少量的动物中难以发现。

农用微生物菌剂[GB20287_2006]

农用微生物菌剂（GB 20287-2006）前言本标准的5.1、5.3和第8章条文为强制性条款，其余为推荐性条款。

本标准的附录A、附录C和附录D为规范性附录，附录B为资料性附录。

本标准适用于农用微生物菌剂类产品。

5 要求5.1 菌种生产用的微生物菌种应安全、有效。

生产者应提供菌种的分类鉴定报告，包括属及种的学名、形态、生理生化特性及鉴定依据等完整资料。

生产者应提供菌种安全性评价资料。

采用生物工程菌，应具有允许大面积释放的生物安全性有关批文。

5.2 产品外观（略）5.3 产品技术指标5.3.1 农用微生物菌剂产品的技术指标见表1，其中有机物料腐熟剂产品的技术指标按表2执行。

表1 农用微生物菌剂产品的技术指标表2 有机物料腐熟剂产品的技术指标5.3.2 农用微生物菌剂产品中无害化指标见表3。

6.3.2 有效活菌数的测定采用平板计数法，根据所测微生物的种类选用适宜的培养基。

若采用最大可能数（Most Probable Number，MPN）5管法，遵照附录C的规定。

UPLC-MS

基因毒性杂质研究专栏㊀基金项目:中国食品药品检定研究院关键技术研究基金(Ｎｏ.ＧＪＪＳ－２０２２－４－２)ꎻ＃同为第一作者ꎬ∗同为通信作者作者简介:袁松ꎬ男ꎬ硕士ꎬ助理研究员ꎬ研究方向:化学药品质量控制ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｙｕａｎｓｏｎｇ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎꎻ李婕ꎬ女ꎬ硕士ꎬ副主任药师ꎬ研究方向:化学药品质量控制ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｌｉｊｉｅ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎ通信作者:刘阳ꎬ男ꎬ博士ꎬ研究员ꎬ研究方向:药品质量安全ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１５７１ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｙａｎｇｌｉｕ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎꎻ张庆生ꎬ男ꎬ硕士ꎬ主任药师ꎬ研究方向:药品质量安全ꎬＴｅｌ:０１０－５３８５１３７５ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｚｑｓ＠ｎｉｆｄｃ.ｏｒｇ.ｃｎＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法测定磷酸西格列汀中基因毒性杂质ＮＴＴＰ袁松＃ꎬ李婕＃ꎬ张娜ꎬ张龙浩ꎬ刘阳∗ꎬ张庆生∗(中国食品药品检定研究院ꎬ国家药品监督管理局化学药品质量研究与评价重点实验室ꎬ北京１０２６２９)摘要:目的㊀建立磷酸西格列汀原料药及制剂中基因毒性杂质Ｎｉｔｒｏｓｏ－ＳＴＧ－１９(ＮＴＴＰ)的超高效液相色谱－串联质谱(ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ)检测方法ꎮ方法㊀色谱柱为ＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ＲＲＨＤ(３.０ｍｍˑ１５０ｍｍꎬ１.８μｍ)ꎬ以含０.１％甲酸的水溶液为流动相Ａꎬ０.１％甲酸的乙腈溶液为流动相Ｂꎬ梯度洗脱ꎬ流速为０.３５ｍＬｍｉｎ－１ꎬ柱温为３０ħꎬ进样器温度为１０ħꎬ进样体积为５μＬꎮ采用多反应监测(ＭＲＭ)模式ꎬ对磷酸西格列汀原料药及制剂中的ＮＴＴＰ进行定量检测ꎮ结果㊀ＮＴＴＰ在０.５４~５３.９３ｎｇｍＬ－１范围内具有良好的线性关系ꎮ检测限和定量限分别为０.０２ｎｇｍＬ－１和０.０８ｎｇｍＬ－１ꎮ原料药及制剂在低㊁中㊁高３个浓度的平均加样回收率范围(ｎ＝３)分别为１０５.４３％~１０７.２１％(ＲＳＤɤ３.２％)及１１５.０３％~１２０.２０％(ＲＳＤɤ３.６％)ꎮ应用该方法对１２批原料药及３批制剂中的ＮＴＴＰ进行检测ꎬ结果显示均有检出ꎮ结论㊀该方法灵敏度高㊁专属性强ꎬ可用于测定磷酸西格列汀原料药及制剂中的ＮＴＴＰꎬ可为磷酸西格列汀原料药及制剂的质量控制提供参考ꎮ关键词:磷酸西格列汀ꎻ基因毒性杂质ꎻＮｉｔｒｏｓｏ－ＳＴＧ－１９ꎻ含量测定ꎻ超高效液相色谱－串联质谱中图分类号:Ｒ９２７.１㊀文献标志码:Ａ㊀文章编号:２０９５－５３７５(２０２３)１２－１０００－００５ｄｏｉ:１０.１３５０６/ｊ.ｃｎｋｉ.ｊｐｒ.２０２３.１２.００９ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｙＮＴＴＰｉｎＳｉｔａｇｌｉｐｔｉｎＰｈｏｓｐｈａｔｅｂｙＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳＹＵＡＮＳｏｎｇ＃ꎬＬＩＪｉｅ＃ꎬＺＨＡＮＧＮａꎬＺＨＡＮＧＬｏｎｇｈａｏꎬＬＩＵＹａｎｇ∗ꎬＺＨＡＮＧＱｉｎｇｓｈｅｎｇ∗(ＮＭＰＡＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｆｏｒＱｕａｌｉｔｙＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＥｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＤｒｕｇｓꎬＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｆｏｒＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＣｏｎｔｒｏｌꎬＢｅｉｊｉｎｇ１０２６２９ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ㊀ＴｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｎＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳｍｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｙＮｉｔｒｏｓｏ－ＳＴＧ－１９(ＮＴＴＰ)ｉｎＳｉｔａｇｌｉｐｔｉｎＰｈｏｓｐｈａｔｅ.Ｍｅｔｈｏｄｓ㊀ＴｈｅｓｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＮＴＴＰｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ＲＲＨＤ(３.０ｍｍˑ１５０ｍｍꎬ１.８μｍ)ｗｉｔｈｔｈｅｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ０.１％ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄａｑｕｅｏｕｓｓｏｌｕｔｉｏｎ(ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＡ)ａｎｄ０.１％ｆｏｒｍｉｃａｃｉｄｍｅｔｈａｎｏｌｓｏｌｕｔｉｏｎ(ｍｏｂｉｌｅｐｈａｓｅＢ)ｕｎｄｅｒａｇｒａｄｉｅｎｔｅｌｕｔｉｏｎａｔａｆｌｏｗｒａｔｅｏｆ０.３５ｍＬｍｉｎ－１ａｎｄａｃｏｌｕｍｎｔｅｍ￣ｐｅｒａｔｕｒｅｏｆ３０ħ.Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ(ＭＲＭ)ｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｏｎａｔｒｉｐｌｅｑｕａｄｒｕｐｏｌｅｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒｉｎｐｏｓｉｔｉｖｅｍｏｄｅ.Ｒｅｓｕｌｔｓ㊀Ｔｈｅｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎｃｕｒｖｅｓｗａｓｉｎｇｏｏｄｌｉｎｅａｒｉｔｙｉｎｔｈｅｒａｎｇｅｏｆ０.５４~５３.９３ｎｇｍＬ－１.Ｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｄｅｔｅｃｔｉｏｎｗａｓ０.０２ｎｇｍＬ－１ꎬａｎｄｔｈｅｌｉｍｉｔｏｆｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｗａｓ０.０８ｎｇｍＬ－１.Ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓ(ｎ＝３)ｏｆａｃｔｉｖｅｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ(ＡＰＩ)ａｎｄｔａｂｌｅｔｓａｔｌｏｗꎬｍｉｄｄｌｅꎬａｎｄｈｉｇｈｓｐｉｋｅｄｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅ１０５.４３％~１０７.２１％(ＲＳＤɤ３.２％)ａｎｄ１１５.０３％~１２０.２０％(ＲＳＤɤ３.６％)ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.ＵｓｉｎｇｔｈｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄｍｅｔｈｏｄꎬｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄＮＴＴＰｉｎ１２ｂａｔｃｈｅｓｏｆＡＰＩａｎｄ３ｂａｔｃｈｅｓｏｆｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔＮＴＴＰｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎａｌｌｂａｔｃｈｅｓ.Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ㊀ＴｈｅｍｅｔｈｏｄｗａｓｓｅｎｓｉｔｉｖｅａｎｄａｃｃｕｒａｔｅꎬｗｈｉｃｈｃａｎｂｅａｐｐｌｉｅｄｆｏｒｔｈｅｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｓｏｆＮＴＴＰｉｎＳｉｔａｇｌｉｐｔｉｎＰｈｏｓｐｈａｔｅꎬｐｒｏｖｉｄｉｎｇｒｅｆｅｒｅｎｃｅｆｏｒｑｕａｌｉｔｙｃｏｎｔｒｏｌｏｆＳｉｔａ￣ｇｌｉｐｔｉｎＰｈｏｓｐｈａｔｅ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ＳｉｔａｇｌｉｐｔｉｎＰｈｏｓｐｈａｔｅꎻＧｅｎｏｔｏｘｉｃｉｍｐｕｒｉｔｙꎻＮＴＴＰꎻＣｏｎｔｅｎｔｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎꎻＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ㊀㊀Ｎ－亚硝胺类化合物(Ｎ－ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓꎬＮＡｓ)是一类结构通式为Ｒ１(Ｒ２)Ｎ－Ｎ＝Ｏ的化合物ꎬ其中Ｒ１和Ｒ２为烷基或芳烃ꎬ国际癌症研究机构于１９８７年将ＮＡｓ列入致癌物清单ꎮ２０１７年世界卫生组织发布的致癌清单中ꎬ有近１６个短脂肪链的Ｎ－亚硝胺类化合物被列为２类致癌物质[１]ꎮＮＡｓ常常存在于食品㊁饮用水㊁烟草㊁化妆品等物质中[２－５]ꎬ人们长期接触含ＮＡｓ的这些物质会产生潜在危害ꎮ自２０１８年欧洲药品管理局(ＥｕｒｏｐｅａｎＭｅｄｉｃｉｎｅｓＡｇｅｎｃｙꎬＥＭＡ)宣布在缬沙坦原料和制剂中检测出Ｎ－亚硝基二甲胺(ＮＤＭＡ)后ꎬ各国药品监管机构纷纷加强对药品中ＮＡｓ的监测ꎬ并对多批含有ＮＤＭＡ或其他亚硝胺类杂质的沙坦类药物进行召回ꎬ并要求对产品中ＮＡｓ存在进行风险评估及建立合适的控制策略[６－９]ꎮ西格列汀(结构式见图１)是一种二肽基肽酶－４(ＤＰＰ－４)抑制剂ꎬ可以刺激胰高血糖素的释放并减少胰岛素的分泌ꎬ从而发挥降糖作用ꎬ是一种常见的降糖药ꎬ可与其他药联合用药来治疗包括超重肥胖㊁胰岛素治疗不佳㊁肥胖型２型糖尿病等疾病ꎬ治疗效果良好[１０－１２]ꎮ２０２２年报道表明西格列汀合成中间体三氟甲基－５ꎬ６ꎬ７ꎬ８－四氢－１ꎬ２ꎬ４－三唑并－[４ꎬ３－α]－吡嗪盐酸盐(ＴＴＰ)[１３]可能与亚硝酸盐反应生成Ｎｉｔｒｏｓｏ－ＳＴＧ－１９(ＮＴＴＰꎬ见图１)ꎮＮＴＴＰ是新发现的一种存在于西格列汀中的基因毒性杂质ꎬ可能是以ＴＴＰ为原料合成西格列汀时产生或是最终产品中残留的ＴＴＰ与辅料中微量的亚硝酸盐反应生成ＮＴＴＰꎮＥＭＡ和美国食品药品监督管理局(ＦＤＡ)最初都将其最大摄入量设定为３７ｎｇｄ－１ꎬ但ＦＤＡ为了避免西格列汀产品的短缺ꎬ将最大摄入量调整为２４６.７ｎｇｄ－１ꎬ暂未召回该产品[１４－１５]ꎮ目前国内外尚无对西格列汀中的ＮＴＴＰ检测方法的报道ꎬ本文建立了一个超高效液相色谱－串联质谱(ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ)检测西格列汀中ＮＴＴＰ的方法ꎬ为西格列汀相关原料药与制剂的药品质量控制和监管提供参考ꎮ图１㊀西格列汀㊁ＴＴＰ和ＮＴＴＰ的结构式１㊀材料１.１㊀仪器㊀高效液相色谱－串联三重四极杆质谱仪(美国Ｗａｔｅｒｓ公司)ꎬ配备电喷雾离子源(ＥＳＩ)和ＭａｓｓＬｙｎｘＶ４.２数据处理系统ꎻＸＰ２０５ＤＲ型电子分析天平(瑞士Ｍｅｔｔｌｅｒ公司)ꎻＭｉｌｌｉ－Ｑ超纯水纯化系统(美国Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ公司)ꎮ１.２㊀药物与试剂㊀乙腈㊁甲酸㊁甲酸铵(质谱级ꎬ美国ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)ꎬ水为超纯水ꎬ对照品ＮＴＴＰ来自本实验室合成ꎬ采用高分辨质谱(见图２Ａ)和核磁(见图２Ｂ㊁Ｃ)对其结构进行了确证ꎮ２㊀方法与结果２.１㊀溶液的制备２.１.１㊀标准曲线溶液的制备㊀取ＮＴＴＰ对照品约１０ｍｇꎬ精密称定ꎬ置１００ｍＬ量瓶中ꎬ加水使溶解并稀释至刻度ꎬ作为对照品储备液ꎻ精密量取对照品储备液适量ꎬ以水为稀释剂逐级定量稀释制成每１ｍＬ中含ＮＴＴＰ０.５４㊁１.０８㊁４.３１㊁１０.７９㊁２６.９７㊁５３.９３ｎｇ的溶液ꎬ作为系列线性溶液ꎮ２.１.２㊀供试品溶液的制备㊀取磷酸西格列汀原料药约１００ｍｇꎬ精密称定ꎬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ加水适量ꎬ超声使溶解ꎬ用水稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为原料药的供试品溶液ꎮ取磷酸西格列汀片１０片ꎬ精密称定ꎬ研细ꎬ混匀ꎬ精密称取约相当于磷酸西格列汀１００ｍｇ的细粉ꎬ置１５ｍＬ离心管中ꎬ精密加入水１０ｍＬꎬ超声并振摇１０ｍｉｎꎬ滤过ꎬ取续滤液作为片剂的供试品溶液ꎮ２.２㊀色谱及质谱条件２.２.１㊀色谱条件㊀采用ＡｇｉｌｅｎｔＥｃｌｉｐｓｅＰｌｕｓＣ１８ＲＲＨＤ(３.０ｍｍˑ１５０ｍｍꎬ１.８μｍ)色谱柱ꎬ以含０.１％甲酸的水溶液为流动相Ａꎬ０.１％甲酸的乙腈溶液为流动相Ｂꎬ梯度洗脱:０~８.０ｍｉｎꎬ４０％Ｂң１００％Ｂꎻ８.０~８.１ｍｉｎꎬ１００％Ｂң４０％Ｂꎻ８.１~１２.０ｍｉｎꎬ４０％Ｂꎻ流速为０.３５ｍＬｍｉｎ－１ꎬ柱温为３０ħꎬ进样器温度为１０ħꎬ进样体积为５μＬꎮ２.２.２㊀质谱条件㊀采用电喷雾离子源(ＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙＩｏｎｉｚａｔｉｏｎＳｏｕｒｃｅꎬＥＳＩ)ꎬ正离子检测模式ꎬ毛细管电压为４.０ｋＶꎬ脱溶剂气温度为５００ħꎬ脱溶剂气流量为１０００Ｌｈ－１ꎬ锥孔气流量为１５０Ｌｈ－１ꎬ离子源温度为１５０ħꎮ监测模式为多反应监测(Ｍｕｌｔｉｐｌｅｒｅ￣ａｃｔｉｏｎｍｏｎｉｔｏｒꎬＭＲＭ)ꎬ以ｍ/ｚ２２１.８３ң１９１.９５作为定量离子对ꎬ锥孔电压为１０Ｖꎬ碰撞能量为１０Ｖꎬ以离子对ｍ/ｚ２２１.８３ң１６４.７１作为定性离子对ꎬ锥孔电压为１０Ｖꎬ碰撞能量为２０Ｖꎮ采集时间为２.３~８.０ｍｉｎꎮ２.３㊀方法学考察２.３.１㊀专属性试验㊀取水作为空白溶剂和２.１.１项下约４ｎｇｍＬ－１的对照品溶液分别进样ꎬ记录色谱图ꎬ在所建立的色谱和质谱条件下ꎬＮＴＴＰ的保留时间为２.６２ｍｉｎ(见图３Ａ)ꎬ峰型良好ꎬ空白溶剂对检测无干扰ꎮ图２㊀结构确证－高分辨质谱图(ＡꎬＨ－ＥＳＩ＋)㊁核磁共振氢谱图(Ｂ)和碳谱图(Ｃ)２.３.２㊀系统精密度㊀取２.１.１项下约４ｎｇｍＬ－１的线性溶液连续进样６次ꎬ得ＮＴＴＰ峰面积的ＲＳＤ为１.１３％ꎬ结果表明系统精密度良好ꎮ２.３.３㊀重复性㊀２.３.３.１㊀原料药重复性㊀取磷酸西格列汀原料药(批号:ＳＧＺ１０４０００６)ꎬ按２.１.２项下方法平行制备６份原料药供试品溶液ꎬ进样检测ꎬ按标准曲线法计算ＮＴＴＰ含量ꎬ计算得６份原料药供试品溶液中ＮＴＴＰ含量的ＲＳＤ为７.２％ꎮ结果表明方法对原料药测定具有良好的重复性ꎮ２.３.３.２㊀片剂重复性㊀取磷酸西格列汀片ꎬ按２.１.２项下方法平行制备６份片剂供试品溶液ꎬ进样检测ꎬ按标准曲线法计算ＮＴＴＰ含量ꎬ计算得６份片剂供试品溶液中ＮＴＴＰ含量的ＲＳＤ为３.３％ꎬ结果表明方法对片剂测定具有良好的重复性ꎮ２.３.４㊀线性㊀分别取２.１.１项下系列线性溶液ꎬ进样检测ꎬ记录色谱图ꎮ以质量浓度为横坐标(Ｘ)ꎬＮＴＴＰ峰面积为纵坐标(Ｙ)进行线性回归ꎬ在０.５４~５３.９３ｎｇｍＬ－１浓度范围内线性结果为Ｙ＝５１００.８４Ｘ＋５３９.７９(ｒ＝１.００００)ꎮ结果显示ＮＴＴＰ在其线性范围内峰面积与进样浓度之间呈良好的线性关系ꎮ２.３.５㊀回收率试验２.３.５.１㊀原料药回收率试验㊀取磷酸西格列汀原料药(批号:ＧＺ１０４０００６)约１００ｍｇꎬ精密称定ꎬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ分别用２.１.１项下２５ｎｇｍＬ－１(高浓度)㊁１０ｎｇｍＬ－１(中浓度)㊁４ｎｇｍＬ－１(低浓度)的线性溶液溶解并稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ作为原料药回收率溶液ꎬ每个浓度点平行制备３份ꎬ进样检测ꎬ结果见表１ꎬ低㊁中㊁高浓度点的回收率分别为１０７.２１％(ＲＳＤ２.９％ꎬｎ＝３)㊁１０５.９５％(ＲＳＤ２.５％ꎬｎ＝３)㊁１０５.４３％(ＲＳＤ３.２％ꎬｎ＝３)ꎬ结果表明原料药回收率良好ꎮ２.３.５.２㊀片剂回收率试验㊀取磷酸西格列汀片(批号:２００５１５ＪＡ)ꎬ精密称定ꎬ研细ꎬ混匀ꎬ精密称取细粉适量(约相当于西格列汀１００ｍｇ)ꎬ置１０ｍＬ量瓶中ꎬ分别用２.１.１项下２５ｎｇｍＬ－１(高浓度)㊁１０ｎｇｍＬ－１(中浓度)㊁４ｎｇｍＬ－１(低浓度)的线性溶液溶解并稀释至刻度ꎬ摇匀ꎬ滤过ꎬ取续滤液作为片剂回收率溶液ꎬ每个浓度点平行制备３份ꎬ进样检测ꎬＡ.空白溶剂ꎻＢ.对照品溶液ꎻＣ.片剂供试品溶液图３㊀空白溶剂㊁对照品溶液和片剂供试品溶液提取的离子流色谱图结果见表３ꎬ低㊁中㊁高浓度点的回收率分别为１１５.０３％(ＲＳＤ２.１％ꎬｎ＝３)㊁１１５.９５％(ＲＳＤ３.６％ꎬｎ＝３)㊁１２０.２０％(ＲＳＤ１.４％ꎬｎ＝３)ꎬ结果表明片剂回收率在可接受范围内ꎮ表１㊀原料药加样回收率结果编号加入量/ｎｇ检测量/ｎｇ本底/ｎｇ回收率(％)平均回收率(％)ＲＳＤ(％)１４３.１５４８.７２２.８０１０６.４２２４３.１５４７.９７２.８４１０４.５９１０７.２１２.９３４３.１５５０.６３２.９０１１０.６１４１０７.８７１１７.３１２.９６１０６.０１５１０７.８７１１９.９９２.８５１０８.５９１０５.９５２.５６１０７.８７１１４.１８２.８２１０３.２４７２６９.６６２９７.６４２.８４１０９.３２８２６９.６６２８２.８５２.８３１０３.８４１０５.４３３.２９２６９.６６２８１.０９３.０１１０３.１２２.３.６㊀检测限与定量限㊀取２.１.１项下约０.５ｎｇｍＬ－１的线性溶液ꎬ以水为稀释剂逐步稀释ꎬ分别在信噪比为３ʒ１和１０ʒ１时作为检测限和定量限ꎬ测得ＮＴＴＰ的检测限和定量限分别为０.０２ｎｇｍＬ－１和０.０８ｎｇｍＬ－１ꎮ２.３.７㊀提取效率考察㊀取磷酸西格列汀原料药(批号:ＳＧＺ１０４０００６)和磷酸西格列汀片(批号:Ｔ０２４４４７)ꎬ分别按２.１.２项平行制备２份溶液ꎬ分别超声并振摇１０㊁２０ｍｉｎꎬ进样检测ꎬ按标准曲线法计算ＮＴＴＰ含量ꎬ计算得原料药２份供试品溶液中ＮＴＴＰ含量相对标对偏差为３.３２％ꎬ片剂２份供试品溶液中ＮＴＴＰ含量相对标对偏差为２.０２％ꎬ结果表明超声并振摇１０ｍｉｎ可提取完全ꎮ表２㊀片剂加样回收率结果编号加入量/ｎｇ检测量/ｎｇ本底/ｎｇ回收率(％)平均回收率(％)ＲＳＤ(％)１４３.１５５０.５８０１１７.２２２４３.１５４９.８４０１１５.５０１１５.０３２.１３４３.１５４８.４９０１１２.３８４１０７.８７１２８.８９０１１９.４９５１０７.８７１２０.１８０１１１.４１１１５.９５３.６６１０７.８７１２６.１５０１１６.９５７２６９.６６３２８.６４０１２１.８７８２６９.６６３２４.３５０１２０.２８１２０.２０１.４９２６９.６６３１９.３９０１１８.４４２.３.８㊀溶液稳定性㊀取２.１.１项下约１ｎｇｍＬ－１的对照品溶液ꎬ放置于进样盘ꎬ间隔６ｈ进样检测ꎮ０ｈ和６ｈ时ＮＴＴＰ峰面积的相对偏差为２.７７％ꎬ结果表明对照品溶液１０ħ时６ｈ内稳定ꎮ２.４㊀样品测定㊀按２.１项下制备磷酸西格列汀供试品溶液ꎬ照２.２项下条件进样检测ꎬ记录色谱图(典型图谱见图２Ｂ㊁Ｃ)ꎬ以峰面积按标准曲线法计算供试品溶液中ＮＴＴＰ的含量ꎮ４家原料厂家的１２批样品中检出ＮＴＴＰ含量为０.０１４~０.２０μｇｇ－１ꎻ有３批磷酸西格列汀片中检测出ＮＴＴＰꎬ含量为１.２６~１.４１μｇｇ－１ꎮ３㊀讨论ＮＴＴＰ在水中易溶ꎬ以水为溶剂配制浓度约为１μｇｍＬ－１的对照品溶液ꎬ分别采用ＥＳＩ离子源和ＡＰＣＩ离子源下针泵进样对ＮＴＴＰ的响应及定量/定性离子进行考察ꎬ结果表明ＮＴＴＰ在ＥＳＩ离子源正离子采集模式下响应更好ꎬ继续对ＥＳＩ＋条件进行优化ꎬ最终确定ＮＴＴＰ定量离子对为ｍ/ｚ２２１.８３ң１９１.９５ꎬ锥孔电压为１０Ｖꎬ碰撞能量为１０ｅＶꎬ定性离子对为ｍ/ｚ２２１.８３ң１６４.７１作为ꎬ锥孔电压为１０Ｖꎬ碰撞能量为２０ｅＶꎮ以水为溶剂配制含磷酸西格列汀和ＮＴＴＰ浓度均约为１００μｇｍＬ－１的混合溶液ꎬ采用紫外检测器对ＮＴＴＰ峰与西格列汀峰之间的分离情况进行了考察ꎬ分别试验了甲醇－水㊁乙腈－水系统ꎬ试验证明当流动相为乙腈－水时ＮＴＴＰ和西格列汀出峰较快ꎬ且可完全分离ꎬ水中加入甲酸铵后ＮＴＴＰ的质谱响应降低明显且峰型变差ꎬ加入甲酸可以增强离子化效率提高质谱响应ꎮ最终以含０.１％甲酸的水溶液为流动相Ａꎬ０.１％甲酸的乙腈溶液为流动相Ｂꎬ并进行梯度洗脱ꎮ在最终确定的色谱条件下ꎬ磷酸西格列汀在２.２ｍｉｎ即可洗脱完全ꎬ质谱采集时间设定为２.３~８.０ｍｉｎꎬ高浓度的磷酸西格列汀经液相洗脱后直接从废液排出ꎬ以避免对质谱的污染ꎮ磷酸西格列汀片未明确最大单日剂量ꎬ按推荐剂量１００ｍｇｄ－１计ꎻＥＭＡ和ＦＤＡ最初都将ＮＴＴＰ最大摄入量设定为３７ｎｇｄ－１ꎬ但ＦＤＡ为了避免西格列汀产品的短缺ꎬ将ＮＴＴＰ最大摄入量调整为２４６.７ｎｇｄ－１[１５]ꎻ如按３７ｎｇｄ－１计算ꎬ则磷酸西格列汀中ＮＴＴＰ的残留限度为０.３７μｇｇ－１ꎬ所检原料药中ＮＴＴＰ均未超过此限度ꎬ但片剂中ＮＴＴＰ含量已超限度值ꎻ如按２４６.７ｎｇｄ－１计算ꎬ则磷酸西格列汀中ＮＴＴＰ的残留限度为２.４７μｇｇ－１ꎬ原料药和片剂中ＮＴＴＰ均未超出此限度ꎮ片剂中ＮＴＴＰ含量显著高于原料药ꎬ可能是由于终产品中的ＴＴＰ残留继续与极微量的亚硝酸盐继续反应生产ＮＴＴＰꎬ关于ＴＴＰ残留量与ＮＴＴＰ残留量之间的相关性还需进行进一步的研究ꎮ４㊀结论本研究建立了磷酸西格列汀原料药及片剂中ＮＴＴＰ的ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ检测方法ꎬ并进行了相关方法学验证ꎬ结果表明ꎬ所建立的方法具有良好的专属性㊁灵敏度和准确度ꎬ可准确测定磷酸西格列汀原料药及片剂中潜在的ＮＴＴＰ含量ꎬ有助于磷酸西格列汀的市场监管ꎬ保障药品质量安全ꎮ参考文献:[１]㊀袁松ꎬ黄海伟ꎬ于颖洁ꎬ等.ＵＰＬＣ－ＭＳ/ＭＳ法同时测定氯沙坦钾和缬沙坦中７个亚硝胺类基因毒性杂质[Ｊ].药物分析杂志ꎬ２０２１ꎬ４１(７):１２１８－１２２５.[２]ＰＡＲＫＪＥꎬＳＥＯＪＥꎬＬＥＥＪＹꎬｅｔａｌ.ＤｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｓｅｖｅｎＮ－ＮｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓｉｎＦｏｏｄ[Ｊ].ＴｏｘｉｃｏｌＲｅｓꎬ２０１５ꎬ３１(３):２７９－２９８. [３]ＫＲＡＳＮＥＲＳＷꎬＭＩＴＣＨＷＡꎬＭＣＣＵＲＲＹＤＬꎬｅｔａｌ.Ｆｏｒ￣ｍａｔｉｏｎꎬｐｒｅｃｕｒｓｏｒｓꎬｃｏｎｔｒｏｌꎬａｎｄｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅｏｆｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓｉｎｄｒｉｎｋｉｎｇｗａｔｅｒ:ａｒｅｖｉｅｗ[Ｊ].ＷａｔｅｒＲｅｓꎬ２０１３ꎬ４７(１３):４４３３－４４５０.[４]ＥＤＷＡＲＤＳＳＨꎬＨＡＳＳＩＮＫＭＤꎬＴＡＹＬＯＲＫＭꎬｅｔａｌ.Ｔｏ￣ｂａｃｃｏ－ＳｐｅｃｉｆｉｃＮｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓｉｎｔｈｅＴｏｂａｃｃｏａｎｄＭａｉｎ￣ｓｔｒｅａｍＳｍｏｋｅｏｆＣｏｍｍｅｒｃｉａｌＬｉｔｔｌｅＣｉｇａｒｓ[Ｊ].ＣｈｅｍＲｅｓＴｏｘｉｃｏｌꎬ２０２１ꎬ３４(４):１０３４－１０４５.[５]ＡＬＨＯＯＳＨＡＮＩＫ.ＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓｉｎｓｋｉｎｃａｒｅｃｏｓｍｅｔｉｃｓｕｓｉｎｇＣｅ－ＳＢＡ－１５ｂａｓｅｄｓｔｉｒｂａｒ－ｓｕｐｐｏｒｔｅｄｍｉｃｒｏ－ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｃｏｕｐｌｅｄｗｉｔｈｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].ＡｒａｂＪＣｈｅｍꎬ２０２０ꎬ１３(１):２５０８－２５１６.[６]ＭＡＬＩＨＩＦꎬＷＡＮＧＴ.Ａｎｉｍｐｒｏｖｅｄａｎａｌｙｔｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｆｏｒｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｉｎｏｐｈｔｈａｌｍｉｃｓｏｌｕ￣ｔｉｏｎｓｕｓｉｎｇｌｉｑｕｉｄｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｗｉｔｈｔａｎｄｅｍｍａｓｓｓｐｅｃ￣ｔｒｏｍｅｔｒｙ[Ｊ].ＪＣｈｒｏｍａｔｏｇｒＯｐｅｎꎬ２０２２(２):１０００３７. [７]ＦＤＡ.ＵｐｄａｔｅｓｏｎＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＩＩＲｅｃｅｐｔｏｒＢｌｏｃｋｅｒ(ＡＲＢ)ＲｅｃａｌｌｓＩｎｃｌｕｄｉｎｇＶａｌｓａｒｔａｎꎬＬｏｓａｒｔａｎａｎｄＩｒｂｅｓａｒｔａｎ[ＥＢ/ＯＬ].[２０２２－１２－２４].ｈｔｔｐ://ｗｗｗ.ｆｄａ.ｇｏｖ/Ｄｒｕｇｓ/Ｄｒｕｇ￣Ｓａｆｅｔｙ/ｕｃｍ６１３９１６.ｈｔｍ.[８]ＢＨＡＲＡＴＥＳＳ.ＣｒｉｔｉｃａｌＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＤｒｕｇＰｒｏｄｕｃｔＲｅｃａｌｌｓｄｕｅｔｏＮｉｔｒｏｓａｍｉｎｅＩｍｐｕｒｉｔｉｅｓ[Ｊ].ＪＭｅｄＣｈｅｍꎬ２０２１ꎬ６４(６):２９２３－２９３６.[９]ＧＵＮＡＳＥＫＡＲＡＮＰＭꎬＣＨＥＲＴＯＷＧＭꎬＢＨＡＬＬＡＶꎬｅｔａｌ.ＣｕｒｒｅｎｔＳｔａｔｕｓｏｆＡｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎＲｅｃｅｐｔｏｒＢｌｏｃｋｅｒＲｅｃａｌｌｓ[Ｊ].Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎꎬ２０１９ꎬ７４(６):１２７５－１２７８.[１０]ＨＥＲＭＡＮＧＡꎬＳＴＥＶＥＮＳＣꎬＶＡＮＤＹＣＫＫꎬｅｔａｌ.Ｐｈａｒ￣ｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｏｆｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎꎬａｎｉｎ￣ｈｉｂｉｔｏｒｏｆｄｉｐｅｐｔｉｄｙｌｐｅｐｔｉｄａｓｅＩＶꎬｉｎｈｅａｌｔｈｙｓｕｂｊｅｃｔｓ:Ｒｅ￣ｓｕｌｔｓｆｒｏｍｔｗｏｒａｎｄｏｍｉｚｅｄꎬｄｏｕｂｌｅ－ｂｌｉｎｄꎬｐｌａｃｅｂｏ－ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄｓｔｕｄｉｅｓｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅｏｒａｌｄｏｓｅｓ[Ｊ].ＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒꎬ２００５ꎬ７８(６):６７５－６８８.[１１]ＨＥＲＭＡＮＧＡꎬＢＥＲＧＭＡＮＡꎬＬＩＵＦꎬｅｔａｌ.Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉ￣ｎｅｔｉｃｓａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｅｆｆｅｃｔｓｏｆｔｈｅｏｒａｌＤＰＰ－４ｉｎ￣ｈｉｂｉｔｏｒｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎｉｎｍｉｄｄｌｅ－ａｇｅｄｏｂｅｓｅｓｕｂｊｅｃｔｓ[Ｊ].ＪＣｌｉｎＰｈａｒｍａｃｏｌꎬ２００６ꎬ４６(８):８７６－８８６.[１２]ＪＡＮＡＮＩＬꎬＢＡＭＥＨＲＨꎬＴＡＮＨＡＫꎬｅｔａｌ.ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＳｉｔａ￣ｇｌｉｐｔｉｎａｓＭｏｎｏｔｈｅｒａｐｙａｎｄＡｄｄ－ＯｎｔｏＭｅｔｆｏｒｍｉｎｏｎＷｅｉｇｈｔＬｏｓｓａｍｏｎｇＯｖｅｒｗｅｉｇｈｔａｎｄＯｂｅｓｅＰａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＴｙｐｅ２Ｄｉａｂｅｔｅｓ:ＡＳｙｓｔｅｍａｔｉｃＲｅｖｉｅｗａｎｄＭｅｔａ－Ａｎａｌｙｓｉｓ[Ｊ].ＤｒｕｇＲｅｓ(Ｓｔｕｔｔｇ)ꎬ２０２１ꎬ７１(９):４７７－４８８.[１３]ＨＡＮＳＥＮＫＢꎬＨＳＩＡＯＹꎬＸＵＦꎬｅｔａｌ.Ｈｉｇｈｌｙｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｓｙｍｍｅｔｒｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎ[Ｊ].ＪＡｍＣｈｅｍＳｏｃꎬ２００９ꎬ１３１(２５):８５９８－８８０４.[１４]ＥｕｒｏｐｅａｎＭｅｄｉｃｉｎｅｓＡｇｅｎｃｙ.Ｑｕｅｓｔｉｏｎｓａｎｄａｎｓｗｅｒｓｆｏｒｍａｒｋｅｔｉｎｇａｕｔｈｏｒｉｚａｔｉｏｎｈｏｌｄｅｒｓ/ａｐｐｌｉｃａｎｔｓｏｎｔｈｅＣＨＭＰＯｐｉｎｉｏｎｆｏｒｔｈｅＡｒｔｉｃｌｅ５(３)ｏｆＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ(ＥＣ)Ｎｏ７２６/２００４ｒｅｆｅｒｒａｌｏｎｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｉｍｐｕｒｉｔｉｅｓｉｎｈｕｍａｎｍｅｄｉｃｉｎａｌｐｒｏｄｕｃｔｓ[ＥＢ/ＯＬ].[２０２２－１２－２４].ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｅｍａ.ｅｕｒｏｐａ.ｅｕ/ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ/ｒｅｆｅｒｒａｌ/ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｓ－ｅｍｅａ－ｈ－ａ５３－１４９０－ｑｕｅｓｔｉｏｎｓ－ａｎｓｗｅｒｓ－ｍａｒｋｅｔｉｎｇ－ａｕｔｈ￣ｏｒｉｓａｔｉｏｎ－ｈｏｌｄｅｒｓ/ａｐｐｌｉｃａｎｔｓ－ｃｈｍｐ－ｏｐｉｎｉｏｎ－ａｒｔｉｃｌｅ－５３－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ－ｅｃ－ｎｏ－７２６/２００４－ｒｅｆｅｒｒａｌ－ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ－ｉｍｐｕ￣ｒｉｔｉｅｓ－ｈｕｍａｎ－ｍｅｄｉｃｉｎａｌ－ｐｒｏｄｕｃｔｓ＿ｅｎ.ｐｄｆ.[１５]Ｕ.Ｓ.ＦｏｏｄａｎｄＤｒｕｇＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ.ＱＦＤＡｗｏｒｋｓｔｏａｖｏｉｄｓｈｏｒｔａｇｅｏｆｓｉｔａｇｌｉｐｔｉｎｆｏｌｌｏｗｉｎｇｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅｉｍ￣ｐｕｒｉｔｙ[ＥＢ/ＯＬ].[２０２２－１２－２４].ｈｔｔｐｓ://ｗｗｗ.ｆｄａ.ｇｏｖ/ｄｒｕｇｓ/ｄｒｕｇ－ｓａｆｅｔｙ－ａｎｄ－ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ/ｆｄａ－ｗｏｒｋｓ－ａｖｏｉｄ－ｓｈｏｒｔａｇｅ－ｓｉｔａ￣ｇｌｉｐｔｉｎ－ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ－ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ－ｎｉｔｒｏｓａｍｉｎｅ－ｉｍｐｕｒｉｔｙ.(收稿日期:２０２３－０２－２５)。