基因工程复习资料
基因工程复习资料
基因工程复习资料1.基因工程操作的主要对象是2.正丁醇在氯化铯－溴化乙锭连续梯度离心法纯化DNA中的作用3.溴化乙锭是很强的诱变剂，含溴化乙锭的废物可以如何处理后不再有危害性？4.通过凝胶电泳回收的DNA样品，因检测需要而含有的溴化乙锭对后续DNA操作有什么影响？5.在一个DNA分子中，若T所占的摩尔比是28.2%，则C所占的摩尔比为6.有氨基酸对应的密码子有几个？7.终止密码子有哪三个？8.起始密码子是9.高温导致DNA双链解链成单链从面引起变性的原因10.DNA变性的过程与特点？11.几种DNA分子的表示方法12.通常DNA右手双螺旋构象的表示是13.RNA和DNA在碱基组成上的区别14.乙醇在提取DNA过程中的作用？15.复性温度取决于什么条件？16.在何种情况下互补的两条DNA单链会结合成双链17.提取质粒DNA时为了使其与其它染色体DNA分开，细胞裂解液pH值应达到多少？18.碱性SDS法提取质粒DNA的原理与步骤19.碱法提取质粒DNA时，为了去除RNA常采用水解RNA的酶是20.提取大肠杆菌质粒DNA之前要培养菌体，在培养基中加入适量抗菌素的目的是什么？21.限制性内切酶作用的底物是什么？22.限制性核酸内切酶切割哪一类型DNA分子时效率最高23.限制酶的命名原则?24.影响限制性核酸内切酶的催化效率的因素有哪些？25.限制性核酸内切酶切割DNA后在其5’和3’端各自产生什么样的末端？26.大多数限制性核酸内切酶的最适反应温度是27.Ⅱ类限制性核酸内切酶的识别序列特点是什么？28.对一克隆的DNA片段做酶切图谱分析，需要用到哪种酶？29.已知某一内切酶在一个环状 DNA 上有 4个切点，当用此酶切割该环状 DNA ，可以得到的片段数是30.在对目的基因和载体DNA进行同聚物加尾时，需采用哪种酶？31.Pω0 DNA 聚合酶比Taq DNA聚合酶准确是因为它具有什么样的酶活性？32.内切酶产生星号活性的主要原因有哪些？33.限制性核酸内切酶是由细菌产生的. 其生理意义是什么？34.重组DNA技术中实现目的基因与载体DNA拼接的酶是35. E.coli DNA连接酶反应系统中必须的辅助因子是36. E.coli DNA连接酶可以连接哪两种DNA片段？37.T4-DNA 连接酶是通过形成磷酸二酯键将两段 DNA 片段连接在一起，其底物的关键基团是什么？38.TaqDNA聚合酶可以不需要模板，在双链DNA的末端加一个碱基，主要是加39.以mRNA为模板，催化cDNA合成的酶是40.cDNA第一链合成通常所需的引物是41. E.col i连接酶的功能?42.S1核酸酶的功能?43.碱性磷酸酯酶的作用是44.DNA片段5′端脱磷酸化的目的是什么？45.在PCR的引物中，引物的3′端不应有46.进行PCR设计引物时，引物的核苷酸序列必须与模板链的哪一段核苷酸序列互补？47.PCR的原理与反应过程48.PCR 提前进入平台期原因有哪些？49.PCR反应中的复性温度取决于哪些因素？50.如果要扩增10-20kb的DNA片段，需要使用什么类型的PCR？51.琼脂糖凝胶中琼脂糖的浓度取决于c Z′基因在克隆子筛选中的作用53.在显色互补筛选法中，阳性转化子的颜色是54.常用的报告基因有哪些？55.若某质粒带有 lacZ’标记基因，那么与之相匹配的筛选方法是在筛选培养基中加入56.TA质粒克隆载体可以用来直接克隆PCR产物的原理？57.各种克隆载体能克隆外源DNA片段的长度是多少？58.质粒概念及特点描述59.如果要将某植物抗病基因转入十字花科植物中，应选择哪种克隆载体60.质粒克隆载体有哪些？61.基因工程载体应具备哪些主要条件？62.基因治疗的临床实施中，一般多选用的基因载体是63.Cos位点是哪种克隆载体的序列64.λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个天然黏性末端，该末端包含的碱基数是65.酵母人工克隆载体是由哪几个部分组成的？66.应用于克隆和分离单链外源DNA片段的克隆载体是67.pUC18 与 pUC19 的区别是什么？68.串联启动子表达载体的目的是什么？69.穿梭克隆载体的组成与特点70.Ep克隆载体可以酵母作为宿主，这是因为它含有哪个质粒的复制起始位点？71.在构建cDNA基因文库时应选择哪种克隆载体？72.构建基因组文库时，第一步是对基因组DNA进行随机切割，其方法有哪些？73.质粒被选为基因运载体的理由有哪些？74.质粒克隆载体中MCS是指75.pBR322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因，其中四环素抗性基因来自哪种质粒？76.Pribnow框是指序列77.真核生物结构基因的组成？78.原核生物结构基因的组成？79.基因的化学合成步骤80.根据已知基因序列分离目的基因有哪些方法？81.首次完成了重组质粒DNA对大肠杆菌转化的科学家是82.重组DNA分子导入植物细胞的方法有哪些？83.mRNA分子在结构上的显著特征有哪些？84.核酸或蛋白质标记中常用的放射性标记有哪些？85.真核生物受体菌的细胞有哪些?86.转化大肠杆菌的方法有哪些？其中转化效率最高的是哪个？87.大肠杆菌作为受体菌的优缺点各有哪些？88.植物细胞作为受体细胞有哪些优点及缺点？89.酵母作为受体细胞有哪些优点及缺点？90.哪一种金属离子常用于诱导大肠杆菌感受态细胞91.提取大肠杆菌质粒DNA之前要培养菌体，在培养基中加入适量抗菌素的目的是什么？92.mRNA差别显示技术的技术特点及步骤93.在cDNA技术中，所形成的发夹环可用酶切除？94.cDNA-RDA的技术特点及步骤95.DNA接头在基因工程中的主要作用是96.启动子具有哪些特征97.Southern印迹杂交作用的对象是98.Northern印迹杂交作用的对象是99.1976年，美国联邦政府授权国立卫生研究院就制定了世界上第一个实验室基因工程法规是100.法国于1997年就明确要求从美国进口的农产品必须标示GMO或非GMO的区别，这里的GMO指的是101.有利于基因的蛋白质产物分泌的元件是102.融合蛋白的特性103.可用于蛋白质进一步分离纯化的方法有哪些？104.基因芯片中所采用样品的标记方法有哪些？105.基因芯片的应用范围106.原核生物基因SD区是指107.哺乳动物乳腺生物反应器的优缺点各有哪些？108.干扰素的主要生理作用表现有哪些？109.DNA达到50％变性的温度称为。
基因工程复习资料
基因工程复习指导第一章绪论1、基因：就是存在于DNA上承载遗传信息的核苷酸序列，是位于染色体上呈直线排列的遗传物质的最小单位，也是携带遗传信息的结构单位和控制遗传性状的功能单位。
2、基因工程：又称重组DNA技术，分子水平进行遗传操作，将任何生物体（供体）的基因或基因组提出来，或通过人工合成的目的基因，按照先设置好的蓝图，插入质粒或病毒复制子（载体），而形成一杂合分子（DNA重组体），然后将重组体转移到复制子所属的宿主生物体复制，或转移到另一生物体（受体）的细胞内（原核或真核），使之在受体细胞内遗传并使受体细胞获得新的性状。
3、基因工程的三要素：供体、载体、受体4、基因工程的基本流程：（1）DNA的制备包括从供体生物的基因组分离或人工合成，以获得带有目的基因的DNA片段。
（2）在体外通过限制性核酸内切酶分别分离得到的外源DNA和载体分子进行定点切割，使之片段化或线性化（3）在体外将含有外源基因的不同来源的DNA片段通过DNA连接酶到载体分子上，构建重组DNA分子。
（4）将重组DNA分子通过一定的方法引入到受体细胞进行扩增和表达，从培养细胞中获得大量细胞繁殖群体。
（5）筛选和鉴定转化细胞，剔除非必需重组体，获得引入的外源基因稳定高效表达的基因工程菌或细胞，即将所需要的阳性克隆挑选出来。
（6）将选出的细胞克隆的基因进一步分研究，并设法使之实现功能蛋白的表达。
第三章基因工程工具酶1、基因工程中常用的工具酶：限制酶、连接酶、聚合酶、修饰酶2、细菌的限制—修饰系统（简称R—M体系）：细菌中存在位点特异性限制酶和特异性甲基化酶，构成了寄主控制的限制—修饰系统R-M体系说明的问题和作用：R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
3、限制性内切酶的切割方式（识别哪种末端）（1）平齐末端：（切割位点在识别序列中心轴处）（2）5’黏性末端：（DNA片段末端的5’端比3’端长）梅园复印店打印复印只要一毛打好后送货上门。
基因工程复习资料（已修改）
基因工程复习资料（已修改）基因工程复习资料一、基因工程：概念：基因工程是指采用类似于工程设计的方法，根据人们事先设计的蓝图，人为地在体外将外源目的基因插入质粒、病毒或其他载体中，构成遗传物质的新组合即重组载体DNA分子，并将这种含有目的基因的重组载体分子转移到原先没有这类目的基因的受体细胞中去扩增和表达，从而使受体或受体细胞获得新的遗传特性，或形成新的基因产物。
基本流程：（1）目的基因的分离、获取与制备（2）目的基因与载体连接构建成为重组载体分子（3）重组DNA分子导入到受体细胞（4）外源目的基因阳性克隆的鉴定和筛选（5）外源目的基因的表达二、基因工程的发展简史1、基因工程诞生的背景：（1）发现了生物的遗传物质DNA而不是蛋白质。
（2）明确了DNA的双螺旋结构和半保留复制机制。
（3）遗传密码子的破译。
2、技术上的三大发明：（1）利用限制性核酸内切酶和DNA连接酶体外切割和连接DNA 片段。
（2）质粒改造成载体以携带DNA片段克隆。
（3）逆转录酶的使用打开真核生物基因工程的一条道路。
3、基因工程的诞生标志（P4）三、工具酶1、限制性核酸内切酶常见的类型：BamHⅠ、EcoRⅠ、HindⅢ、HindⅡ、PstⅠ、SalⅠ、SamⅠ。
2、DNA连接酶常用的类型：大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。
3、DNA聚合酶类4、碱性磷酸酶5、末端脱氧核苷酸转移酶6、其他工具酶四、限制性核酸内切酶依来源分类1、同位酶：即识别相同的序列但切割位点不一样。
2、同尾酶：即识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。
3、同裂酶：即识别位点和切割位点均相同的酶。
五、影响限制性核酸内切酶酶切的反应条件1、温度：大部分限制性核酸内切酶最适反应温度为37°C，但也有例外，如SamⅠ的反应温度为25°C.降低最适反应温度，会导致只产生切口，而不是切断双链DNA。
2、盐离子浓度：不同的限制性核酸内切酶对盐离子强度有不同的要求，一般按离子浓度不同分为低（0mmol/L）、中（50mmol/L）、高盐（100mmol/L）三类。
基因工程 考试复习资料
基因工程复习资料一．基因工程：在体外对不同生物的遗传物质进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（质粒、病毒、噬菌体DNA）插入微生物、植物、动物细胞内进行无性繁殖、并表达出基因产物。
二．一）1.同裂酶：识别位点的序列相同的限制性内切酶。
同裂酶的类型：1)同序同切酶：识别位点和切点完全相同。
如Hind Ⅲ和Hsu I。
2)同序异切酶：识别位点相同，但切点不同。
如Kpn I 和Acc65 I。
3)同功多位酶：许多识别简并序列的限制酶包含了另一种限制酶的功能。
4）其他：有些限制酶识别的序列交叉。
2 同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。
如BamH I、Bgl Ⅱ、Bcl I、Xho Ⅱ等。
同尾酶的粘性末端互相结合后形成的新位点一般不能再被原来的酶识别。
3. 限制性内切酶的命名：1）用属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名。
2. ）用一个右下标的大写字母表示菌株或型。
如Ecok, EcoR（现在都写成平行，如EcoRI）。
3）如果一种特殊的寄主菌内有几种不同的限制与修复系统，用罗马字母表示。
如EcoR I。
EcoR I: E, 属名的第一个字母; co种名的头两个字母;R, 菌株或型号; I,序号；Eco为斜体，R为正体。
4.限制性内切酶产生的末端：1）产生匹配黏端：即黏性末端，识别位点为回文对称结构的序列经限制性内切酶切割后产生的末端。
2）产生平末端：回文对称轴上同时切割DNA的两条链。
3）产生非对称突出末端：识别序列为非对称序列时，切割的DNA产物末端是不同的。
5、常用的DNA聚合酶的：1.）共同特点：把dNTPs连续地加到引物的3‟—OH端。
2. ）主要区别：（1）持续合成能力和外切酶活性不同。
（2）T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。
（3）其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。
5、星星活性：在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称为星星活性。
基因工程复习资料精心整理.docx
第一章绪论1 •基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA）,转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2•基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3 •基因工程的基本步骤（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将冃的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞川。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4 •基因工程的意义（1）基因工程在农业生产中的应用：提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用：1）纤维素的开发利用：克隆各种参与纤维素降解的酶的基因，导入酿酒酵母，就可能利用廉价的纤维素來生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。
或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物；用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂-疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
（4）基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌〃分解油（烷怪类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1. 质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤，主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA,在变性后不会分离，复性快。
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质-SDS复合物结合在一起, 在离心的时候沉淀下去。
基因工程复习资料
第一章一．名词解释1、基因工程：按工程学原理，将外源基因切割，及载体结合，导入受体细胞，使其稳定表达的过程。
2、目的基因：开发人们特殊需要的基因产物或及优良性状相关的基因。
3、工具酶：体外进行合成、切割、连接、修饰等过程需要的酶。
4、药物：在受体细胞内表达产物有药理作用或通过定位整合直接抑制致病基因的。
二．基因工程理论依据（1）基因具有相同的物质基础（2）基因可以切割（3）基因可以转移（4）基因及多肽有对应关系（5）基因的密码是通用的（6）基因可以通过复制遗传给下一代三．基因工程研究内容（1）克隆载体的研究（2）受体的研究（3）工具酶的研究（4）目的基因的研究（5）新技术的研究第二章一．名词解释1、变性：在较高温下，双链间氢键断开，形成单链的过程。
2、复性：变性的，降温时恢复为双链的过程。
3、解链温度：让达到50%变性的温度。
4、复制子：从复制起点开始复制出一个分子或片段的核苷酸序列。
5、启动子：不转录，是聚合酶的识别结合位点。
6、转录区：能转录相应，包括编码区和终止子。
7、操纵子：原核生物中两个以上基共用一个启动子。
8、内含子：真核生物转录区中的非编码间隔序列。
9、限制性核酸内切酶：使一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸酶。
10、稀切酶：有较长的识别序列和富含或的识别序列的限制性核酸内切酶。
11、同裂酶：不同的酶有相同的识别序列。
12、同尾酶：切割不同识别序列产生相同末端的不同酶。
13、黏性末端：两条链断开位置是交错的，叫黏性末端。
14、平末端：两条链断开位置是平齐的，叫平末端。
15、位点偏爱：某些限制酶对同一介质中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱。
16、酶活单位：限制酶最适条件下60分钟切割1所需的酶活性。
17、容积活性：1酶活单位所具有的酶活性。
18、限制酶的活性：一些特定条件下，可以切断及原来识别序列不同的碱基序列，这个现象叫活性。
基因工程复习资料
基因工程复习资料第一章核酸的制备1.主要步骤：分、切、接、转、筛、表2.基因工程的概念：基因工程又称基因堆叠技术和dna重组技术，就是以分子遗传学为理论基为础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外构建杂种dna分子，然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性、获得新品种、生产新产品。
第二章基因工程工具酶1.生物催化剂：核酶、抗体酶、模拟酶。
2.限制性内切核酸酶：定义：限制性内乌核酸酶就是一类能够辨识双链dna中特定核苷酸序列（辨识序列），并在识别序列上使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
命名：限制性内乌核酸酶通常就是以第一次抽取至这类酶的生物的种名的第一个字母和种名的第一、第二个字母命名的，有的在后面还加菌株（型）代号中的一个字母。
如果从同一种生物中先后提取到多种限制性内切核酸酶，则依次用罗马数字ⅰ、ⅱ、ⅲ表示。
并且名称的前三个字母须用斜体，第一个字母用大写。
3.dna连接酶：定义：dna连接酶也称dna黏合酶，在分子生物学中扮演一个既特殊又关键的角色，那就是连接dna链3‘-oh末端和，另一dna链的5’-p末端，使二者生成磷酸二酯键，从而把两段相邻的dna链连成完整的链的一种酶。
种类：大肠杆菌dna连接酶、t4dna连接酶、tscdna连接酶、真核生物细胞辨认出的连接酶，例如酶ⅰ、酶ⅱ、酶ⅲ等多种类型。
4.dna片段的相连接方法：①具互补黏性末端dna片段之间的连接：可用e?colidna连接酶，也可用t4dna连接酶。
②尼奥罗末端dna片段之间的相连接：就可以用t4dna连接酶，并且必须减少酶的用量。
③dna片段末端修饰后进行连接：dna片段末端同聚物加尾后进行连接，可按互补粘性末端片段之间的连接方法进行连接；粘性末端修饰成平末端后进行连接；dna片段5′端脱磷酸化后进行连接；dna片段加连杆或衔接头后连接。
5.dna聚合酶：①定义：dna聚合酶就是指用dna单链为模板，以4种脱氧核苷酸为底物，催化剂制备一条与模板链序列优势互补的dna新链的酶。
基因工程复习(含答案)
基因工程复习题一、名词解释: （10～20%）基因工程基因工程工具酶限制性内切酶限制性内切酶得Star活性PCR引物PCR扩增平台期DNA芯片基因组文库cDNA文库转化限制与修饰系统原位杂交: 将细胞或组织得核酸固定保持在原来得位置上, 然后用探针与之杂交得一种核酸分子杂交技术, 该方法可较好地反映目得基因在细胞或组织中得分布与表达变化。
粘性末端: 双链DNA被限制性内切酶切割后, 形成得两条链错开几个碱基, 而不就是平齐得末端。
Northern印迹杂交: 将RNA进行变性电泳后, 再转移到固相支持物上与探针杂交得一种核酸分子杂交技术, 可用于检测目得基因得转录水平。
转位: 一个或一组基因片段从基因组得一个位置转移到另一个位置得现象。
基因工程: 在体外, 用酶学方法将各种来源得DNA与载体DNA连接成为重组DNA, 继而通过转化与筛选得到含有目得基因得宿主细胞, 最后进行扩增得到大量相同重组DNA分子得过程称为基因工程, 又称基因克隆、DNA克隆与重组DNA等。
目得基因：基因工程中, 那些被感兴趣得、被选作研究对象得基因就叫作目得基因。
连接器: 人工合成得一段含有某些酶切位点寡核苷酸片段, 连接到目得基因得两端, 便于基因重组中得切割与连接。
转化: 受体细胞被导入外源DNA并使其生物性状发生改变得过程。
停滞效应: PCR中后期, 随着目得DNA扩展产物逐渐积累, 酶得催化反应趋于饱与, DNA扩增产物得增加减慢, 进入相对稳定状态, 即为停滞效应, 又称平台期。
逆转录PCR: 以mRNA为原始模板进行得PCR反应。
PCR: 即聚合酶链式反应。
在模板, 引物, 4种dNTP与耐热DNA聚合酶存在得条件下, 特异性地扩增位于两段已知序列之间得DNA区段地酶促合成反应。
α-互补（α-complementation）：指在M13噬菌体DNA或PUC质粒序列中, 插入了lac 启动子-操纵子基因序列以及编码β-半乳糖苷酶N-端145个氨基酸得核苷酸序列（又称α-肽）, 该序列不能产生有活性得β-半乳糖苷酶。
基因工程复习资料
基因⼯程复习资料⼀、绪论1、简述基因⼯程的概念。
答：基因⼯程是指按照⼈们的设计，⽤⽣物技术直接操作⽣物的基因组。
通过分离和拷贝⽬的基因或⼈⼯合成外源基因，在体外将外源基因插⼊到载体分⼦中，成为重组DNA，再导⼊宿主细胞内，进⾏扩增和表达。
此过程所涉及的⽅法学称为重组DNA技术，也称分⼦克隆或基因操作。
2、列举基因⼯程中常⽤的⼀些技术。
答：（1）基因敲⼊：以ES细胞培养技术和同源重组为基础，通过转基因将外源基因整合到特定的靶位点，利⽤靶位点全套的表达调控元件以实现特异性的异位表达。
（2）基因敲除：将⼀个特地设计的DNA⽚段导⼊⽣物体中，通过同源重组使靶基因被置换出⽽失活的实验技术。
（3）基因敲落：是⽤反义技术，RNAi等降低或抑制靶基因的表达活性。
（4）基因打靶：是⽤同源重组来瞄准希望改变的特定内源基因。
（5）基因组编辑：⽤基因组编辑核酸酶，如锌指核酸酶（ZFN）、归巢核酸内切酶、转录激活⼦样效应物（TALE）和成簇间隔短回⽂重复（CRISPR）进⾏剪切。
⼆、基因⼯程的分⼦遗传学基础（⼀）名词解释1、基因表达：指DNA分⼦经转录产⽣互补的RNA分⼦。
2、半保留复制：亲代DNA双链分离后的两条单链均可作为新链合成的模板，复制完成后的⼦代DNA分⼦的核苷酸序列均与亲代DNA分⼦相同，但⼦代DNA分⼦的双链⼀条来⾃亲代，另⼀条为新合成的链，故称为半保留复制。
3、半不连续复制：是指DNA复制时，前导链上DNA的合成是连续的，后随链上是不连续的，故称为半不连续复制。
半不连续模型是DNA复制的基本过程。
4、DNA的变性：指核酸双螺旋碱基对的氢键断裂，双链变成单链，从⽽使核酸的天然构象和性质发⽣改变。
变性DNA常发⽣⼀些理化及⽣物学性质的改变：溶液粘度降低、溶液旋光性发⽣改变、增⾊效应。
5、DNA的复性：指变性DNA在适当条件下，两条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，是变性的⼀种逆转过程。
热变性DNA⼀般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退⽕”。
基因工程复习资料
第二章分子克隆工具酶基因工程工具酶限制性内切酶一一主要用于DNA分子的特异切割DNA甲基化酶一一用于DNA分子的甲基化核酸酶一一用于DNA和RNA的非特异性切割核酸聚合酶一一用于DNA和RNA的合成核酸连接酶一一用于DNA和RNA的连接核酸末端修饰酶一一用于DNA和RNA的末端修饰其它酶类一一用于生物细胞的破壁，转化，核酸纯化，检测等。
第一节限制性核酸内切酶（restriction enzyme）一、限制性内切酶的发现历史核酸酶：催化核酸酯键的水解核酸外切酶：作用于核酸链的末端（3 '或5 '）,逐个水解核苷酸。
核酸内切酶：从核酸分子内部切断35'磷酸二酯键。
限制性核酸内切酶：在细菌细胞内存在的一类能识别并水解外源双链DNA的核酸内切酶。
1、细菌的限制——修饰现象细菌的限制一一修饰作用发现细菌的限制（restriction）现象：寄主控制的专一性phage入K---- * E .coli B [E xoli B 限制R-M系统的作用：R-M系统是细菌安内御外的积极措施。
保护自身的DNA不受制；破坏外源DNA使之迅速降解细菌R-M系统的限制酶可以降解DNA，为避免自身DNA的降解，细菌可以修饰（甲基化酶）自身DNA，未被修饰的外来DNA则会被降解。
个别噬菌体在被降解之前已经发生了修饰，则可免予被降解。
限制性内切酶本是微生物细胞中用于专门水解外源DNA的一类酶，其功能是避免外源DNA的干扰或噬菌体的感染，是细胞中的一种防御机制。
由于R/M现象的发现使得核酸内切酶成为基因工程重要的工具酶。
2、限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶（restriction endonuelease）是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶（endo-deoxyribonuclease）。
它是可以将外来的DNA切断，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。
基因工程复习资料
基因工程:是指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或者人工合成的基因，按照人们的愿望进行严密的设计，经过体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
载体：基因工程中携带外源基因进入受体细胞的“运载工具”本质是DNA复制子。
PCR：又称为聚合酶链反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序。
引物：是人工合成的两端核苷酸序列，一条引物与目的区域一段的一条DNA模板链互补，另一条引物与目的区域的另一条DNA互补。
探针：经放射性或非放射性等物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列。
质粒：生物细胞内固有的、能独立于寄主染色体而自主复制、并被稳定遗传的一类核酸分子。
多克隆位点（MCS）：载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制性内切酶的酶切位点的DNA片段。
基因文库：通过克隆的方法保存在适当宿主中的某种生物、组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。
CDNA文库：从组织细胞中分离得到纯化的MRNA，然后以mRNA为模板，利用逆转录酶合成其互补DNA，在复制成双链片段，与适当载体连接后导入受体菌内，扩增，构建CDNA文库。
退火：热变性核算或蛋白质经缓慢降温后的复性过程。
变性：DNA分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。
包涵体:在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地聚集在细胞内，或被膜包裹或形成无裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体。
基因表达：是指细胞在生命过程中，把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译，转变成具有生物活性的蛋白质分子。
启动子：DNA分子上能与RNA聚合酶结合并形成转录起始复合体的区域。
电泳：带电物质在电场中向相反电极移动的现象。
供体、受体、载体是基因工程的三大要素。
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术是指外源基因重组、克隆和表达的设计与构建（即DNA重组技术）；下游技术涉及含有重组外源基因的生物细胞（基因工程菌或细胞）的大规模培养，以及外源基因表达产物的分离纯化过程。
基因工程复习资料
1.限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：是一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的脱氧核糖核酸内切酶。
2.cDNA文库：代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因群体。
3.基因组DNA文库(genomic DNA library)：是指将某生物体的全部基因组DNA用限制性内切酶或机械力量切割成一定长度范围的DNA片段，再与合适的载体在体外重组并转化相应的宿主细胞获得的所有阳性菌落。
4.穿梭载体(shuttle vector)就是能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。
一般在大肠杆菌中保藏、扩增，然后转到目标宿主中表达。
5. 转基因沉默：指外源基因在转基因生物中不能正常表达的现象6. 融合蛋白：通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物7. 穿梭质粒载体：能在两种宿主中复制的载体分子，可在两种生物间运载基因的载体8. T-DNA：转移DNA。
Ti质粒中的一部分DNA片段，进入寄主细胞并插入基因组中，能够利用植物的酶系统进行转录和翻译其表达产物可诱发植物产生肿瘤。
9.转导：通过λ噬菌体（病毒）颗粒感染途径将外源DNA分子转移到受体细胞10. 基因治疗：将外源基因（正常、反义或自杀基因）导入体内以弥补所缺失的基因、关闭或降低异常表达的基因，以治疗遗传性和恶性肿瘤、心血管疾病及传染病等疾病。
11. RNA干扰（RNAi）：是指在进化过程中高度保守的，由双链RNA诱发的、同源mRNA高特异性降解的现象12.基因组计划：基因组就是一个物种中所有基因的整体组成13.基因打靶：通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特点基因，从而在生物活体内研究此基因的功能14.稳定转化：15.选择性标：16.卸甲Ti质粒：17.遗传工程：包括细胞水平上的遗传操作（细胞工程）和分子水平上的遗传操作（基因工程）；18.转化：重组质粒通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定表达维持和表达19.融合蛋白：通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物。
基因工程复习内容
基因工程复习一、名称解释1、blunt end：平末端，即DNA分子末端的两条链都结束于同一核苷酸位置，没有多出来的单链。
2、Clone：克隆，即一群相同的细胞，通常含有相同的重组DNA分子。
3、codon：DNA链上能决定特定氨基酸的三个连续的核苷酸称为密码子。
（网络资料）4、DNA Footprinting：DNA印迹，用于检测与特定蛋白质结合的DNA序列的部位及特性的一种实验技术。
6、DNA library：把某种生物基因组的全部遗传信息通过克隆载体贮存在一种受体菌克隆子群体之中，这个群体即为这种生物的基因组文库。
7、enhancer：增强子：指增加同它连锁的基因转录频率的DNA序列。
8、Gene：基因（gene）是遗传的物质基础，是DNA分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列，即具有遗传效应的DNA分子片段。
9、Gene Bank：基因库是某一特定生物的很多克隆的集合，其中克隆的数目足够大，使这一生物体的每一个基因都可能包好进去。
10、GMO：遗传工程体，由基因工程技术产生的生物称遗传工程体。
（网络资料）11、基因工程(Gene engineering)是指将一种生物（供体）的基因转移到另一种生物（受体）中去，创建具有某种新性状的生物新品系并能稳定遗传给后代的一种现代生物技术12、gene chip，基因芯片：基因芯片，又称DNA芯片、DNA微阵列，它是指采用原位合成或显微印刷技术，将数以万计的DNA探针分子固定于支持物的表面上，产生的二维DNA探针阵列。
13、host cell，寄主：即是基因工程受体，能让重组DNA分子在其中生活和繁殖的细胞。
14、isoschizomer，同裂酶，指来源不同，识别位点相同，切割位点可以相同，也可以不同。
15、mutation，突变：基因的结构发生改变而导致细胞、病毒或微生物的基因型发生稳定的、可遗传的变化过程。
16、primer，引物：即一条短的寡核苷酸单链，能够通过碱基配对结合在单链模板分子上，作为DNA聚合酶指导下的互补链合成的起点。
基因工程复习资料-精心整理
第一章绪论1.基因工程的定义：在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。
2.基因工程理论上的三大发现和技术上的三大发现3。
基因工程的基本步骤（1)目的基因的获取：从复杂的生物基因组中,经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断.（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记(抗菌素抗性）的载体分子上。
(3）重组体的转化：将重组体(载体）转入适当的受体细胞中.(4)克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
(5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
4.基因工程的意义（1)基因工程在农业生产中的应用:提高植物的光合作用率；提高豆科植物的固氮效率；转基因植物；转基因动物。
（2）基因工程在工业中的应用:1）纤维素的开发利用:克隆各种参与纤维素降解的酶的基因,导入酿酒酵母,就可能利用廉价的纤维素来生产葡萄糖，发酵成酒。
2）酿酒工业：用外源基因改造酿酒酵母，产生优质的啤酒。
或用酿酒酵母生产蛋白质等。
（3）基因工程在医药上的应用：用微生物生产药物; 用转基因植物或动物生产药物；设计高效高特异性的生物制剂——疫苗；制造新型疫苗；基因诊断；法医鉴定；基因治疗。
(4)基因工程在环境保护中的作用：1）检测水污染：用重组细菌或转基因鱼等检测水污染2）生物降解：用带有重组质粒的“超级菌”分解油（烷烃类）、有机农药污染。
（5）基因工程商业化的发展第二章基因工程主要技术原理1．质粒和基因组DNA的提取方法与纯化步骤,主要试剂是什么质粒的提取和纯化方法最常用的为碱抽提法：原理：闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离,复性快。
染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质—SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。
基因工程复习资料
第一章基因工程概述一、名词解释基因、基因操作、基因工程、重组DNA技术基因：是编码产生蛋白质或RNA等具有特定功能产物的一段具有遗传效应的DNA片段，是控制生物性状的基本遗传单位。
基因操作：是指对基因进行分离、分析、改造、重组、转移、检测和表达等操作的简称。
基因工程：专指为实践应用而进行的基因重组事件，具体是指通过基因操作来定向改变或修饰生物体，并具有明确应用目的的活动。
重组DNA技术：又称基因工程。
二、思考题1、简述基因工程操作的基本步骤。
（1）获得目的基因（2）目的基因与克隆载体连接，形成重组子（3）将重组子转化受体细胞，获得转化子（4）转化子检测和筛选（5）目的基因在受体中被表达，获得所需的遗传性状或产物2、简述基因工程操作的理论依据。
（1）基因具有相同的物质基础（2）基因是可切割和粘合的（3）基因是可转移的（4）多肽与基因之间有对应关系（5）遗传密码通用（6）基因可以复制遗传3、简述基因工程诞生理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论三大发现：遗传物质是DNA（基因） DNA的双螺旋结构和半保留复制中心法则和氨基酸技术三大发明：限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶第二章基因工程的工具酶一、名词解释限制性内切酶、同裂酶、同尾酶、DNA连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶限制性内切酶：是一类能识别双链DNA分子内部某种特殊的核苷酸序列，并使每个核酸链上特定部位相邻的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开的一类核酸内切酶。
同裂酶：指来源不同，但识别相同靶序列，切割产生不同或相同末端的限制性内切酶。
即不同来源的限制性内切酶可切割相同的序列。
同尾酶：指来源各异，识别靶序列各不相同，但切割产生相同末端的限制性内切酶。
同尾酶切割DNA得到的产物可进行互补连接。
DNA连接酶：催化DNA片段两侧（相邻）核苷酸的3'羟基和5'磷酸基之间形成磷酸二酯键，使断开的DNA连接起来的酶。
DNA聚合酶：催化DNA合成的酶逆转录酶：依赖RNA的DNA聚合酶二、思考题1、简述限制性内切酶命名的基本原则。
基因工程复习资料
第一章：绪论名词解释基因工程：通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
遗传工程：根据遗传学原理，按照人们预先设计的生物蓝图，对生物的遗传物质进行有计划的操作，以达到定向改造生物的遗传组成，使其获得新的遗传性状，这个工程称为遗传工程。
包括常规的有性杂交育种，染色体工程，细胞工程以及基因工程等。
简答1、什么是基因工程？它包括哪些环节？基因工程是通过基因操作，将目的基因或DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状的操作。
具有以下几个重要特征：（1）打破物种的界限，实现跨物种的基因转移；（2）通过已知功能基因的遗传转化，可进行物种的定向改良；（3）可以创造出自然界中原本没有的生物。
它包括以下环节：①目的基因克隆②载体的准备③目的基因与载体的连接④重组DNA 转转染/转导⑤重组体的筛选与鉴定⑥重组体的大量培养，外源基因表达效应分析与开发应用2、基因工程与基因操作、基因克隆、遗传工程等概念有什么异同？基因操作泛指对基因进行酶切、连接、转化等分子生物学操作，是基因工程的技术基础。
基因克隆是指对基因进行分离和扩大繁殖等操作过程，其目的在于获得大量的基因拷贝，它在技术上主要包括载体构建、大肠杆菌遗传转化、重组子筛选和扩大繁殖等环节，很多时候并不涉及动物、植物等的转化及性状的遗传改良，显然与基因工程不完全一致。
遗传工程广义的是指所有能改变生物体遗传性状的技术，包括常规的有性杂交育种、染色体工程、细胞工程以及基因工程等。
3、基因工程的基本条件有哪些？它们各自在基因工程中起着什么作用？①目的基因:是开展基因工程的目标和物质基础。
②载体:是运载工具，引入的外源基因到宿主细胞中，使其进行复制或表达。
③工具酶:指体外进行DNA合成、切割、修饰和连接等系列过程中所需要的酶。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
细菌的限制—修饰作用
核酸限制性内切酶的类型及主要特性
一个单位的限制性核酸内切酶定义为：在合适的温度和缓冲液中，在50uL反应体系中，1h完全降解1ug底物DNA所需要的酶量。
星号（*）活性：如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，内切酶出现切割与识别位点相似但不完全相同的序列，这一现象称为星号（*）活性。
同位酶：识别位点相同，但切点不同。
同裂酶：识别位点和切点均相同，但来源不同。
同尾酶：识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端
两种DNA连接酶
（1）大肠杆菌DNA连接酶：只能连接粘性末端。
分子质量为68ku
（2）T4噬菌体DNA连接酶：不但能连接粘性末端，还能连接平齐末端。
分子质量为75ku
p35页表2-4
简述DNA连接酶的作用机制及其特点
说明使用切口位移法进行DNA标记的原理及其步骤
基因工程载体根据来源和性质不同可分为质粒载体，噬菌体载体，黏粒载体，噬菌粒载体，病毒载体，人工染色体等
质粒的概念：质粒（plasmid)是一种存在于细菌或真菌染色体外的小型环状（线型质粒DNA 分子—眼虫、衣藻等）双链DNA 分子（酵母的“杀伤质粒”是RNA），可自身复制和表达。
共价闭合环状DNA（SC构型）开环DNA（oc构型）线形DNA （L构型）
同一质粒尽管分子量相同，不同的构型电泳迁移率不同：
SC DNA最快、L DNA次之、OC DNA最慢。
理想质粒载体的必备条件：
A、具有较小的分子质量和较高的拷贝数
B、具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点（多克隆位点）
C、具有两种以上的选择标记基因
D、缺失mob基因（载体的安全性：质粒不能随便转移、条件致死突变）
E、插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并复制和表达（复制起点）、较小的宿主范围蓝白班筛选原理
穿梭质粒载体(shuttle vector) ：由人工构建的具有两种不同复制子起点和选择性标记基因
黏粒载体也称柯斯质粒载体：它是一类含有λ噬菌体的cos序列的质粒载体
噬菌体载体的优越性p69
黏粒载体的基本特点(P70)
具有λ噬菌体的特性(体外包装，高效感染等)；
具有质粒载体的特性(易于克隆操作、选择及高拷贝等)；
具有较高容量（35kb-45 kb）的克隆能力；
具有与同源性序列的质粒进行重组的能力。
表达载体构建的一般原则
1. 阅读框架与外源基因高效表达
2. 启动子与外源基因高效表达
3. 转录的有效延伸和终止与外源基因高效表达
4. 有效的翻译起始与外源基因高效表达
5. 终止密码子选择与外源基因高效表达
6. 外源蛋白的稳定性与外源基因高效表达
报告基因：用于检测与其组装在一起的嵌合基因在导入细胞后是否表达的一种指示基因
探针：指经放射性或放射性物质标记的已知或特定的DNA或RNA序列
p115第八题
PCR引物设计的一般原则：
①引物长度一般在15~30碱基之间，Tm接近72℃较佳。
②碱基要随机分布，避免出现一连串的单一碱基或产生二级结构。
③G+C含量在45%~55%之间。
④两个引物在3′端均必须与模板互补，5′端可以不互补。
⑤引物自身不能有连续4个碱基的互补，以免形成发夹结构。
⑥引物之间不能有连续4个碱基的互补，以免形成引物二聚体。
⑦引物末位最好选A/G/C，不要选T，引物3′端要避开密码子的第3位。
反转录PCR（RT-PCR)：利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR 扩增。
快速扩增cDNA末端技术：PCR用于扩增代表mRNA转录物某单一位点与其3’或5’末端之间区域的部分cDNA称为快速扩增cDNA末端技术
基因文库：用分子克隆方法将某种生物或其组织的所有DNA片段插入适当的载体，转化适当宿主菌后，进行保存的克隆集合。
p141
cDNA文库的构建：以mRNA为模板，将体外反转录的cDNA、与适当的载体连接后转化受体菌，这种包括特定组织细胞所有mRNA信息的cDNA克隆的集合称为该组织细胞的cDNA 文库
cDNA第二链的合成（作业p154）
化学合成DNA方法有：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、自动化合成法固相合成从基因文库中获取目的基因的方法有核酸杂交法差示杂交法PCR筛选法表达文库的免疫学筛选
染色体步移的基本过程
1) 用遗传作图将目标基因定位在染色体的特定位置;
2) 找到与目标基因紧密连锁的分子标记;
3)构建含有大插入片段的基因组文库(ＢＡＣ库或ＹＡＣ);
4)以与目标基因连锁的分子标记为探针筛选基因组文库;
5)用获得阳性克隆构建目的基因区域的跨叠群;
6)通过染色体步行获得含有目标基因的大片段克隆;
7)通过亚克隆获得含有目的基因的小片段克隆;
同聚物加尾法：DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3’-OH端加上脱氧核苷酸。
人工接头连接法p168
外源DNA片段与载体DNA的重组主要有哪几种方法？各有何优缺点？
（一）黏性末端连接法
（二）平头末端连接法：①同聚物加尾连接；
②人工接头连接等。
黏性末端连接法优点：黏性末端连接可抑制载体和目的DNA分子的自连，因而可大大提高连接的效率。
更重要是不同限制性酶切位点的黏性末端连接可以控制目的DNA和载体DNA 的连接方向。
缺点：载体易自身环化；不易定向克隆；产生串联重组体；难以插入特定的基因；大片段DAN的重组率低
DNA接头（adapter）连接法优点：连上后就能用。
缺点：接头与接头以粘末端连接，形成二(多)聚体，影响与DNA片段的连接
同聚物加尾法优点：能把任何片段连接起来
缺点：操作繁琐；外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源基因表达。
转化子：就是导入外源DNA后或得了新的遗传标志的细菌细胞或其他受体细胞。