RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告

RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告

1310301315 张铨

一、RT PCR技术

1.基本原理

聚合酶链反应(PCR)技术是利用DNA聚合酶在体外条件F．催化一对特异引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。PCR包括三个基本过程：

(1)变性，在高温度条件下使双链模板DNA变性、解链，成为两条单链DNA；

(2)退火，在较低温度时使加入的引物单链DNA模板特异性结合；

(3)延伸，在适当的温度下，Taq DNA聚合酶从结合到DNA模板上的引物3’-OH 端开始．根据碱基互补配对原则，按照DNA模板核苷酸序列，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子，，这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过若干次循环后，目的DNA片段的拷贝数大最增加。

RT-PCR方法由两部分组成：

(1)cDNA的合成：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下以Oligo（dT）16或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段

(2)PCR扩增：以已合成的cDNA为模板，使用上、下游引物在耐热的DNA聚合酶作用下进行标准的PCR扩增。1

2.实验方法

【实验材料】

1．试剂

(1)β-actin引物

上游引物：5 7一ATG CGA ATT CCC AAC CGT GAA AAG ATG A-3’

下游引物：5 7一ATG CGG ATC CGA AGG AAG GCT GGA AAA一3’

(2)Promega RT-PCR试剂盒

(3)酚／氯仿：1：1混合

(4)醋酸钠：3mol／L，pH5．2

(5)无水乙醇

2．仪器

基因扩增仪(PCR仪)，5415R型离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，制冰机，低温冰箱，可调式取液器，解剖用具。

3．耗材

0．2ml、1．5ml Ep管，20μl和200μl吸头若干个。

【实验步骤】

1．反转录合成cDNA

(1)RNA预变性(打开RNA二级结构)：取1支0．2ml Ep管加入

样品RNA 2μl

无RNase水 7μl

70℃，10min，立即置冰上。

(2)设置反转录反应体系：向Ep管中加入：

MgCl2 4μl

10×RT缓冲液 2μl

dNTP 2μl

RNasin 1μl(15U)

Oligo dT 1μl

AMV反转录酶 1μl

混匀。42。C，15mira 95。C，5min终止反应。短暂离心，将反应物收集于管底，置于冰上。

2．设置PCR反应体系(可在反转录反应进行时配制)

(1)取1支0．2ml Ep管，在冰上加入：

10×PCR缓冲液 5μl

dNTP 1μl

β-actin上游引物 1μl

β-actin下游引物 1μl

Taq DNA聚合酶 1μl

无RNase水 39μl

待反转录反应结束后，加入cDNA 2μl

(2)设置PCR反应参数为：

94℃预变性 5min

94℃变性 30s

58℃退火 40s

72℃延伸 40s

共30个循环

72℃延伸 10min

3．RT_PCR产物鉴定

取10μl RT-PCR产物在2％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。

4．PCR产物的纯化

将PCR反应剩余产物合并，用无菌蒸馏水将体积补至200／-1。加入等体积(200μl)的酚／氯仿，混匀5min，4℃，10 000r／rain离心10min。取上层水相，加入1／lO体积的醋酸钠(3mol／L，pH5．2)、2倍体积无水乙醇，混匀，室温或一20℃放置30min ；4℃，12 000r／min离心10min，弃上清，待乙醇挥

发干净后，溶于10 μl无菌蒸馏水。一20℃保存备用。

3.应用

PCR和RT-PCR技术操作简单，灵敏度高，已广泛应用于基因结构分析、基因表达和基因克隆研究。RT-PCR主要用于定性或定量检测基因的表达情况以及有关疾病的临床诊断，是分子生物学常用的技术之一。RT-PCR实质上是对mRNA 的扩增，我们常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。

(1)DNA克隆：从混合的模板DNA分子中(如cDNA文库)选择性地扩增靶基因，并在引物末端引入限制性酶切位点或其他特定序列，即可将靶基因克隆到多种表达载体中，以用于进一步的功能分析。

(2)突变分析：通过改变引物与靶基因的互补结合区，可以扩增靶基因中的某个功能域或特殊结构区，克隆表达后可分析该基因缺失子(gene deletion mutant)的功能。改变引物设计还可以得到定点突变的基因变异体(site-directed mutagenesis)。

(3)基因融合：选择性扩增两个(或多个)基因(或其特定结构域)，在各自的引物中加入相匹配的限制性内切酶位点，扩增后的产物经酶切及连接反应，即可得到所需的融合基因。

(4)基因半定量：在反应条件一定且循环数较少的情况下，PCR的产物量与样本所含的模板量成正比，此时PCR可以用于初步的基因定量分析。实时PCR(real time PCR)可以实时监测PCR反应的进行，控制循环次数在定量所需范围内，因此可以用于更为准确的量化分析。

(5)疾病的诊断和法医学鉴定：PCR技术因其高度的灵敏性、特异性和操作简便快速等突出优势，已经被广泛应用于疾病诊断和法医学鉴定。PCR可以检测遗传病患者是否有特定的基因突变，感染疾病患者体内是否存在细菌或病毒等相关遗传物质，为下一步针对性的治疗提供直接依据。在法医学上，PCR扩增微量残留DNA并结合DNA指纹、杂交等分子生物学手段，已成为一种行之有效的甄别个人身份的方法。PCR甚至可以对几百万年前留下的动物残骸进行DNA扩增，使其在考古学、进化生物学等领域亦得到广泛的应用。2

二、real time RT-PCT技术

1.基本原理

实时定量PCR(real—time quantitative PCR)是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR指数扩增进程，通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。“实时”是指在每一个PCR循环后检测扩增产物，当PCR扩增反应结束后，我们可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。