细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达

实验报告

实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR佥测p53基因的表达

报告人：张铨合作者：殷悦涵实验日期：2016.4.26

一、实验原理

1. 细胞RNA的提取及鉴定

细胞内RNA®常与蛋白质结合，以核蛋白（RNP的形式存在。分离、制备RNA

寸首先须破碎细胞，使RNF释放到溶液中并与蛋白质分离，然后将RNA同其他的细胞成分分离开并保证RNA的完整性。Trizol法分离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA W提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA由于RNase 能迅速降解RNA所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节避免它的污染。评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在 1.7-2.0 之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。

2. RT-PCR 佥测p53 基因的表达

PCF是一种体外大量扩增特异DN/片段的分子生物学技术，利用已知序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过多次循环是模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。基本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后

特定的DNA片段的分子数增加一倍。

RT-PCR各mRN反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物

进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞（A549和

H1299）中的表达水平。

二、实验材料及设备

材料：肺癌细胞A549 （野生型）和H1299 （p53缺失型）、p53引物、GAPDH 引物

试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖

耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩

设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温干燥箱、制冰机、可调式取液器、PCF仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、

凝胶成像系统、冰箱

三、实验步骤

1. 细胞RNA的提取及鉴定

（一）RNA提取

取1*106个细胞与1.5mlEp管—加0.2ml氯仿摇匀—4C，12000rpm离心15min 分层

—取上层水相入新的Ep管中加入等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min—4C, 12000rpm离心10min, RNA沉淀—弃上清，加1ml75聽醇洗涤沉淀—4C, 12000rpm离心5min—弃上清，晾干，用30卩l无RNase水溶解沉淀

（二）RNA浓度和纯度测定

取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度

2. RT-PCR检测p53基因的表达

（一）反转录合成cDNA

1. R NA预变性：取一支0.2mlPCR管加入样品RNA^ g，以无水RNase水补足体积至9卩l，70C，10min，立即置于冰上。

2. 设置反转录反应体系，向管内加入

混匀。42 °C，15min反转录；95 °C，5min终止反应。置于冰上

（二）PCR T增目的产物每组做两份模板不同的PCF反应

94 C预变性5mi n

94 C变性30s

58 C退火30s

72 C延伸30s

共30个循环

72 C 延伸5mi n

（三）RT-PCR产物鉴定:

1.

配2%

琼脂糖凝胶：

琼脂糖2g

0.5*TBE 100ml 微波加热融化；冷却至60C左右，加入

GoldView（DNA染料）5 卩l 混匀，灌胶

2. 电泳：

向水平电泳槽中加入0.5*TBE至恰好浸没凝胶约1mm左右

取15卩IRT-PCR产物上样，100V电泳20~30min

结果观察：用凝胶成像仪观察并拍摄电泳结果，以DNA分子量标准（marker）

为参照，分析PCR产物大小及p53在两种细胞中的表达情况。理论上，A549是p53野生型的细胞，正常表达p53,该样品的PCR产物经电泳后，应在390bp的位置出现扩增条带；而H1299是p53缺失型的细胞，不表达p53,在相应位置没有扩增条带。管家基因GAPD作为实验的内部参照，在两种细胞中均有表达，电泳后在320bp处

出现扩增条带。

四、实验结果

1. 细胞RNA的提取及鉴定

提取到细胞RNA用NanoDrop2000超微量分光光度计检测其Abs260/Abs280为2.03，浓度为4.3989卩g/卩l。

2. RT-PCR检测p53基因的表达

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五、实验讨论

1. 细胞RNA的提取及鉴定

由于在RNA提取实验中，RNA浓度较高，为4.2卩g/卩l，导致在取2卩g的RNA时，只需取0.5卩l的RNA溶液，移液器的精度不高，容易造成误差，因此应将溶液稀释至1卩g/卩l左右再取2卩g的RNA溶液。

Abs260/Abs280为2.02，说明我们组提取的RNA较为纯净，提取步骤操作良好，几乎没有蛋白质的污染，该溶液可以使用到RT-PCR的实验中。

2. RT-PCR检测p53基因的表达

可以看到我们组A549细胞中在390bp的位置出现扩增条带，H1299在390bp 处没有出现扩增条带，可说明A549细胞中正常表达p53基因，经过RT-PCF扩增后在电泳凝胶成像仪中表现出390bp有扩增条带，H1299细胞则不表达p53,不出现扩增条带。

由于我组实验结果为阴性，所以不能看出在实验步骤中混入RNase降解RNA

但还需在实验步骤中注意佩戴口罩和手套