基因工程知识点

名词说明

1.基因工程：是将目的基因或DNA片段与适合的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因和蛋白质的活性表达，使转基因生物取得新的遗传性状的操作。

2.限制性内切核酸酶：能够识别双链DNA分子中的某一段特定核苷酸序列，并在此切割DNA 双链的内切核酸酶。

3.同切点酶：又称同裂酶，是一类来源于不同微生物、能识别相同DNA序列的限制性内切核酸酶。

4.同尾酶：是一类限制性内切核酸酶，它们来源各异，识别的靶序列也各不相同，但切割后能产生相同的黏性结尾。

5.酶的星号活性（Star activity）：高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等，会使一些核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的酶的星号活性现象。连接酶：是能催化双链DNA片段靠在一路的3’羟基结尾与5’端磷酸基团结尾之间通过形成磷酸二酯键，使两结尾连接的一种核酸酶。

7.载体：在基因克隆中能携带外源基因进入受体细胞复制、整合或表达的工具称为载体。

8.多克隆位点：是包括多种同一个限制性酶切点的一段很短的

9. α互补：为质粒DNA编码β—半乳糖苷酶的α亚基，宿主细胞可编码β亚基尽管宿主和质粒编码的片段各自都没有酶活性，但它们能够融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种互补现象叫α互补。

10.黏粒载体（考斯质粒载体）：是一类人工构建的含有λ-DNAcos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。

11.质粒：是生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳固遗传的一类核酸分子

12.探针：当用一个标记的核酸分子与核酸样品杂交,即可查明该样品中是不是存在与该标记核酸分子具有同源性的核酸分子。那个标记的核酸分子称为探针(probe)，能够是DNA，也能够是RNA，或合成的寡核苷酸.

13、SD序列：是存在于原核生物起始密码子上游7-12个核苷酸内的一种4-7个核苷酸的保守片段，它与16SrRNA3’端反向互补，因此可将mRNA的AUG起始密码子置于核糖体的适当位置以便起始翻译作用。

14、包括体：目的蛋白子啊细胞质的还原性环境中，以不溶性的形式产生并聚集形成蛋白质

聚合物即为包括体。

简答：

1. 阻碍限制性核酸内切酶活性的因素

答：1）DNA的纯度

2）DNA的甲基化程度

3）消化反映的缓冲液系统

4）DNA的分子结构

5）酶的纯度

6）酶切反映的温度

7）酶的星号活性

2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ与klenow片段的比较

答：1）结构上的区别：Klenow片段是完整DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，是用途理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ时，取得的两个片段中分子量较大的一个，具有5'→3'聚合酶活性和3'→5'的外切酶活性，不含5'→3'外切酶活性。

2）功能上的区别：可通过DNA的方式制备。而klenow酶要紧用于缺口平移标记DNA，也用于DNA的缺口补平和延伸。还在顶用于第二条链的合成。

3.载体的大体条件

答：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，能够携带外源基因进入受体细胞；

2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；

3）.具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；

4）.具有较高的外源DNA的载装能力；

5）.具有适合的挑选标记。

4.质粒的大体性质

答：（1）自主复制。质粒DNA上都含有一个复制起始区，操纵着质粒在宿主细胞内的复制，这一复制起始区称为“复制子”。一样一个质粒DNA分子上只含有一个复制子。按复制能力可将质粒分为严紧型和松弛型两类。

（2）不相容性：在没有选择压力的情形下，两种亲缘关系紧密的不同质粒，不能够在同

一寄主细胞系中稳固地共存的现象，又称为不亲和性。如此的两种质粒称为不亲和质粒。

（3）转移性：能在自然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用）的质粒称为接合型质粒；不能在自然条件下独立地发生接合作用的质粒称为非接合型质粒。

（4）编码性状：野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状。

五、Southern杂交（DNA）步骤:

答：①DNA的片段化及其电泳分离；

②凝胶电泳后的变性处置；

③转移并固定到滤膜上；

④杂交；

⑤检测与分析

六、基因组文库与cDNA文库的区别

基因组文库：基因组文库简称基因文库，是将某一生物基因组DNA片段化并全数克隆后取得的重组子群体的总称。

CDNA文库：是将生物特定的组织器官或特定发育时期的全数mRNA反转录成cDNA，并全数克隆成重组子，在该重组子群集中包括了全数表达基因的转录本。

区别：基因组文库包括全数基因，但cDNA文库石油mRNA反转录取得的，，已经去掉基因中的内含子部份

7.比较克隆载体与表达载体的异同

同：1）.具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性)，能够携带外源基因进入受体细胞；

2）能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基因的增殖；

3）.具有多种单一的限制性核酸内切酶识别切割位点；

4）.具有适合的挑选标记。

异：1）表达载体在克隆载体的基础上又增加了基因表达的调控元件：即启动子——核糖体结合位点——克隆位点——转录终止信号（区分二者的标志）

2）克隆载体在菌体中一样是多拷贝的，而表达载体一样是低拷贝的。

八、外源基因在大肠杆菌中的表达形式有哪些？如何纯化？

1）包括体蛋白：纯化步骤：细胞搜集与破碎，洗涤与溶解，变性蛋白质的纯化，重组蛋白质的复性，天然蛋白质的分离。

2）融合蛋白：融合蛋白的提取，重折叠，纯化，天然蛋白的回收和蛋白质的水解爱惜。

3）分泌型蛋白：第一要进行浓缩处置，然后再依照发酵液中的有效成份和杂质之间的理化性质存在的不同来考虑选择适合的纯化方式。如离子互换层析，亲和层析，凝胶过滤等。

4）可溶性表达产物：经细胞破碎后的可溶性离心上清液，可利用若是有可利用的单克隆抗体或相对特异性的亲和配基，，可选用亲和层析分离法。对处于极端等电点的蛋白，采纳离子互换层析分离。

5）周质表达蛋白：大肠杆菌细胞低浓度溶菌酶处置，渗透压裂解法，周质腔分离出目的蛋白。

九、抑制性消减杂交（SSH）的原理和进程

原理：SSH的核心技术是抑制性PCR，它是一种将检测子cDNA单链标准化步骤和消减杂交步骤融为一体的技术。抑制性PCR是利用链内复性优先于链间复性的原理，是非目标序列片段两头的长反向重复序列在复性时产生“锅柄样”结构或“发夹结构”而无法与引物配对，从而选择性地抑制了非目标序列的扩增。

论述题：

一、PCR技术的原理、成份、步骤、应用及引物设计的要求

1）原理:PCR技术是以DNA互补链的聚合反映为基础，通过DNA变性、引物与模板