地高辛标记与检测DNA试剂盒说明书

地高辛标记与检测DNA试剂盒DIG DNA Labeling and Detection Kit 采用地高辛-dUTP进行随机引物DNA标记，碱性标记，利用NBT/BCIP 酶联免疫，随时即用。

此试剂盒可对10ng-3μgDNA进行25次标记反应，

可检测10×10cm2面积的杂交膜50张

指导手册

1 前言

1.1 内容表

1 前言

1.1 内容表

1.2 试剂盒成分

2.介绍

2.1 产品简介

3. 操作步骤和所需材料

3.1 在你开始前

3.2 流程图

3.3 地高辛标记DNA

3.4 标记效率的确定

3.5 DNA的转移和固定

3.6 杂交

3.7 免疫检测

3.8 DNA印记的洗脱和再杂交1.2 试剂盒的成分

瓶号标记

内容包括功能

1 无标记对照DNA1

2 无标记对照DNA2

3 DNA稀释缓冲液2管1mL

50μg/mL鱼精DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, pH8.0 在25℃

澄清溶液

4 DIG标记的对照

DNA

20μL

5μg/mL 质粒pBR328 DNA （用Bam HI线性

化）

澄清溶液

用于确定标记效率

5 六聚核苷酸混合物

6 标记用混合物

7 DNA聚合酶1大片

段

标记级

8 抗地高辛的碱性磷

酸酶结合物

200μL

750U/mL

从羊中获取的，Fab段，结合碱性磷酸酶

澄清溶液

9 NBT/BCIP

10 封阻试剂附加仪器与所需试剂

除了上表中列出的试剂外，你必须准备一些溶液。在下表中，你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。

在每个操作程序的前面提供了详细的信息。

操作程序仪器设备试剂

3.3 DIG-DNA标记水浴灭菌的双蒸水

0.2M pH8.0 灭菌的

EDTA

3.4 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲

组合*

TE缓冲液

或者

洗涤缓冲液

马来酸缓冲液

检测缓冲液

3.5 DNA转移和固定紫外光盒或者商业化可用

于紫外交联的其他设备2×SSC

或者10×SSC

3.6 杂交尼龙膜，带正电荷*

杂交袋*，或者耐热的塑料

袋或者滚筒瓶（分子杂交

炉）

注意：当用地高辛杂交缓冲

液工作时，不要用开口的托

盘。DIG Easy Hyb

（杂交缓冲液，需单独购买）

3.7 免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶

杂交袋* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合* TE缓冲液

或者

洗涤缓冲液

马来酸缓冲液

检测缓冲液

3.8 DNA 斑点的脱色和大的托盘DMF

重新标记探针水浴0.2M NaOH，0.1%SDS

2×SSC

*标记的产品可以从Roche Applied Science 获得。

2.介绍

2.1 产品概况

实验原则

此试剂盒采用DIG(地高辛)，一种甾类半抗原，steroid hapten去标记DNA 探针用于杂交和后续的免疫检测。

步骤描述

DNA 标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的DNA探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物，其中含有地高辛dUTP,碱性标记和所有的试剂，包括随机引物标记所必须的酶，已预先混合优化的5×浓度反应缓冲液。

杂交根据标准方法，地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP能够更加容易和有效的被洗脱下来，使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。

免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测，Fab 段，然后采用即时可用的化学发光底物NBT/BCIP可以看到杂交结果。

应用

地高辛标记DNA探针可以用于：所有类型的滤膜杂交样品材料

至少100bp的DNA片段

线性的质粒，cos质粒或者DNA

超螺旋的DNA

实验时间

步骤反应时间

DNA标记1h-O/N

杂交 6 h or O/N

免疫检测 1.5h

显色0.5-16h

检测数量

一个试剂盒足够用于:

25个标准的标记反应，每个反应的膜板DNA不超过3μg；

并可以检测50张10×10cm2的杂交膜。

质量控制

根据操作步骤中的说明对未标记的对照DNA 【pBR328】进行标记，并按

照下面的标准检测操作方法在点杂交中用0.1pg 同源DNA点在膜上16h后成色

显影检测。

试剂盒的储存和稳定性

未开封的试剂盒在保质期内可以稳定的存放在-15℃到-25℃（保质期印在标签上）。在干冰中运输。

一旦开封，请根据下表选择适宜的储存条件。

试剂盒成分储存条件

抗地高辛碱性磷酸酶结合物（8号管）2-8℃稳定。

NBT/BCIP (9号管) 2-8℃，避光保存

或者15-25℃保存4周

封阻液（10号管）未开封时，2-8℃或者15-25℃稳定；

一旦开封，应分装并储存在-15℃到

-25℃或者无菌条件下2-8℃间可以稳定

保存1个月；

工作溶液都应是新鲜配制的

灵敏度和特异性

采用southern杂交从1μg人胎盘DNA（经BglⅡ或EcoRⅠ酶切）中检测到单拷贝基因。