同源重组的基因敲除-生物化学与分子生物学

3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进 化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效 特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上 由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过 程也可以用于基因敲除。
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵 裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合 到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
1、微生物中的基因转移
转化
转导
接合
溶原性转换
原生质体融合
2、植物转基因技术
农杆菌介导转化法：根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti 质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入 细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
基因枪介导转化法：利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被 称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中。
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了 卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们 是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
Pseudomonas stutzeri 1317, were expressed in the mutant strains to test the PhaC enzyme substrate specificity. The result showed P. putida KTOY01 or KTOY02 could provide not only mcl PHA monomers but also 3-hydroxybutyrate from fatty acids, which may allow the production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA). Plasmid pCJY10 containing phaC2Ps, phbA, and phbB genes encoding PHA polymerase, b-ketothiolase, and acetoacetyl-CoA reductase, respectively, were transformed into P. putida KTOY01 and KTOY02. Shake-flask culture showed P. putida KTOY01 or KTOY02 (pCJY10) could accumulate poly(3HB-co-mcl 3HA) from glucose. The above result showed pha operon knockout mutant of P. putida KT2442 was a very useful host of great potential not only for studying PhaC synthase, but also for microbial production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA), which is very difficult to abtain.
转基因和基因敲除技术介绍
张 晓 军 刘 杰 魏 岱 旭
主要内容
转基因技术 基因敲除技术 文献

一、转基因（Transgenesis）技术
定义：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中， 由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的 技术
微生物中的基因转移 植物转基因技术 动物转基因技术
1． 利用基因同源重组进行基因敲除
应用最为广泛
其具体的原理和应用将在后面重点介绍
2.利用随机插入突变进行基因敲除 ——基因捕获法
利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因 载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携 带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获 得相应的基因敲除细胞。
实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因
phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特 异性
运用原理：同源重组的基因敲除
பைடு நூலகம் Abstract
Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chainlength poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from