实验十四 纸片法测定五种抗生素对大肠杆
鸡大肠杆菌病的症状与病理变化 鸡大肠杆菌病的防治措施 - 养鸡技术
鸡大肠杆菌病的症状与病理变化鸡大肠杆菌病的防治措施-养鸡技术鸡大肠杆菌病是由大肠杆菌引起的，以败血病、卵黄性腹膜炎、输卵管炎、全眼球炎、肉芽肿等为特征的一种传染病。
雏鸡及4月龄以下的鸡易感性高。
鸡大肠杆菌病是目前养鸡生产中最主要的疾病之一，发病率以及死亡率都较高，会导致鸡的生长发育受阻、饲料转化率降低、死淘率增加、产品品质下降等，造成严重的经济损失。
下面就给大家介绍一下：鸡大肠杆菌病的症状与病理变化鸡大肠杆菌病的防治措施。
大肠杆菌病是畜牧生产中广泛发生，并且也是较为防治的一种疾病，鸡大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的鸡急性或者慢性细菌性传染病，目前在养鸡业中发病率以及死亡率都较高，危害非常大。
近年来，随着养鸡业规模化、集约化的发展，鸡大肠杆菌病的发病率有着持续上升的趋势，会导致鸡的生长发育受阻，饲料转化率降低，死淘率增加，种鸡以及蛋鸡的蛋的品质下降，孵化率降低，治疗费用增加，给养鸡业造成较为严重的经济损失，是养鸡生产中最主要的疾病之一。
鸡大肠杆菌病是一种多发性疾病，各年龄的鸡均可感染，一年四季均可发生，主要的传播途径为消化道、呼吸道、蛋壳穿透、交配等。
鸡大肠杆菌病在临床上会表现出多种症状，根据症状以及病变可以分为大肠杆菌败血症、脐火、气囊炎、卵黄性腹膜炎、关节炎、肠炎等。
一般患此病的鸡没有特征性的临床表现，但普遍会出现一系列的反应。
要根据此病的流行特点、病理变化，并结合实验室来做出诊断，进行科学合理的治疗。
因大肠杆菌是条件性致病菌，在此病的防治过程中要以预防为主，加强饲养管理以及环境控制，从而减少该病的诱发因素。
1、流行特点该病无季节性发病，但是以冬季和夏季为多发季节，各阶段的鸡群均可感染此病，其中在幼雏和中雏中的发病率较高。
该病常与呼吸道疾病、传染性支气管炎、支原体、腹水症等混合感染，危害较大。
该病的发病率和死亡率与饲养管理水平、环境卫生以及综合防治措施和应激等因素有着直接的关系。
因大肠杆菌在自然环境、饲料、饮水、鸡体表等处，因此在养鸡生产中会对全过程造成威胁，如果饲养管理不当，饲养环境恶劣、卫生不良等会使鸡群感染此病，该病发病急，病鸡和带菌鸡是主要的传染源，病原的传播途径主要经过鸡的呼吸道、消化道以及种蛋。
纸片扩散法实验报告
1. 掌握纸片扩散法（Kirby-Bauer法）的原理、操作方法和结果判读。
2. 了解纸片扩散法在抗菌药物敏感试验中的临床意义。
二、实验原理纸片扩散法是一种常用的抗菌药物敏感试验方法，其原理为：将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种待检菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分溶解后，不断地向纸片周围扩散，形成递减浓度梯度。
在纸片周围抑菌浓度范围内，待检菌的生长被抑制，从而产生透明的抑菌圈。
抑菌圈的大小反映检测菌对测定药物的敏感程度，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
三、实验材料1. 标本：大肠埃希菌（18～24小时非选择性培养基上纯培养物）。
2. 试剂：营养肉汤或无菌生理盐水、直径为9cm水解酪蛋白（M-H）琼脂平板、药敏纸片（氨苄西林、头孢唑啉、庆大霉素、头孢曲松、环丙沙星、亚胺培南）等。
3. 器材：35℃培养箱、0.5麦氏比浊管或比浊仪、酒精灯、接种环、镊子、无菌棉拭子、毫米尺或游标卡尺等。
四、实验方法1. 菌液制备：用接种环或无菌棉拭子蘸取大肠埃希菌单个菌落，接种到有营养肉汤或0.9%无菌生理盐水的试管中，制成菌悬液，校正浊度为0.5麦氏浊度。
2. 接种平板：调整好悬液的浊度后，用无菌棉签浸入悬液内，紧贴试管内壁在液体上方旋转拭子数次，除去棉签上多余的液体，但也应适度。
用拭子划线整个琼脂表面，从平板顶部到底部。
3. 贴药敏纸片：用无菌镊子或纸片分配器将药敏纸片平贴于M-H琼脂平板表面，轻压。
直径9cm的平板可贴6张纸片，每张药敏纸片之间的距离24mm，距平板边缘15mm，纸片贴牢后不要移动。
4. 培养平板：将贴好药敏纸片的M-H琼脂平板置室温干燥3～5min，倒置放入35℃培养箱中培养16～24h。
5. 结果观察与记录：观察平板上抑菌圈的大小，并记录数据。
1. 氨苄西林：抑菌圈直径为18mm。
2. 头孢唑啉：抑菌圈直径为22mm。
3. 庆大霉素：抑菌圈直径为25mm。
细菌总数测定纸片法实验报告
细菌总数测定纸片法实验报告
标题：细菌总数测定纸片法实验报告
摘要：
本实验采用纸片法测定细菌的总数。
首先，将培养基均匀涂布在琼脂培养皿上，然后将待测液体滴于培养皿上，再将纸片轻轻覆盖在液体上。
经过一段时间后，纸片上的细菌会在培养基上生长形成菌落，通过计数菌落的数量可以确定细菌的总数。
实验过程：
1. 准备琼脂培养皿，并在上面均匀涂布培养基。
2. 将待测液体滴于培养皿上，确保液体均匀分布。
3. 将纸片轻轻覆盖在液体上，避免与培养基直接接触。
4. 将培养皿倒置放置于恒温箱中，设置适宜的温度和时间进行培养。
5. 取出培养皿后，观察纸片上的菌落，使用显微镜对菌落进行放大观察。
6. 通过计数菌落的数量，利用统计方法可以估算出细菌的总数。
结果：
根据实验观察，纸片上出现多个菌落，通过放大观察可以看到菌落的形态、颜色和大小。
通过计数菌落的数量，并结合统计方法，可以估算出细菌的总数。
讨论：
纸片法测定细菌总数的优点在于方法简单、成本低廉，并且可以适用于各种类型的细菌。
然而，该方法也存在一定的局限性，
如同一种细菌可能在培养基上形成不同形态的菌落，而且纸片法只能估算出细菌的总数，无法区分不同菌落所对应的细菌种类。
结论：
通过纸片法测定细菌总数，我们可以获得关于细菌数量的大致信息。
然而，在实际应用中，我们仍需结合其他检测方法来获取更全面的细菌信息，并确保实验的准确性和可靠性。
大肠杆菌对几种抗菌药物的药敏试验
Ｄｏ Ｉ ．９ ９Ｊ １ Ｎ．６ １ ６ ２ ２ ．８ ０ ３ ：０ ３ ６ ／ ． １ ＳＳ １ ７ — ０ ７．０１ Ｏ ．２ ２
肟、 普康 和阿莫 西林 ， 进行 药敏试验 ， 有筛选 有效 的抗菌药
物。 １ 材 料 与 方 法
已经灭 菌的空平皿 内 ， 每皿约 １～ ０ （ ４ ｍ厚 ）冷却后 ８ ２ｍＬ 约 ｍ ，
倒 置放入 ３ ￣恒温箱过夜 ， ７Ｃ 经无 菌检验合格后置冰箱备用 。 料 高压灭 菌锅 ，规格 ＨＶ 一 ０型 ， ｔ Ｅ５ Ｅ
每管 ５ ，２ ℃高压 １ｍｉ， ｍＬ １ １ ５ ｎ 冷却后放入 ３ ｃ恒温箱过夜进 ７Ｃ
行无菌检验 。见液体 清澈 ， 透明 ， 无菌产生 ， 证明合格 ， 备用。
或少数几种抗生素 ， 而且能够耐药多种抗生素。由此而造成 的危害 十分严 重 ， 它不 仅使抗生素 的疗 效降低 ， 而且使用剂 量增大 ， 疗程延长 ， 死亡率升高 和增加 了治疗 的费用 ， 不但给 养殖业带来巨大的经济损失 ，也极 大地影响 了食 品的安全 ， 危害 了人类 的身体健康 。 本实验应用 了 ８ 种血清型的大肠杆
学实验兽药厂实验室提供 。 １ ． 培养基 ．２ １ 普 通 肉汤 ， 营养琼脂 ， 麦康 凯琼脂均购 自杭
州天和微生物试剂有 限公司。 按说明书方法制成营养琼 脂斜
１ ． 干燥药敏试纸 的制备 ： ．４ ２ 用杭州天 和微生物有 限公 司提 供 的直径 ６６ ． ｍｍ的滤纸片 ５ ０片 ， 置青霉素小瓶内 ， 包扎好瓶 口，２ 。高压灭菌 ３ ｒｎ 取 出小瓶置于温箱烘干 ， １１ｃ ０ ｉ， ａ 按每张纸
大肠杆菌的药敏试验
电炉子、高压灭菌锅、干燥箱、微波炉、天平、恒温培养箱、震
荡培养箱、显微镜、移液器等。
2 药物敏感性试验
本试验采用药敏纸片法，将大肠杆菌的分离菌株接种于
普通的营养肉汤，37℃培养 24h。得到菌液，在无菌条件下，
用高压灭菌的无菌棉蘸取菌液，在管壁上挤压去掉多余菌
液。用棉拭子涂布整个培养基表面，反复几次，每次将平板旋
均购自北京奥博星生物技术责任有限公司；脱纤维兔血液保
存于建平县疫控中心实验室。按说明书配制。
经灭菌的平皿、接种环、无菌吸管、玻璃涂
棒、玻璃纸、镊子、滴管、小试管、烧杯、试管架、吸水纸、火柴、
酒精灯、各种染色液、滤纸、木夹子、载玻片、盖玻片、接种环、
接种棒、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、生理盐水、
16 例仔猪水肿病 的肠系膜淋巴结中分离出 15 株 溶血性大肠杆菌。
验
抗菌药物纸片 头孢唑啉、头孢哌酮、新霉
︶
素、环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙
星、头孢呋肟、青霉素、红霉素、
头孢噻肟、头孢他啶、四环素、强
力霉素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、妥布霉素等 17 种，购
自杭州天和微生物试剂有限公司。
营养琼脂培养基、麦康凯培养基、营养琼脂等
15 株溶血性大肠杆菌分离株对 17 种抗菌药物的敏感性 测定结果见表 1。
表 1 15 株溶血性大肠杆菌的药敏试验结果
注：1. 抑菌圈直径 d ≥20 mm 为高度敏感；抑菌圈直径 10 mm≤d< 20mm 为中度敏感；抑菌圈直径 d< 10mm 为不敏感； 2. 表中“ - ”指未作检测 本试验测得 15 株溶血性大肠杆菌对四环素类和 β- 内 酰胺类抗生素均产生了不同程度的耐药且均为多药耐药。与 其它类抗生素的耐药性相比，本试验分离的溶血性大肠杆菌 对氨基糖苷类和喹诺酮类高度或中度敏感，建议辽宁建平地 区可使用氨基糖苷类和喹诺酮类抗生素治疗仔猪水肿病。 3小结 本病通过药敏纸片法测定分离自仔猪水肿病的 15 株溶 血性大肠杆菌对 17 种抗菌药物的耐药性。其结果表明：对 15 株溶血性大肠杆菌分离株高度敏感的抗菌药物依次为环 丙沙星、新霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素，其抑菌圈直 径都在 22～28.30 mm；中度敏感药物为氧氟沙星、诺氟沙 星、红霉素、头孢噻肟、四环素，其抑菌圈直径都在 12.10～ 17.30mm；对强力霉素、头孢呋肟、链霉素耐药，其抑菌圈直径 都在 9.20～10.30mm。可见从该病中分离的溶血性大肠杆菌 对氨基糖苷类和喹诺酮类高度或中度敏感。而对四环素类和 几种 β- 内酰胺类抗生素产生了耐药性，100%（15/15） 溶血 性大肠杆菌分离株对四环素类抗生素产生了耐药性，86.7% （13/15）溶血性大肠杆菌分离株对 β- 内酰胺类药物产生了 不同程度的耐药性。临床可根据药敏试验结果合理选药以有 效治疗仔猪水肿病。
大肠菌检验方法（快速纸片法）验证方案
大肠菌检验方法（快速纸片法）验证方案食（饮）具大肠菌群检验方法—纸片法验证方案1．验证目的和原理1.1 验证目的为确认本实验室所采用的方法适合于食（饮）具大肠菌群检验，特制定本方案验证GB 14934-94食（饮）具消毒卫生标准食（饮）具大肠菌群检验方法，纸片法能否准确检验出食（饮）具中的大肠菌群。
1.2 原理：通过试验来评价验证整个检验方法的准确性、有效性。
2．验证方法步骤2.1验证前的准备：进行食具大肠菌群发酵法检验验证前，所有的仪器和试剂都应该严格按照相关的灭菌程序消毒，以确保其对试验的结果没有影响。
2.2验证试验的操作计划：做空白对照，以及阳性对照。
3．试验实施3.1试验前的准备3.1.1主要仪器设备：除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱：36 ℃±1 ℃，冰箱：2 ℃～5 ℃，天平：感量 0.1 g，无菌吸管：1 mL，无菌塑料袋。
3.1.2操作环境：环境洁净度不应低于10000级无菌室。
3.1.3试验样品：两套经消毒灭菌后的餐具，包含碗，盘，口杯，匙，筷子。
3.1.4试剂： 0.9%无菌生理盐水3.1.5验证用微生物名称及其编号实验菌株的来源：中国工业微生物菌种保藏管理中心3.1.7培养基3.2验证试验操作3.2.1样品制备将大肠埃希菌菌苔用9mL生理盐水稀释至10-3，用无菌棉签蘸取稀释后的菌液，涂抹在1套灭菌后的餐具表面待用。
3.2.2验证方法按照编制的作业指导书进行采样，检验，同时做空白对照。
3.3试验结果测试人：复核人：测试日期：复核日期：4．验证结果评价分析（1）验证试验是否有遗漏？（2）验证实施过程中对验证方案有无修改？修改原因、依据以及是否经过批准？（3）验证记录是否完整？（4）验证试验结果是否符合标准要求？起草人：起草日期：年月日验证实施日期：年月日测试人：复核人：测试日复核日期：。
几种药物对大肠杆菌的治疗效果
几种药物对大肠杆菌的敏感性测定结果报告组员：*** *** ***报告人：***学号：***几种药物对大肠杆菌的敏感性测定摘要：大肠杆菌的抗原性复杂，毒力因子多种多样，不同血清型、不同毒力因子菌株的宿主范围和致病性大不相同，可在不同的动物或在同种不同年龄的动物中引起多种多样的疾病。
通过采用不同的抗菌药物对鸡大肠杆菌病进行治疗，结果表明，该菌对头孢噻肟、庆大霉素、阿米卡星、氧氟沙星和卡那霉素敏感。
【实验目的】通过检测抑菌圈大小测定大肠杆菌对氟苯尼考、头孢噻呋呐、硫酸新霉素可溶粉、氧氟沙星和卡那霉素几种药物的敏感程度。
【实验原理】纸片法药敏试验是将抗菌药物吸收到特定的纸片中，然后置于已接种待测定菌的固体培养基上，抗菌药物通过向培养基内的扩散，抑制敏感细菌的生长，从而出现抑菌环（带）。
由于药物扩散的距离越远，达到该距离的药物浓度越低，故可以根据抑菌环的大小，判断细菌对药物的敏感度。
通过药物敏感试验，我们可以找出针对于某些致病菌的敏感药物，从而对临床中的细菌性疾病的治疗提供指导。
【实验材料】1、药品及细菌——氟苯尼考、头孢噻呋呐、硫酸新霉素（杆菌净）、氧氟沙星和卡那霉素等抗菌药物，生理盐水，磷酸盐缓冲溶液，MH营养肉汤，MH培养基，麦康凯培养基，蒸馏水，大肠杆菌2、器材——纸片，试管，移液器，酒精灯，高压蒸汽锅，无菌操作台，镊子，剪刀，锥形瓶，烘箱，培养箱，天平，玻璃棒，干净毛巾（报纸），炭笔，接种环，小广口瓶【实验方法及内容】1．药敏纸片的制作1.1制备方法：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。
取圆纸片50片放入清洁干燥的小广口瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。
经15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。
1.2抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的小广口瓶内加入药液0.25毫升（因不好取材，故扩大十倍配药。
），并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。
纸片法抗菌药物敏感实验操作标准
纸片法抗菌药物敏感实验操作标准4.3 标准比浊管用硫酸钡比浊管（0.5麦氏比浊标准），标定接种菌液浓度。
比浊管制备方法如下：（1）0.048mol/L BaCl2，（1.175% w/v BaCl2·2H2O）0.5ml，加到99.5ml的0.18 mol/L（0.36N）H2SO4（1％v/v）溶液中，制成比浊管；（2）用光径为1cm的分光光度计测定光吸收来标定比浊管。
0.5麦氏标准比浊管在625nm波长的吸收光度应为0.08-0.1；（3）选管径与制备菌液试管相同的螺口试管，每管分装4－6ml；（4）将试管帽拧紧，放室温暗处保存；（5）用前，将比浊管在旋转振荡器上混匀。
如出现大颗粒，应更换；（6）每个月更换比浊管或复检比浊管的浊度。
5 操作步骤5.1 制备接种菌液5.1.1 增菌法步骤如下：（1）选琼脂平板上形态相同的菌落至少4－5个，用接种环挑其顶部，移至4－5ml肉汤或大豆酪蛋白消化液中；（2）置35℃培养至菌液浓度达到或超过比浊管浓度（一般需2－6小时），浓度约1－2×108CFU/ml；（3）用生理盐水或肉汤校正菌液浓度，与比浊管相同。
可用光电比浊。
目测比浊须在适当光照下以黑色线条为反衬。
5.1.2 直接菌悬液法步骤如下：（1）做常规药敏试验，可直接用过夜培养的菌落（必须用无选择性培养基平板，如普通琼脂培养基）在盐水或肉汤中制备接种菌液。
菌液浓度调至0.5麦氏管；(2)此法适用于在肉汤培养基中生长不好的细菌如嗜血杆菌、淋病奈瑟氏菌和链球菌及葡萄球菌的甲氧苯青霉素或苯唑青霉素的耐药试验；（3）当用此法做复方磺胺药的试验时，从平板上直接挑菌落时会携带相当量的拮抗剂，造成敏感菌株的抑菌环内出现轻微的生长菌膜。
5.2 接种平板步骤如下：（1）校正的菌液须在15分钟内使用。
用一无菌棉试子蘸取菌液并在上端管壁旋转挤压几次，去掉过多的菌液；（2）用试子涂布整个琼脂平板表面，反复涂布几次，每次将平皿旋转60度，保证涂布均匀。
纸片法抑菌试验实验报告
一、实验目的1. 掌握纸片法抑菌试验的基本原理和操作方法。
2. 了解抑菌试验在微生物学研究和临床医学中的应用。
3. 通过实验，学会分析实验结果，为临床用药提供参考。
二、实验原理纸片法抑菌试验是一种常用的微生物学实验方法，用于检测细菌对各种抗生素的敏感性。
其原理是将含有定量抗生素的纸片贴在接种有细菌的琼脂平板上，培养一段时间后，根据抑菌圈的大小判断细菌对相应抗生素的敏感性。
三、实验材料1. 细菌菌种：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等。
2. 抗生素纸片：青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、红霉素等。
3. 琼脂培养基：M-H琼脂培养基。
4. 实验器材：无菌平板、无菌镊子、无菌棉签、酒精灯、游标卡尺等。
四、实验步骤1. 将琼脂培养基融化后，待其冷却至50℃左右，倒入无菌平板中，均匀铺开，待其凝固。
2. 将待检菌接种于M-H琼脂平板上，用无菌棉签均匀涂抹。
3. 待菌液干燥后，用无菌镊子取抗生素纸片，贴在平板上，纸片间距大于24mm。
4. 将平板置于37℃恒温培养箱中培养18-24小时。
5. 观察并测量抑菌圈直径，记录数据。
五、实验结果与分析1. 金黄色葡萄球菌对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、红霉素等抗生素均表现为敏感，抑菌圈直径分别为15mm、12mm、18mm、20mm。
2. 大肠杆菌对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、红霉素等抗生素均表现为耐药，抑菌圈直径分别为0mm、0mm、0mm、0mm。
3. 肺炎克雷伯菌对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、红霉素等抗生素均表现为耐药，抑菌圈直径分别为0mm、0mm、0mm、0mm。
根据实验结果，金黄色葡萄球菌对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、红霉素等抗生素敏感，可作为临床治疗金黄色葡萄球菌感染的首选药物。
大肠杆菌和肺炎克雷伯菌对青霉素、氨苄西林、头孢唑啉、红霉素等抗生素均表现为耐药，需要根据耐药性选择其他抗生素进行治疗。
六、实验讨论1. 纸片法抑菌试验是一种简单、快速、经济的抑菌试验方法，广泛应用于微生物学研究和临床医学中。
纸片扩散法测大肠杆菌对几种抗生素的敏感性(清晰整齐)
纸片扩散法测大肠杆菌对几种抗生素的敏感性1 实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测定菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸取琼脂中的水分，溶解后便不断的向纸片周围区域扩散形成递减的梯度浓度。
在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈。
该抑菌圈表示药物对该种细菌的生长繁殖具有抑制作用。
通过测定抑菌圈的直径大小，可以判定药物的抑菌强弱，抑菌圈直径越大表示药物抑菌作用越强，抑菌圈直径越小表示药物抑菌作用弱，没有抑菌圈表示该药物没有抑菌作用。
并且，经稀释法测得的MIC的对数和用纸片测定相应的菌株得到的抑菌直径之间大致呈直线相关，因此将两种方法相对应地测试各种据菌株所得数据，进行统计学的相关回归分析处理，可得到一条回归线，依此可推断该菌株的MIC，两者呈负相关关系，即MIC 愈小，抑菌圈直径愈大。
2 实验材料2.1 菌液江山大农庄拉稀的猪仔肠道黏膜物中提取的大肠杆菌。
2.2药品链霉素、四环素、多粘菌素B、万古霉素、庆大霉素、红霉素、氨苄青霉素、新霉素、利福平、青霉素、菌必治、羧苄青霉素。
3 实验步骤3.1药敏纸片的准备纸片内抗菌药物含量抗生素纸片浓度U/μg/片抗生素纸片浓度U/μg /片抗生素纸片浓度U/μg /片氨苄青霉素10μg 链霉素10μg 万古霉素30μg 羧苄青霉素100μg 新霉素30μg 多粘菌素B 300U头孢菌素类30μg 庆大霉素10μg 四环素类30μg菌必治30μg 利福平5μg 红霉素15μg3.2细菌的制备从琼脂平板挑取新鲜分离的菌落数个或从保存的斜面上移种至3～5mLMH肉汤培养液中37℃培养2～8h，以待生长至轻微或中等浊度。
为保证药敏试验的准确度和精度，必须对接种菌液的浓度做相应的控制。
因此，将菌液稀释并校正浊度至0.5麦氏标准浓度，稀释时使用无菌肉汤或生理盐水，此时菌液的浓度约为1.5×108个/L。
3.3 接种平板制备好的接种菌液必须在15min内使用。
大肠杆菌药敏试验简易方法材料
大肠杆菌药敏试验简易方法近年来，随着养鸡业的迅猛发展，鸡大肠杆菌病的发病率和死亡率也不断增加，现已成为危害养鸡业（特别是肉鸡）最为重要的疾病之一，为细菌病之首。
因此，广大养鸡户谈之色变，没有比感染病毒病又继发大肠杆菌病更糟糕的了。
正因为如此，抗生素得到了大量广泛的应用，又由于大肠杆菌对抗生素容易产生耐药性，所以大肠杆菌的耐药性问题日益突出。
如何解决这个问题将是畜牧兽医工作者今后工作的重点。
而就目前来说，通过抗菌药物敏感性试验（药敏试验）选择敏感药物对鸡群进行预防和治疗是降低大肠杆菌病发病率和死亡率的有效手段。
标准的药敏试验（纸片扩散法）比较繁琐，要先进行细菌培养，再进行药敏试验，试验设备要求高，基层兽医诊疗机构很难做到，现介绍一种简易药敏试验方法（纸片扩散法［1］）。
1试验方法和步骤1.1试验设备恒温培养箱1台、干燥灭菌箱1台、酒精灯1个、接种棒（带接种环）1个（接种环可用回形针自制）、手术剪1把、镊子1个、普通营养琼脂1瓶、玻璃平皿（直径90mm）数个、烧杯（500ml）1个、玻璃棒1个、普通电炉1台、定性滤纸1盒、蒸馏水适量、生理盐水适量、小玻璃瓶（如链霉素瓶）数个（洗净晾干）、钢笔1支、细针头数个、高压蒸汽灭菌锅（可选）1个、普通天平1台、药勺1个、尺子1个。
1.2普通营养琼脂平皿制备1.2.1平皿消毒将玻璃平皿洗净，晾干。
用干燥灭菌箱120℃灭菌1小时；也可用酒精灯火焰消毒，将玻璃平皿内壁靠近火焰，同时慢慢转动平皿使之均匀受热，待平皿内壁上水珠烤干并发烫为止。
1.2.2琼脂消毒营养琼脂与蒸馏水（或生理盐水）以3g：100ml的比例加入烧杯（先加蒸馏水，后加营养琼脂），用电炉加热同时用玻璃棒搅拌，使营养琼脂溶化均匀。
如有高压蒸汽灭菌锅可将溶化的琼脂液装入生理盐水瓶中（不超过其容量的2/3），瓶口留一通气孔（一般用16号针头刺入瓶盖），将瓶站立放入锅内，加热至121℃保持15分钟即可；如无高压锅可直接用电炉加热至沸腾后立即将烧杯从炉上拿下来，待泡沫消了，再放到炉上，如此煮约20分钟（煮时不断搅拌）。
肠道杆菌实验报告
一、实验目的1. 了解肠道杆菌的基本特征及分类；2. 掌握肠道杆菌的分离、纯化及鉴定方法；3. 掌握肠道杆菌的生化反应及药敏试验；4. 培养实验操作技能，提高微生物学实验水平。
二、实验原理肠道杆菌是一类革兰氏阴性菌，广泛分布于人类和动物肠道中。
根据其生物学特性，可将肠道杆菌分为条件致病菌和非致病菌。
本实验主要针对肠道杆菌的分离、纯化、鉴定及药敏试验进行研究。
三、实验材料1. 标本：粪便、食品、水等；2. 培养基：营养肉汤、营养琼脂、SS琼脂、双糖铁琼脂、克氏双糖铁琼脂等；3. 试剂：革兰氏染色液、吲哚试剂、甲基红试剂、V-P试剂、KCN试剂、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等；4. 仪器：高压灭菌锅、培养箱、显微镜、接种环、试管、锥形瓶等。
四、实验方法1. 标本采集与处理：采集粪便、食品、水等标本，加入无菌生理盐水，充分混匀后取适量接种于培养基。
2. 肠道杆菌分离与纯化：将接种后的培养基置于37℃恒温培养箱中培养24小时，观察菌落生长情况，挑取单个菌落进行纯化。
3. 肠道杆菌鉴定：（1）革兰氏染色：观察菌体形态，判断其为革兰氏阴性菌；（2）生化反应：进行吲哚试验、甲基红试验、V-P试验、KCN试验等，判断细菌能否发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等；（3）药敏试验：采用纸片扩散法，观察细菌对氨苄西林、头孢噻肟、环丙沙星等药物的敏感性。
4. 结果记录与分析：将实验结果进行记录，并进行分析。
五、实验结果1. 肠道杆菌分离与纯化：成功分离出多个肠道杆菌纯培养物。
2. 革兰氏染色：观察到革兰氏阴性菌形态。
3. 生化反应：部分菌株能发酵葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖等。
4. 药敏试验：部分菌株对氨苄西林、头孢噻肟、环丙沙星等药物敏感。
六、实验讨论1. 本实验成功分离出多种肠道杆菌，为后续研究提供了菌种资源。
2. 生化反应和药敏试验结果表明，不同肠道杆菌具有不同的生物学特性，有助于对其进行分类和鉴定。
3. 实验过程中，应注意无菌操作，避免污染。
食品微生物快速检测常用方法-纸片法测大肠菌群.
谢 谢
食品微生物快速检测常用方法纸片法测大肠菌群
目录页
食品营养与检测专业教 学资源库
一
设备和培养基
二
操作步骤
三
结果报告
—
Hale Waihona Puke 过渡页一设备和培养基
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培养箱、天平、均质器或乳钵、试管、1.0mL和 10.0mL吸管、广口瓶或三角瓶、玻璃珠、试管架、溴 甲酚紫TTC培养基。
纸片(纸片制备：定性滤纸，切成10cm×12cm， 叠成5cm×6cm大小的双层纸片，经烘干或高压灭菌后 备用)、塑料袋(为耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，可按实 验要求压合成一定规格，115℃灭菌15min后备用)。
过渡页
一
操作步骤
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1.样品处理 2.接种 3.结果判定
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大 肠
红晕，其周围变黄整个纸片变黄均为阳性。若
菌
所检样品为未经消毒的食(饮)具，纸片结果是全
群
黄且无红色斑点或红晕，可直接列为阳性；如
）
若是已消毒的，应按发酵法做证实试验或加pH
7.4的无菌PBS溶液证实，以免误判。
过渡页
一
结果报告
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根据纸片的阳性片数，查大 肠菌群MPN检索表，报告。
样品处理
（纸
液体样品按国标乳糖发酵法进行；固体样
片
品取25g，研碎加入225mL灭菌生理盐水混匀。
法
测
大
肠
菌
群
）
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接种
（纸
液体样品吸取3个1mL分别涂布于3张纸片，再
实验十四 纸片法测定五种抗生素对大肠杆课件
五 结果
抑菌圈直径的测定
20g、蒸馏水1000mL)。
(2) 营养肉汤按常规方法制备(牛肉膏3g、 蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL) 。
操作步骤
2.菌悬液的制备 3.抑菌活性的测定
四 操作步骤
4.测定抑菌圈直径 抑菌强度判定标准：无抑菌圈者为抗药，
记为“- ”；抑菌圈直径小于10mm者为耐药， 记为 “+”；在10~15mm者为中度敏感，记 为 “++”；在15~20mm者为高度敏感，记为 “+++” ；大于20mm者为极敏感，记为 “++++”。
三 实验器材与仪器
3.仪器和其他用具 ：高压蒸汽灭菌锅、生化 培养箱、无菌工作台、显微镜、平皿、三 角烧瓶、酒精灯、烧杯、移液管、镊子、 试管、胶头滴管、涂布棒、移液枪、游标 卡尺。
四 操作步骤
1.培养基的制备
(1) 营养琼脂按常规方法制备营养琼脂平板 (牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂
实验十四
纸片法测定五种抗生素对 大肠杆菌的抑制效果实验
一 目的要求
对四种抗生素对大肠杆菌的抑制效果进行 比较，掌握抑菌实验中的纸片法操作过程。
二 基本原理
随着抗生素的广泛使用，大肠杆菌对抗 生素药物的耐药性逐渐增强。了解大肠杆 菌(革兰氏阴性菌)对抗生素药物的敏感 程度，对微生态制剂的研究及临床用药具 有指导作用。本实验结果表明青霉素对大 肠杆菌有抑菌作用，但是作用不大且易出 现耐药性，出现不敏感。而其他四种抗生 素对革兰氏阴性杆菌作用强，出现敏感性。
大肠菌群快检纸片法3文档
大肠菌群快检纸片法在卫生细菌学检测中，大肠菌群快速检测纸片法(简称纸片法)，因其操作简便、快速、敏感、省料、结果易判断等特点，早已被西方发达国家所采用。
1980年Lukgantseve就有成功报道，随后Barlt( 1984)、Ratto(1989)、Castillo(1994)也有报道，尽管它们所用检测纸片各不相同，但均有满意的结果。
我国从80年代开始研制，90年代已被广泛应用，并作为国家认可的方法，已列入国标GB14934 -940(1)原理。
快检纸片法是以大肠菌群细菌生长发育时分解乳糖产酸，同时产生脱氢酶脱氢，氢与无色氯化三苯四氮唑(TTC)作用形成红色三苯甲臜( Fonnazane)使菌落(菌苔)变红的原理，将一定量的乳糖、指示剂(TTC)、溴甲酚紫，蛋白质等吸附在特定面积的无离滤纸上，大肠菌群细菌通过上述两种指示剂显示出发酵乳糖产酸，纸片变黄和形成红色斑点(红晕)的固有特性。
现行国家标准(GB14934 -94)也以此特性作为阳性结果的唯一判定标准。
(2)影响检测结果的因素酶的影响;大肠菌群菌量的影响;培养时间的影响。
(3)纸片法的评价。
大肠菌群纸片法具有操作简便，报告时间短(15 -18h)，特异性强，敏感性高，费用较低等优点，适合各地实验室推广使用。
Petrifilm纸片法检测大肠菌群(1)原理。
PF试纸是一种制备完成的培养基系统，以一层亲水性的吸附物质作为培养基质，含有测试菌生长所需的营养物，还加入了染色剂、显色剂，增强了菌落的目视效果。
(2)优点。
PF试纸法与国标法比较，省却了繁重的准备、收尾工作;体积轻巧、便于携带;操作简单、快速省时。
另外避免了热琼脂法不适宜受损细菌恢复的缺陷。
在大肠菌群的检测方面，国标方法报告的是MPN值而不是每克食品中的大肠菌群数，而PF法则可以得出精确数据，但是否准确尚需进一步研究。
同时PF试纸法还可区分大肠菌群中的大肠杆菌(蓝色产气)和非大肠杆菌(红色产气)。
实验四__抗生素抗菌谱测定
耐药性产生的原因主要有：产生一种使药物 失去活性的酶；把药物作用的靶位加以修饰 和改变；使药物不能透过细胞膜；通过主动 外排系统把进入细胞内的药物泵出细胞外；
实验材料
菌种：
大肠杆菌。
培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基
供试抗生素：
庆大霉素、卡那霉素、四环素、氨苄青霉素、壮 观霉素和链霉素、无菌水
设备与用具：
不同抗生素抑制细菌生长的机制不同，如 青霉素抑制细菌细胞壁的合成，而四环素 抑制细菌蛋白质的合成。
实验材料
菌种：
各种不同来源的细菌。
培养基：
牛肉膏白胨培养基
供试抗生素：
四环素（母液浓度50mg/mL，溶于水)
设备与用具：
恒温培养箱、接种环、培养皿。
实验步骤
1 倒（牛肉膏蛋白胨＋25mg/L四环素）平板 2 将平板(皿底）划分为6等份，每一等份内标明一种细 菌的名称； 3 用接种环分别接种不用来源的细菌至相应的区域
3 将平板(皿底）划分为6等份，每一等份内标明一种抗 生素的名称；分别将浸有各种抗生素的小圆滤纸片贴 在平板的每一等份中。
4 将贴好滤纸片的含菌平板，置37℃倒置培养24-48h。
5 测量并记录抑菌圈的直径，抑(杀)菌圈的大小，能够 反映抗生素抑(杀)菌能力的大小；根据其直径的大小， 可初步确定大肠杆菌对各种抗生素的耐药性情况 (或 敏感性情况)(自带尺子）
恒温培养箱、镊子、圆滤纸片、培养皿。
滤纸片法测定微生物的耐药性
所需浓度抗生素溶液配制
A 氨苄青霉素（50μg/mL) ，
B 卡那霉素（50μg/mL) ，
C 四环素（5μg/mL) ，
D 氯霉素（50μg/mL) ，
E 链霉素（50μg/mL) ，
纸片法与培育发酵法检测大肠菌群结果对照分析
纸片法与培育发酵法检测大肠菌群结果对照分析关键词：纸片法;大肠菌群;灵敏度;特异度摘要:目的探讨改良纸片法检测大肠菌群的判定标准。
方式对纸片法检测大肠菌群的纸片反映结果状况进行详细记录后，将纸片以无菌操作转入单料乳糖胆盐发酵管中，用发酵法来证明其大肠菌群的阴阳性结果，再作统计分析。
结果按GB14934-94判定纸片法大肠菌群的阴阳性，其灵敏度为%，特异度为%;假设按作者提出的标准进行判定，其灵敏度为%，特异度为%。
二者比较灵敏度有显著性不同（P<）。
消毒剂的残留可能是致使纸片法结果判定出误差的要紧缘故。
结论据本实验结果分析，建议改良和完善纸片法大肠菌群的判定标准，以更准确地反映大肠菌群检出的真实情形。
关键词:纸片法;大肠菌群;灵敏度;特异度.Abstract:，%%，basedonthestandardproposedbytheauthor，%%，（P<），Keywords:Slipmethod;;Specificity;Sensitivity纸片法检测大肠菌群（简称纸片法，下同），1994年被正式列入餐（饮）具消毒成效监测的国家标准［1］（下称国标或GB）。
随后，纸片法被各级疾病预防操纵中心卫生查验普遍利用，它以经济、方便、快捷等优势给现场监测带来了极大的便利，不但节省了大量人力、物力，而且还扩大监测覆盖面提供了技术保障。
但在这几年的实践体会中，发此刻纸片法的结果观看中显现许多与国标中明示的结果判定不一致的情形。
为此，于2004年1～6月间对江门市区餐具、茶具监测的581份标本采纳纸片法和培育发酵法（下称发酵法）进行大肠菌群检测平行对如实验研究，现将结果分析报告如下。
1材料与方式材料大肠菌群纸片由深圳市博卡生物技术提供;乳糖胆盐发酵液、乳糖复发酵液、伊红美蓝培育基（EMB）和革兰氏染液均由杭州天和微生物试剂生产。
以上培育基和试剂均在有效期内利用。
实验样品包括碗、盘、筷、汤勺等餐具，均来源于我市各大中小型餐厅。
食品微生物快速检测常用方法-纸片法测大肠菌群(精)
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过渡页 结果报告
一
根据纸片的阳性片数，查大 肠菌群MPN检索表，报告。
Hale Waihona Puke 谢食品营养与检测专业教学资源库
结果判定 ︵
纸 片 法 测 大 肠 菌 群
︶
阴性结果：纸片保持紫蓝色不变，无论有否色 斑点或红晕均为阴性； 阳性结果及可疑现象：纸片上呈现红色斑点或 红晕，其周围变黄整个纸片变黄均为阳性。若 所检样品为未经消毒的食(饮)具，纸片结果是全 黄且无红色斑点或红晕，可直接列为阳性；如 若是已消毒的，应按发酵法做证实试验或加pH 7.4的无菌PBS溶液证实，以免误判。
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过渡页 操作步骤
一
1.样品处理 2.接种 3.结果判定
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样品处理 ︵
纸 片 法 测 大 肠 菌 群
液体样品按国标乳糖发酵法进行；固体样 品取25g，研碎加入225mL灭菌生理盐水混匀。
︶
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接种 ︵
纸 片 法 测 大 肠 菌 群
食品微生物快速检测常用方法纸片法测大肠菌群
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设备和培养基
操作步骤 结果报告
二
三
—
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设备和培养基
一
食品营养与检测专业教 学资源库
培养箱、天平、均质器或乳钵、试管、1.0mL和 10.0mL吸管、广口瓶或三角瓶、玻璃珠、试管架、溴 甲酚紫TTC培养基。 纸片(纸片制备：定性滤纸，切成10cm×12cm， 叠成5cm×6cm大小的双层纸片，经烘干或高压灭菌后 备用)、塑料袋(为耐高温的聚丙烯塑料薄膜袋，可按实 验要求压合成一定规格，115℃灭菌15min后备用)。
肠杆菌科纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程
肠杆菌科纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程1．目的规范肠杆菌科细菌纸片扩散法药物敏感试验标准操作规程，确保药敏结果的准确。
2．适用范围本操作规程适用于肠杆菌科细菌。
3．选药原则在本规程所列受试抗菌药物主要根据以下因素选择。
3.1现行版本的CLSI M02和M100对肠杆菌科细菌纸片扩散法药物敏感试验的要求。
3.2细菌耐药监控网每年发布的监控要求。
3.3本单位上一年度假单胞菌属细菌耐药监控数据。
4．质控用大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218（用于β-内酰胺/β-内酰胺抑制剂合剂）进行质量控制，质控菌株可接受的抑菌圈范围参见现行版本的CLSIM100-A19。
质控频率参见《药物敏感性试验标准操作规程》。
5．材料和仪器M-H培养基，无菌生理盐水，药敏纸片，无菌棉签，35℃孵育箱，测量尺，标准比浊管或比浊仪。
6．操作步骤参见《药物敏感性试验标准操作规程》。
7．判断标准见表5-45.表5-45 肠杆菌科细菌纸片扩散试验判断标准判断标准（mm）药敏纸片备注敏感中介耐药氨苄西林（10µg）≥17 14~16 ≤13 参见结果解释哌拉西林（100µg）≥21 18~20 ≤17氨苄西林/舒巴坦（10/10µg）≥15 12~14 ≤11哌拉西林/他唑巴坦（100/10µg）≥21 18~20 ≤17头孢唑林（30µg）≥18 15~17 ≤14头孢克洛（30µg）≥18 15~17 ≤14头孢呋辛（30µg）≥18 15~17 ≤14头孢噻肟（30µg）≥23 15~22 ≤14 参见结果解释头孢他啶（30µg）≥18 15~17 ≤14 参见结果解释头孢吡肟（30µg）≥18 15~17 ≤14头孢他啶/克拉维酸（30/10µg）参见结果解释头孢噻肟/克拉维酸（30/10µg）参见结果解释亚胺培南（10µg）≥16 14~15 ≤13 参见结果解释美罗培南（10µg）≥16 14~15 ≤13 参见结果解释阿米卡星（30µg）≥17 15~16 ≤14 参见结果解释庆大霉素（10µg）≥15 13~14 ≤12 参见结果解释环丙沙星（5µg）≥21 16~20 ≤15 参见结果解释左氧氟沙星（5µg）≥17 14~16 ≤13 参见结果解释复方新诺明（1.25/23.75µg）≥16 11~15 ≤10 参见结果解释呋喃妥因（300µg）≥17 15~16 ≤14头孢哌酮/舒巴坦（75/75µg）≥21 16~20 ≤158．注意事项8.1抑菌圈直径量取的范围为包括药敏纸片在内的被药物完全抑制的区域（肉眼判断）。
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（牛肉膏3g、蛋白胨10g、氯化钠5g、琼脂
20g、蒸馏水1000mL）。
(2) 营养肉汤按常规方法制备（牛肉膏3g、
蛋白胨10g、氯化钠5g、蒸馏水1000mL）。
四 操作步骤
2.菌悬液的制备
3.抑菌活性的测定
四 操作步骤
4.测定抑菌圈直径 抑菌强度判定标准：无抑菌圈者为抗药， 记为“-”；抑菌圈直径小于10mm者为耐药， 记为“+”；在10～15mm者为中度敏感，记 为“++”；在15~20mm者为高度敏感，记为 “+++”；大于20mm者为极敏感，记为
实验十四
纸片法测定五种抗生素对 大肠杆菌的抑制效果实验
一 目的要求
对四种抗生素对大肠杆菌的抑制效果进行
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
比较，掌握抑菌实验中的纸片法操作过程。
二 基本原理
随着抗生素的广泛使用，大肠杆菌对抗 生素药物的耐药性逐渐增强。了解大肠杆 菌（革兰氏阴性菌）对抗生素药物的敏感 程度，对微生态制剂的研究及临床用药具 有指导作用。本实验结果表明青霉素对大 肠杆菌有抑菌作用，但是作用不大且易出 现耐药性，出现不敏感。而其他四种抗生 素对革兰氏阴性杆菌作用强，出现敏感性。
三 实验器材与仪器
1.药品：庆大霉素、头孢菌素、四环素、链 霉素的滤纸片和青霉素的滤纸片。 2.菌种：大肠杆菌
三 实验器材与仪器
3.仪器和其他用具 ：高压蒸汽灭菌锅、生化 培养箱、无菌工作台、显微镜、平皿、三 角烧瓶、酒精灯、烧杯、移液管、镊子、 试管、胶头滴管、涂布棒、移液枪、游标 卡尺。
四 操作步骤
“++++”。
四 操作步骤
抑菌圈
五 结果
抑菌圈直径的测定