同源重组的基因敲除-生物化学与分子生物学
Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用
Red同源重组在大肠杆菌基因敲除中的应用吕沈聪;赵颖颖;钟卫鸿【摘要】大肠杆茵基因敲除技术发展迅速,各种新型技术的出现使得其基因组的改造较以往更为快速、简单,尤其是Red同源重组技术在大肠杆菌基因敲除中的应用已经越来越成熟.综述了几种不同的Red同源重组技术,并分析了每种方法的原理及操作策略,指出了各种方法的特点及优势.%Gene knockout technique of Escherichia coli is developing rapidly.Emerging of various kinds of new technologies has simplified the genome modification of E.coli than before.Especially,the Red homologous recombination system becomes more and more mature in gene knockout of E.coll.In this article,a few different kinds of Red homologous recombination technologies were reviewed.The mechanism and application strategies of each method were analyzed with its characteristics and superiority highlighted.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2013(030)006【总页数】6页(P1-6)【关键词】大肠杆菌;Red同源重组;基因敲除【作者】吕沈聪;赵颖颖;钟卫鸿【作者单位】浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032;浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江杭州 310032【正文语种】中文【中图分类】Q78随着多种细菌基因组测序工作的完成，获得了大量的分子遗传学信息。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
生物化学及分子生物学(人卫第八版)-第22章-基因结构与功能分析
目录
第一节 基因结构分析技术
目录
一、基因一级结构解析技术
基因的一级结构是指脱氧核苷酸的排列 顺序，解析一级结构最精确的技术就是DNA
测序（DNA sequencing）。
目录
目录
3. 用原位杂交进行RNA区域定位 原位杂交（ ISH ）是通过设计与目标 RNA
碱基序列互补的寡核苷酸探针，利用杂交原理
在组织原位检测 RNA 的技术，其可对细胞或组 织中原位表达的 RNA 进行区域定位，同时也可 作为定量分析的补充。
目录
（二）用PCR技术检测RNA表达水平
1. 用逆转录PCR进行RNA的半定量分析 逆转录 PCR （ RT-PCR ）一般用于 RNA 的 定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测 RNA样品进行半定量分析。 2. 用实时定量PCR进行RNA的定量分析 实时定量 PCR 是定量分析 RNA 的最通用、 最快速、最简便的方法，该方法是对 PCR 反应 进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。
目录
2. 预测启动子的其他结构特征
启动子区域的其他结构特征包括 GC 含量、 CpG 比 率、转录因子结合位点、碱基组成及核心启动子元件等。 用 于 启 动 子 预 测 的 数 据 库 ： EPD （ eukaryotic promoter databases ）数据库，主要预测真核 RNA 聚合
目录
（1）用核酸酶进行足迹分析
酶 足 迹 法 （ enzymatic footprinting ） 是利用 DNA 酶处理 DNA蛋白质复合物，然后通过 电泳分析蛋白质结合序列。 常用的酶有 DNA 酶 I （ DNase I ）和核酸外切 酶III。
浅谈“基因敲除”
浅谈“基因敲除”作者：吕飞来源：《中学生物学》2010年第09期摘要鉴于近年来基因敲除频繁地出现在高中生物教材和试题中，又基于基因敲除与基因工程的联系以及基因敲除的广泛的应用价值，对基因敲除作了简单的探讨。
关键词基因敲除基因工程转基因技术中图分类号Q-49文献标识码 E科学界曾预言，21世纪是一个基因工程世纪。
所谓基因工程(转基因技术)，又称基因拼接技术或DNA重组技术，诞生于20世纪70年代，是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达。
“基因敲除”是在20世纪80年代悄然诞生并发展起来的一项重要的分子生物学技术，字面上看与转基因相反，认为转基因技术是导入某个基因，而基因敲除是切除某个基因，实质上并不是如此简单，很大程度上，基因敲除和转基因技术有相似性，转基因技术的原理是基因重组，而基因敲除主要也是应用DNA同源重组原理。
1“基因敲除”在高中生物教材中的出现浙科版教材，选修三《现代生物科技专题》一书的第52页中第二段第二行，出现了“基因敲除”四个字，书本原话：“胚胎干细胞可以进行基因敲除，获得基因敲除动物，如用基因敲除手段可以获得适合人体移植的猪器官，减弱或消除排斥反应。
”2基因敲除的概述及方法2.1基因敲除概述基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种定点修饰基因组的新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，其与体细胞核移植技术的成功结合，已经成为一种有效的定点修饰、改造大动物基因组DNA片段的实验策略。
或者说基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰、改造染色体上某一基因的目的的一种技术。
它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。
20世纪80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养试验的成功奠定了基因敲除的技术基础。
分子生物学名词解释
RFLP：个体之间DNA的核苷酸序列存在差异，称为DNA多态性。
由于碱基组成的变化而改变了限制性内切酶的酶切位点，从而导致相应的限制性片段的长度和数量发生变化，称为RFLP。
翻译：是指在多种因子辅助下，由tRNA携带并转运相应氨基酸，识别mRNA上的三联体密码子，在核糖体上合成具有特定序列多肽链的过程，称为翻译。
突变: DNA的结构发生永久性改变，即突变.转化：通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
转导：当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来、再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为转导作用。
受体：是细胞膜上或细胞内能识别外源化学信号并与之结合的成分，其化学本质是蛋白质，个别糖脂。
粘粒：又称柯斯质粒，是一类由人工构建的含有λDNA 粘性末端cos序列和质粒复制子的杂种质粒载体。
它是为克隆和增殖真核基因组DNA的大区段而设计的，是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。
质粒：是存在于细菌染色体外的、具有自主复制能力的环状双链DNA分子。
端粒：以线性染色体形式存在的真核基因组DNA末端都有一种特殊的结构叫端粒。
该结构是一段DNA序列和蛋白质形成的一种复合体，仅在真核细胞染色体末端存在。
端粒DNA由重复序列组成，人类端粒一端是TTAGGG另一端是AATCCC.克隆：通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
探针：用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”。
转录：以DNA为模版，由DNA依赖的RNA聚合酶（RNApol）催化4中NTP聚合，生成RNA 的过程。
增强子：其含有多个作用原件，可以特异性地与转录因子结合，增强基因的转录活性的段短DNA序列。
启动子：能被RNA聚合酶特异性识别并与其结合，启动转录的DNA序列。
操纵子:由功能相关的一组基因在染色体上串联，共同构成的一个转录单位。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
1. 同源重组在G+球菌基因敲除中的运用
同源重组在细菌基因敲除中的运用
• 基因功能研究方法
– 计算机预测基因功能 – 基因失活
• 基因敲除knock out • 转座子插入突变 • 反义RNA技术（RNA沉默）：knock down
– 基因过表达（over-expression） – 酵母双杂交（yeast two-hybridization）
细菌的生物学特点
• • • • • 个体微小 结构简单：单细胞生物 易于培养 繁殖快：代时仅20-30min 具有一条染色质（无内含子），单倍型
• 细菌是生命科学研究重要的模式生物
细菌的遗传变异现象
• 遗传（heredity): 子代与亲代之间生物学 性状具有相似性。使细菌的性状保持相对 稳定，且代代相传，使其种属得以保存。 • 变异(variation)：在一定条件下，若子代 与亲代或子代与子代之间的生物学性状出 现差异。变异使细菌产生变种和新种，以 利于细菌的生存及进化。
表皮葡萄球菌saeRS敲除
4. 运用pKOR1质粒敲除G+球菌基因
Map of pKOR1
pKOR1质粒特点
• A replacement plasmid that employs antisense secY RNA expression (secY expression are essential for bacterial growth and survival) for counter-selection （obviated the need for antibiotic marker selection） • The lambda recombination cassette (Invitrogen) is another feature of pKOR1 that permits rapid cloning of mutant alleles without the use of restriction enzymes and ligases
基因敲除
基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
同源重组的基因敲除
3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进 化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效 特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上 由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过 程也可以用于基因敲除。
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵 裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合 到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了 卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们 是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授
代谢工程试题答案
1.微生物代谢工程定义、研究内容和研究手段。
（1）定义：代谢工程是利用重组DNA技术或其他技术,有目的地改变生物中已有的代谢网络和表达调控网络,以更好地理解细胞的代谢途径,并用于化学转化、能量转移及大分子装配过程。
（2）研究内容：生物合成相关代谢调控和代谢网络理论；代谢流的定量分析；代谢网络的重新设计；中心代谢作用机理及相关代谢分析；（3）研究手段:代谢工程综合了基因工程、微生物学、生化工程等领域的最新成果。
①基因操作技术：在代谢工程中，代谢网络的操作实质上可以归结为基因水平上的操作：涉及几乎所有的分子生物学和分子遗传学实验技术，如基因和基因簇的克隆、表达、调控，DNA 的杂交检测与序列分析，外源DNA的转化，基因的体内同源重组与敲除，整合型重组DNA 在细胞内的稳定维持等。
②分析手段：组学技术(X-omics)：工业微生物基因组测序与功能基因组分析；基于基因芯片的转录组学分析；蛋白质组学技术；基于同位素技术的代谢通量组学。
③检测技术：常规的化学和生物化学检测手段都可用于代谢工程的研究，如物料平衡、同位素标记示踪法、酶促反应动力学分析法、光谱学法、生物传感器技术。
2.代谢改造思路和代谢设计原理。
（1）代谢改造思路：代谢工程研究的重点在于改造代谢网络，以便生产特定目的代谢产物或具有过量生产能力的工程菌应用于工业生产。
根据微生物的不同代谢特性，常采用改变代谢流、扩展代谢途径和构建新的代谢途径三种方法。
a改变代谢途径的方法：加速限速反应，增加限速酶的表达量，来提高产物产率。
改变分支代谢途径流向，提高代谢分支点某一分支代谢途径酶活力，使其在与其它的分支代谢途径的竞争中占据优势，从而提高目的代谢产物的产量。
b扩展代谢途径的方法：在宿主菌中克隆和表达特定外源基因，从而延伸代谢途径，以生产新的代谢产物和提高产率。
扩展代谢途径还可使宿主菌能够利用自身的酶或酶系消耗原来不消耗的底物。
c转移或构建新的代谢途径：通过转移代谢途径、构建新的代谢途径等方法来实现。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
基因敲除
1(CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 是细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。
CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。
刚刚发表在《科学》（Science）（2013年,1,3）的两篇文章，证明Cas9系统 能在293T, K562, iPS等多种细胞中，进行有效的靶向酶切，非同源重组（NHEJ）、同源重组 （HR）效率在3-25%之间，与TALEN酶切效果相当。
文章还证明，多个靶点可以同时进行靶向酶切。
这些工作将进一步靶向基因操纵推向高潮，使得多个基因敲除、敲入变得更为简单、高效。
虽然目前，大家对该技术的特异性，免疫原性还了解甚少，但是随着研究的不断深入，一定会有很大的改善。
在未来的2-3年，动植物育种、干细胞定向分化、遗传疾定点修复等等都将得到迅猛的发展。
图1. RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统唯尚立德已经利用CRISPR/Cas9在斑马鱼，哺乳动物细胞上成功实现基因敲除和基因敲入，现推出如下技术服务：1. 应用CRISPR /Cas9提供稳定细胞系靶向基因敲除、敲入技术服务；2. 应用CRISPR /Cas9提供模式生物靶向基因技术服务，包括小鼠，大鼠，斑马鱼等；近几十年来，随着全基因组测序技术的不断成熟，我们在各种细菌和古细菌（archaea）中也陆续发现了很多成簇的、规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences，即CRISPR序列，这就是二十多年前日本科学家发现的那个序列）和CRISPR相关基因（CRISPR-associated genes, Cas gene）。
研究发现，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，说明这套CRISPR–Cas系统很有可能是生物体抵御病毒等外来入侵者的一套特异性防御机制，就好像是另外一套适应性免疫反应系统（adaptive immune system）。
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法
利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法基因敲除是一种使特定的基因失活或缺失的技术，它可以用来研究基因的功能和表型。
基因敲除的一种常用方法是利用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
然而，这种方法并不总是有效，有时候细胞会利用非同源末端连接机制来修复DNA双链断裂，从而导致不可预测的突变或损伤。
本文将介绍利用同源重组和非同源末端连接实现基因敲除的原理和方法，以及它们的优缺点和影响因素。
同源重组同源重组是一种利用未受伤的姐妹染色单体或者人工提供的供体模板作为修复模板的方式，它可以保持基因组的完整性和稳定性。
同源重组主要发生在S期或G2期，当细胞有两份相同或相似的染色单体时。
同源重组的步骤如下：•首先，细胞需要将双链断裂的末端进行修剪，产生3’单链DNA（ssDNA），这个过程需要MRN复合物（由Rad50、Mre11和Nbs1组成）和转录因子CtIP（CtBP-interacting protein）等蛋白质的参与。
•然后，ssDNA被复制蛋白A（Replication protein A，RPA）包被，使其免受核酸酶的降解，并去除二级结构。
•接着，由BRCA2蛋白介导，RPA被重组酶RAD51替换，形成核蛋白丝寻找姐妹染色单体上或供体模板上的同源序列。
•最后，RAD51蛋白介导侵入DNA双链模板，并与同源DNA序列配对形成D-Loop结构，D-Loop延伸或与另一个末端连接，完成修复过程。
利用同源重组实现基因敲除的方法是设计一个与目标基因有一定同源性但也有一些差异的供体模板，比如在其中插入了一个标记基因或者删除了一个关键片段。
这样，当细胞利用同源重组机制来修复双链断裂时，供体模板会与双链断裂的末端配对，并将修改过的目标基因整合到细胞基因组中，从而达到基因敲除的目的。
利用同源重组实现基因敲除的优点是可以精确地替换或插入目标基因，不会引入额外的突变或缺失。
基因敲除
基因敲除一、基因敲除简介基因敲除是上个世纪90年代出现的最新外源DNA导入技术。
基因敲除是基因打靶技术的一种，类似于基因的同源重组。
指外源DNA与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组，从而代替受体细胞基因组中的相同/相似的基因序列，整合入受体细胞的基因组中。
此法可产生精确的基因突变，也可正确纠正机体的基因突变。
二、基因敲除的方法及原理1．利用基因同源重组进行基因敲除：是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如：neo基因）的载体上，成为重组载体。
将重组载体通过一定的方式（如显微注射）导入同源的胚胎干细胞（EScell）中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因中相应的部分发生同源重组。
将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
动物的重组概率为10-2~10-5，植物的概率为10-4~10-5，如何从众多细胞中筛出真正发生了同源重组的胚胎干细胞非常重要。
目前常用的方法是正负筛选法(PNS法)，标记基因的特异位点表达法以及PCR 法。
其中应用最多的是PNS法。
通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进而了解目的基因变化前后对小鼠的生物学形状的改变，达到研究目的基因的目的。
由于同源重组常常发生在一对染色体上中一条染色体中,所以如果要得到稳定遗传的纯合体基因敲除模型，需要进行至少两代遗传。
例题(18分）1. 基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，下图是基因敲除技术之一的示意图：该技术的主要步骤及应用如下：（1）第一步是构建打靶载体，把2个标记基因（新霉素抗性基因neo和单纯疱疹病毒胸苷激酶基因HSV - TK）插入到含目的基因（与待敲除的基因同源）的载体中，使目的基因__________。
（2）第二步是将打靶载体通过________________技术导入ES细胞中，失活的目的基因替换ES细胞染色体上待敲除的基因，以达到基因敲除的目的。
同源重组双交换原理基因敲除
同源重组双交换原理基因敲除一、同源重组原理同源重组是指两个染色体上的相同区域发生交换，交换的两个染色体必须来自于同一个亲本。
同源重组是常见的染色体遗传现象之一。
1.1 同源染色体同源染色体是指来自不同亲本但具有相似基因序列的两条染色体，它们在大小、形态和基因排列方面都相似。
人类有23对同源染色体。
1.2 交叉互换交叉互换是指发生在同源染色体上的交换现象。
在减数分裂中，配子形成前，同源染色体间会发生互换，使得每个配子都包含来自母本和父本的遗传物质。
1.3 同源重组原理在减数分裂中，当两条同源染色体上的相似区域发生交叉互换时，就会产生新的组合形式。
这种现象被称为同源重组。
二、双交换原理双交换原理是指在一对杂合子中，如果两个位点A和B位于不同的染色体上，则它们之间存在独立分离和随机联合关系。
这意味着，位于不同染色体上的两个基因在遗传过程中是相互独立的。
2.1 杂合子杂合子是指一个个体拥有两个不同等位基因的情况。
例如，在人类中，如果一个人的父母分别是Aa和Bb，则该人就是AB杂合子。
2.2 独立分离独立分离是指在一对杂合子中，两个位点A和B之间的遗传关系是相互独立的。
例如，在一个AaBb杂合子中，位于不同染色体上的A和B基因会随机分配到不同的配子中。
2.3 随机联合随机联合是指在一对杂合子中，两个位点A和B之间的遗传关系是随机组合的。
例如，在一个AaBb杂合子中，由于A和B基因在遗传过程中相互独立，所以会出现AB、Ab、aB和ab四种可能性。
三、基因敲除基因敲除是指通过技术手段使得特定基因失去功能或被删除。
这种技术可以用来研究特定基因在生物体发育、生长、代谢等方面所起到的作用。
3.1 RNA干扰技术RNA干扰技术是一种常见的基因敲除技术。
它是通过引入特定的RNA 分子，来抑制目标基因的表达。
RNA干扰技术可以用于研究基因在生物体发育、生长、代谢等方面所起到的作用。
3.2 CRISPR-Cas9技术CRISPR-Cas9技术是一种新兴的基因编辑技术。
red同源重组基因敲除原理与步骤
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同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除原理
同源重组基因敲除是一种基因编辑技术，用于通过删除特定基因的方法来研究该基因的功能。
该技术依赖于同源重组（homologous recombination）的原理，即通过引入一个与目标基因相似但存在缺陷的DNA片段，使其与目标基因发生交换，从而使目标基因的序列被“剪除”。
同源重组基因敲除的过程可以简单概括为以下几个步骤：
1. 构建敲除基因载体：首先，需要构建一种含有目标基因的缺陷的 DNA 片段的敲除基因载体。
这个载体通常包括两个关键
部分：一个能够与目标基因进行同源重组的“同源臂”，以及一个“筛选标记”以区分带有敲除基因的细胞。
2. 转染细胞：将敲除基因载体导入目标细胞中。
这可以通过多种方法实现，如基因枪、电穿孔或病毒介导等。
3. 同源重组：在目标细胞内，敲除基因载体中的同源臂与目标基因的相应部分发生同源重组，并在此过程中将缺陷的片段插入到目标基因的位置。
4. 筛选转基因细胞：为了筛选那些已经发生同源重组的细胞，通常会在敲除基因载体中加入一个筛选标记，如抗生素的抗性基因。
只有那些发生重组的细胞才能生存下来，因为它们可以在含有相应抗生素的培养基上生长。
通过同源重组基因敲除技术，可以实现有针对性地敲除特定基
因的目的。
这种方法广泛应用于功能基因组学研究，为我们理解基因的功能和相互作用提供了重要的工具。
基因敲除同源重组方法
基因敲除同源重组方法
哇塞，基因敲除同源重组方法，这可真是个超厉害的生物技术手段呢！
首先来说说它的步骤和注意事项哈。
一般呢，先得设计针对目标基因的同源臂，这就像是给基因做手术准备的精准工具。
然后把这些同源臂和筛选标记等构建到载体上，就像给工具找个合适的盒子装起来。
接着把这个载体导入到细胞中，让它们去发挥作用。
这里要注意载体的质量和导入的效率哦，可不能马虎。
在筛选的时候也要仔细，确保得到的是真正敲除了目标基因的细胞。
再说说这个过程中的安全性和稳定性。
其实啊，只要操作规范，安全性还是挺高的。
就像走在一条规划好的路上，只要不偏离轨道，就不会出大问题。
而且这个方法的稳定性也不错，一旦成功敲除，一般都能稳定遗传下去呢，这多让人放心呀！
那它的应用场景和优势可就多啦！可以用来研究基因的功能，这就好比是揭开基因这个神秘宝库的钥匙。
还能用于疾病模型的建立，为治疗疾病提供重要的线索和依据。
它的优势就是准确性高呀，能精确地敲除目标基因，这可太牛了！
比如说在癌症研究中，通过基因敲除同源重组方法，科学家们成功地研究了某些与癌症发生发展密切相关的基因，为癌症的治疗找到了新的方向。
这效果，简直太棒啦！
我觉得基因敲除同源重组方法真的是生物技术领域的一颗璀璨明星呀！它为我们探索生命的奥秘、解决疾病难题提供了强大的工具和手段，让我们对未来充满了希望！。
同源重组的基因敲除
RECOMBINATION
第一次重组
A、B为一段DNA序列，并非是基因
A
A1 A2
目的基因
B
a1
a2
a
构建质粒 b
A1
a2
b
a1
A2
目的基因
B
第二次重组的第一种情况 A1 a2
b
a1
A2
目的基因
B
b A1 a2 b1 b2 a1 A2
目的基因
B2
B1
B
A1 a2 b1 B2 目的基因 a1 A2
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的 发育而成为带转基因的新个体。
3、动物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。
实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因
phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特 异性
运用原理：同源重组的基因敲除
Abstract
Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chainlength poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from
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3.RNA干扰引起的基因敲除
RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进 化过程中高度保守的、由双链RNA（doublestranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效 特异性降解的现象。简单的说是指一种分子生物学上 由双链RNA诱发的基因沉默现象。所以RNAi的反应过 程也可以用于基因敲除。
1、微生物中的基因转移
转化
转导
接合
溶原性转换
原生质体融合
2、植物转基因技术
农杆菌介导转化法：根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti 质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入 细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。
基因枪介导转化法：利用火药爆炸或高压气体加速（这一加速设备被 称为基因枪），将包裹了带目的基因的DNA溶液的高速微弹直接送入 完整的植物组织和细胞中。
Pseudomonas stutzeri 1317, were expressed in the mutant strains to test the PhaC enzyme substrate specificity. The result showed P. putida KTOY01 or KTOY02 could provide not only mcl PHA monomers but also 3-hydroxybutyrate from fatty acids, which may allow the production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA). Plasmid pCJY10 containing phaC2Ps, phbA, and phbB genes encoding PHA polymerase, b-ketothiolase, and acetoacetyl-CoA reductase, respectively, were transformed into P. putida KTOY01 and KTOY02. Shake-flask culture showed P. putida KTOY01 or KTOY02 (pCJY10) could accumulate poly(3HB-co-mcl 3HA) from glucose. The above result showed pha operon knockout mutant of P. putida KT2442 was a very useful host of great potential not only for studying PhaC synthase, but also for microbial production of copolyesters poly(3HB-co-mcl 3HA), which is very difficult to abtain.
基因敲除技术与诺贝尔奖
医学领域的诺贝尔奖（2007年）已经揭晓。三位在基因敲除技术方面进行了 卓越、开拓性工作并取得了显著成就的科学家分享了诺贝尔生理或医学奖，他们 是美国盐湖城犹他州大学的Marie Capecchi教授、美国北卡罗来纳州大学的 Oliver smithies教授以及英国加蒂夫大学的Martin Evans教授
转基因和基因敲除技术介绍
张 晓 军 刘 杰 魏 岱 旭
主要内容
转基因技术 基因敲除技术 文献
一、转基因（Transgenesis）技术
定义：将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中， 由于导入基因的表达，引起生物体的性状的可遗传的修饰的 技术
微生物中的基因转移 植物转基因技术 动物转基因技术
反转录病毒转染法：把含有重组的逆转录病毒载体病毒颗粒去感染卵 裂期胚胎，于是携带外源基因的逆转录DNA可以在感染过程中，整合 到宿主细胞的染色体上。
体细胞核移植
二、基因敲除技术
定义：通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
1、应用DNA同源重组原理进行基因敲除。
2、利用随机插入突变进行基因敲除 3、RNA干扰也可以引起基因敲除
摘自《中华医学信息》 2007年第22卷第21期
文献：
Construction of pha-Operon-Defined Knockout Mutants of Pseudomonas putida KT2442 and their Applications in Poly(hydroxyalkanoate) Production
实验目的： 在P.Putida KT2442基因组中敲掉目的基因
phaC1-phaZ-phaC2,检测不同phaC基因的特 异性
运用原理：同源重组的基因敲除
Abstract
Pseudomonas putida KT2442 could accumulate medium-chainlength poly(hydroxyalkanoate)s (PHA) consisting of 3hydroxyhexanoate, 3-hydroxyoctanoate, 3-hydroxydecanoate, and 3-hydroxydodecanoate from a wide range of carbon sources. In this study, the PHA synthase pha operon (phaC1-phaZ-phaC2) was knocked out and the vgb gene encoding vitreoscilla hemoglobin protein (VHb), which could enhance oxygen uptakerate especially at low oxygen concentration, was integrated into the P. putida KT2442 genome to replace the deleted fragment. The resulting mutant P. putida KTOY01 or gene-replaced mutant KTOY02 was used as the host to study PHA synthase properties and PHA production. Different PHA polymerase (PhaC) genes, phaCRe from Rastonia eutropha H16, phaCAc from Aeromonas cavie, and phaC2Ps from
1． 利用基因同源重组进行基因敲除
应用最为广泛
其具体的原理和应用将在后面重点介绍
2.利用随机插入突变进行基因敲除 ——基因捕获法
利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或其他基因 载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携 带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获 得相应的基因敲除细胞。
花粉管通道法：在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用 植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精 卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵物转基因技术
显微注射法：在显微镜下，直接将DNA注射到胚胎的细胞核内， 再把注射过DNA的胚胎移植到动物体内，使之发育成正常的幼仔。