RT PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测基因表达水平。
其原理是通过逆转录将RNA转化为cDNA，并利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的序列，最终定量检测目标基因的表达水平。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
1.逆转录（Reverse Transcription）逆转录是RT-PCR的第一步，主要是将目标基因的RNA转化为互补的DNA，即cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶（Reverse Transcriptase）和引物（Primers）的参与。
首先，待检测的RNA通过加热来解旋成为单链。
然后，在逆转录反应中，引物（Primers）结合在RNA的末端，提供一个起始点。
逆转录酶（Reverse Transcriptase）将引物作为模板，合成互补的DNA链。
引物一般选择Oligo-dT引物，它可以与RNA的多聚腺苷酸尾端结合，从而引导逆转录酶合成cDNA链。
此外，逆转录反应还需要dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液等辅助物资。
2. PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）逆转录后得到的cDNA是目标基因的复制物。
为了增加检测敏感性，需进一步扩增cDNA序列。
在PCR扩增过程中，引物（Primers）的作用是选择目标基因的特异序列，通过引物与目标序列的互补配对，使DNA聚合酶（DNA Polymerase）能够在相应的温度下在该位置合成新的DNA链。
PCR扩增需要参与的物质有DNA聚合酶、引物、dNTP、缓冲液和模板DNA。
引物是PCR反应中的关键，其中一对引物的设计应使其能够选择性地与目标基因序列的两个位点互补，从而能够在接下来的扩增反应中产生目标DNA片段。
PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，通过高温（通常为94℃至96℃）变性步骤将目标DNA链分离为两个单链。
RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告
RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告1310301315 张铨一、RT PCR技术1.基本原理聚合酶链反应(PCR)技术是利用DNA聚合酶在体外条件F．催化一对特异引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。
PCR包括三个基本过程：(1)变性，在高温度条件下使双链模板DNA变性、解链，成为两条单链DNA；(2)退火，在较低温度时使加入的引物单链DNA模板特异性结合；(3)延伸，在适当的温度下，Taq DNA聚合酶从结合到DNA模板上的引物3’-OH 端开始．根据碱基互补配对原则，按照DNA模板核苷酸序列，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子，，这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过若干次循环后，目的DNA片段的拷贝数大最增加。
RT-PCR方法由两部分组成：(1)cDNA的合成：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下以Oligo（dT）16或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段(2)PCR扩增：以已合成的cDNA为模板，使用上、下游引物在耐热的DNA聚合酶作用下进行标准的PCR扩增。
12.实验方法【实验材料】1．试剂(1)β-actin引物上游引物：5 7一ATG CGA ATT CCC AAC CGT GAA AAG ATG A-3’下游引物：5 7一ATG CGG ATC CGA AGG AAG GCT GGA AAA一3’(2)Promega RT-PCR试剂盒(3)酚／氯仿：1：1混合(4)醋酸钠：3mol／L，pH5．2(5)无水乙醇2．仪器基因扩增仪(PCR仪)，5415R型离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，制冰机，低温冰箱，可调式取液器，解剖用具。
3．耗材0．2ml、1．5ml Ep管，20μl和200μl吸头若干个。
【实验步骤】1．反转录合成cDNA(1)RNA预变性(打开RNA二级结构)：取1支0．2ml Ep管加入样品RNA 2μl无RNase水 7μl70℃，10min，立即置冰上。
人野生型p53基因的克隆及原核表达
人野生型p53基因的克隆及原核表达王继;高瑞娟;袁大巍;王丽【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》【年(卷),期】2009(47)5【摘要】利用RT-PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段,并将其克隆入原核表达载体pQE40中,构建重组质粒pQE40-p53;转化于E.coliM15宿主菌,经IPTG诱导,表达了N端融合6His的p53融合蛋白.利用6His与Ni2+高亲合力结合的性质,经镍柱纯化、透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定,结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.【总页数】4页(P1077-1080)【作者】王继;高瑞娟;袁大巍;王丽【作者单位】东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建 [J], 关婷;崔满华;李守柔PIO增强MRI检测人野生型p53基因转染动脉粥样硬化易损斑块的研究 [J],陈荣红;祁春梅;李东野;蔡文标;武维恒;姚丽娜;张超3.稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定 [J], 雷晓晶;韩鹏飞;吕智4.脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡 [J], 李好山;熊正爱;周玮;李成祥;姚陈果;孙才新5.尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响 [J], 王伟;姚静;周建平;李夷平;陶磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
RT-PCR在基因表达检测中的应用
RT-PCR在基因表达检测中的应用基因表达的检测有几种方法。
经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。
随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。
随着重组DNA技术的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。
目前有好几种方法广泛应用于于研究特定RNA 分子。
这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。
这里描述RT-PCR从RNA水平上检查基因表达的应用。
RT-PCR检测基因表达的问题讨论关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。
理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。
1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。
该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。
当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。
用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。
因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。
将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。
我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。
当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。
我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。
反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理一、 rt-pcr检测基因表达水平的基本原理1. rt-pcr技术是一种用来检测基因表达水平的常用方法，其中rt代表逆转录（reverse transcription），pcr代表聚合酶链式反应（polymerase ch本人n reaction）。
2. rt-pcr技术通过将RNA转录成cDNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定基因的片段，从而检测基因的表达水平。
3. rt-pcr检测基因表达水平的原理可以分为逆转录和聚合酶链式反应两个步骤。
4. 逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，通过逆转录酶（reverse transcriptase）的作用，RNA可以被转录成cDNA。
5. 聚合酶链式反应是将cDNA扩增的过程，通过聚合酶和引物（primer）的作用，cDNA可以被扩增成大量的目标片段。
二、 rt-pcr检测基因表达水平的具体步骤1. 提取RNA：首先需要从待检测的组织或细胞中提取总RNA，保证RNA的完整性和纯度对后续实验非常重要。
2. 逆转录：将提取的RNA进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶和随机引物或特异性引物。
3. pcr扩增：将逆转录后得到的cDNA进行聚合酶链式反应，使用特异性引物对目标基因进行扩增。
聚合酶链式反应的过程需要聚合酶、引物和dNTP。
4. 分析结果：最后通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR等方法对扩增产物进行定量和分析，得到基因表达水平的信息。
三、 rt-pcr检测基因表达水平的优缺点1. 优点：rt-pcr检测基因表达水平的灵敏度高，可以检测低表达基因；检测结果定量化准确，能够得到基因的具体表达量；方法简单、快速、高效，适用于大规模的基因表达分析。
2. 缺点：需要严格控制反应条件和引物设计，以避免假阳性结果；受到RNA的完整性和纯度的影响，需谨慎处理RNA样本；无法区分剪接异构体，对于复杂基因的表达分析存在局限性。
p53基因克隆表达及其活性测定
作 者 签 ｝ ＇ ４ ａ 一 Ｔ Ａ Ｈ 期 ’ ０ １ ， 歹 ／ ‘
论文使用授 权说明
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卖验证明， 通过原核表达的Ｐ ５ ３ 蛋白具有较高的活性， 在体外分
析时发现 Ｐ ５ ３ 蛋 白能抑制 Ｋ ５ ６ ２ 细胞生长并促使其 发生凋 亡。 本实验为寻找新型 抗肿瘤基因 工程药提供可靠 的数据和资料 。
关键词：ｐ ５ ３ 基因 基因克隆 细胞凋亡 荧光磁性纳米粒子
Ｃ ｌ ｏ ｎ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ ｐ ５ ３ ｇ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ｔ ｓ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ ｔ ｅ ｓ ｔ
Ｋ ｅ ｙ ｗ ｏ ｒ ｄ ｓ ： ｐ ５ ３ ｇ ｅ ｎ ｅ ， ｇ ｅ ｎ ｅ ｃ ｌ ｏ ｎ ｅ ， ａ ｐ ｏ ｐ ｔ ｏ ｓ ｉ ｓ ， ｍ ａ ｇ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｎ ａ ｎ ｏ ｍ ｅ ｔ ｅ ｒ ｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ
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本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。 论文中除了 特别加以 标注和致谢的地方外， 不包含其他人或机构 己经 发表或撰写过的研究成果 。 其他同 志对本研究的启发和 所做的贡 献均己在论文中 做 了明确的声明并表示了 谢意。
ｍ ａ ｇ ｎ ｅ ｔ ｉ ｃ ｎ ａ ｎ ｏ ｍ ｅ ｔ ｅ ｒ ｐ ａ ｒ ｔ ｉ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ ｔ ｏ ｌ ｉ ｎ ｋ ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｈ ｅ ｐ ｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ （ Ｍ Ｎ Ｐ － Ｎ Ｈ ｚ Ｐ ５ ３ ）
转录调节蛋白TP53基因敲除增加斑马鱼耐寒能力与运动行为的研究
㊀收稿日期:２０２３－０１－１５基金项目:国家自然科学基金面上项目(８１７７０１６５)ꎻ上海市科技兴农重点攻关项目[沪农科创字(２０１９)第１－２号]作者简介:贾惠莲(１９９６－)ꎬ女ꎬ山东德州人ꎬ硕士研究生ꎬ研究方向:分子生物学.㊀∗通讯作者:张俊芳ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｊｆｚｈａｎｇ＠ｓｈｏｕ.ｅｄｕ.ｃｎꎻ范纯新ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｃｘｆａｎ＠ｓｈｏｕ.ｅｄｕ.ｃｎ.㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀㊀自然科学版第５０卷㊀第４期㊀２０２３年ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＬＩＡＯＮＩＮＧＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎＶｏｌ.５０㊀Ｎｏ.４㊀２０２３转录调节蛋白ＴＰ５３基因敲除增加斑马鱼耐寒能力与运动行为的研究贾惠莲１ꎬ２ꎬ秦彦筠１ꎬ２ꎬ杨倩婷１ꎬ２ꎬ韩兵社１ꎬ２ꎬ范纯新１ꎬ２ꎬ∗ꎬ张俊芳１ꎬ２ꎬ∗(１.上海海洋大学水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室ꎬ上海２０１３０６ꎻ２.上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心ꎬ上海２０１３０６)摘㊀要:转录调节蛋白ＴＰ５３(Ｔｕｍｏｒｐｒｏｔｅｉｎ５３)调控多种重要生物学过程ꎬ包括细胞周期㊁ＤＮＡ损伤㊁修复和细胞凋亡等.在各种应激条件下ｔｐ５３会被激活并发挥与应激相关的调控作用ꎬ但ｔｐ５３在鱼类低温应激下的作用尚不明了.本文首先检测在低温应激条件下斑马鱼(Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ)中ｔｐ５３的表达变化ꎬ然后利用ｔｐ５３－/－斑马鱼敲除模型研究了敲除ｔｐ５３对斑马鱼低温耐受能力和运动的影响.ＲＴ－ｑＰＣＲ结果显示:在８ħ低温条件下野生型斑马鱼全鱼和鳃组织中ｔｐ５３的ｍＲＮＡ水平显著升高.低温耐受实验显示:８ħ低温下ｔｐ５３－/－斑马鱼的耐受能力增强ꎬ半数致死时间(ｌｅｔｈａｌｔｉｍｅｔｏ５０％ｍｏｒｔａｌｉｔｙꎬＬＴ５０)显著高于ＷＴ(Ｗｉｌｄｔｙｐｅ)对照组(Ｐ<０.０００１).运动行为学实验发现:与２８ħ相比ꎬ１８ħ低温下ＷＴ和ｔｐ５３－/－斑马鱼的移动距离㊁平均速度和活跃度均显著降低(Ｐ<０.０００１)ꎻ同时发现在２８ħ和１８ħ条件下ꎬｔｐ５３－/－斑马鱼的移动距离㊁平均速度和活跃度均显著高于ＷＴ组.研究结果说明ｔｐ５３参与斑马鱼的低温响应过程ꎬ敲除ｔｐ５３后斑马鱼的耐寒能力与运动能力增强.本文为鱼类的低温耐受机制和运动行为学研究提供了新思路.关键词:斑马鱼ꎻｔｐ５３ꎻ基因敲除ꎻ低温耐受ꎻ运动能力中图分类号:Ｓ９１７㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１０００－５８４６(２０２３)０４－０３４８－１１ＫｎｏｃｋｏｕｔｏｆＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌＲｅｇｕｌａｔｏｒｙＰｒｏｔｅｉｎＴＰ５３ＩｎｃｒｅａｓｅｓＣｏｌｄＴｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄＡｔｈｌｅｔｉｃＡｂｉｌｉｔｙｏｆＺｅｂｒａｆｉｓｈＪＩＡＨｕｉ￣ｌｉａｎ１ꎬ２ꎬＱＩＮＹａｎ￣ｊｕｎ１ꎬ２ꎬＹＡＮＧＱｉａｎ￣ｔｉｎｇ１ꎬ２ꎬＨＡＮＢｉｎｇ￣ｓｈｅ１ꎬ２ꎬＦＡＮＣｈｕｎ￣ｘｉｎ１ꎬ２ꎬ∗ꎬＺＨＡＮＧＪｕｎ￣ｆａｎｇ１ꎬ２ꎬ∗(１.ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＥｘｐｌｏｒａｔｉｏｎａｎｄＵｔｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＡｑｕａｔｉｃＧｅｎｅｔｉｃＲｅｓｏｕｒｃｅｓꎬＭｉｎｉｓｔｒｙｏｆＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＳｈａｎｇｈａｉＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１３０６ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＮａｔｉｏｎａｌＤｅｍｏｎｓｔｒａｔｉｏｎＣｅｎｔｅｒｆｏｒＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＦｉｓｈｅｒｉｅｓＳｃｉｅｎｃｅＥｄｕｃａｔｉｏｎꎬＳｈａｎｇｈａｉＯｃｅａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＳｈａｎｇｈａｉ２０１３０６ꎬＣｈｉｎａ)Ａｂｓｔｒａｃｔ:㊀ＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｐｒｏｔｅｉｎＴＰ５３(Ｔｕｍｏｒｐｒｏｔｅｉｎ５３)ｒｅｇｕｌａｔｅｓａｖａｒｉｅｔｙｏｆ㊀㊀ｃｒｕｃｉａｌｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｃｅｓｓｅｓｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｅｌｌｃｙｃｌｅꎬＤＮＡｄａｍａｇｅꎬｒｅｐａｉｒꎬａｐｏｐｔｏｓｉｓꎬａｎｄｓｏｏｎ.Ａｓａｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒꎬｔｐ５３ｉｓｉｎｄｕｃｅｄｕｎｄｅｒｖａｒｉｏｕｓｓｔｒｅｓｓｅｓ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅｒｏｌｅｏｆｔｐ５３ｕｎｄｅｒｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓｉｎｆｉｓｈｓｔｉｌｌｒｅｍａｉｎｅｌｕｓｉｖｅ.ＩｎｏｕｒｓｔｕｄｙꎬｍＲＮＡｌｅｖｅｌｏｆｔｐ５３ｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ(Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ)ｄｕｒｉｎｇｃｏｌｄｔｒｅａｔｍｅｎｔａｔ８ħｗａｓｅｘａｍｉｎｅｄꎬａｎｄｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｔｐ５３ｋｎｏｃｋｏｕｔｏｎｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄａｔｈｌｅｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｚｅｂｒａｆｉｓｈｗａｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄｂｙｕｓｉｎｇａｔｐ５３ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｏｄｅｌ(ｔｐ５３－/－).ＲＴ－ｑＰＣＲｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｐ５３ｍＲＮＡｌｅｖｅｌｉｎｌａｒｖａｅａｎｄｇｉｌｌｓｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙａｆｔｅｒｃｏｌｄｅｘｐｏｓｕｒｅ.Ｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｋｎｏｃｋｏｕｔｏｆｔｐ５３ｈａｄｅｎｈａｎｃｅｄｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅꎬｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄＬＴ５０(ｌｅｔｈａｌｔｉｍｅｔｏ５０％ｍｏｒｔａｌｉｔｙ)(Ｐ<０.０００１)ａｔ８ħｆｏｒｃｏｌｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ.ＢｅｈａｖｉｏｒｓｔｅｓｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｏｖｅｄｄｉｓｔａｎｃｅꎬａｖｅｒａｇｅｓｐｅｅｄａｎｄｍｏｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｄｅｃｒｅａｓｅｄｉｎｂｏｔｈＷＴ(ＷｉｌｄＴｙｐｅ)ａｎｄｔｐ５３－/－ｚｅｂｒａｆｉｓｈａｔ１８ħꎬｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｏｓｅａｔ２８ħ.Ｈｏｗｅｖｅｒꎬｔｈｅａｔｈｌｅｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｐ５３－/－ｚｅｂｒａｆｉｓｈｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎＷＴｚｅｂｒａｆｉｓｈｉｎｃｌｕｄｉｎｇｍｏｖｅｄｄｉｓｔａｎｃｅꎬａｖｅｒａｇｅｓｐｅｅｄａｎｄｍｏｂｉｌｉｔｙａｔｂｏｔｈｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ.Ｔｈｉｓｗｏｒｋｉｎｄｉｃａｔｅｓｔｈｅｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔｏｆｔｐ５３ｕｎｄｅｒｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓꎬａｎｄｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｏｆｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄａｔｈｌｅｔｉｃａｂｉｌｉｔｙｂｙｔｈｅｋｎｏｃｋｏｕｔｏｆｔｐ５３ｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ.Ｔｈｅｆｉｎｄｉｎｇｓｐｒｏｖｉｄｅｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅａｎｄｂｅｈａｖｉｏｒｓｉｎｆｉｓｈ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:㊀ｚｅｂｒａｆｉｓｈꎻｔｐ５３ꎻｇｅｎｅｋｎｏｃｋｏｕｔꎻｃｏｌｄｔｏｌｅｒａｎｃｅꎻａｔｈｌｅｔｉｃａｂｉｌｉｔｙ０㊀引言温度是影响动物生理活动的环境因子之一ꎬ研究动物应对温度变化的适应机制具有重要的生物学意义.低温是自然界普遍存在的环境压力ꎬ哺乳动物在遭受冷应激时会增加食物摄入ꎬ并提高产热机能来维持体温恒定[１].作为变温动物ꎬ鱼类更易受水体温度变化影响.抗冻(糖)蛋白㊁分子伴侣㊁代谢酶类和膜通道蛋白改变等多种机制参与了鱼类响应低温胁迫的过程[２].鱼类温度适应调控不同于恒温动物[３]ꎬ目前学界对鱼类低温胁迫的适应机制的了解比较有限.研究低温耐受相关基因对耐寒能力的调控作用ꎬ是探究鱼类低温耐受机制需要解决的问题之一.作为一种转录因子ꎬｔｐ５３可通过激活或抑制多种下游靶基因的转录来调控细胞凋亡㊁胚胎发育和应激等过程ꎬ这对维持生物体内环境稳定至关重要[４－５].近年来ꎬ越来越多的研究表明ｔｐ５３在鱼类应对外界温度变化带来的压力方面发挥了重要作用.在斑马鱼(Ｄａｎｉｏｒｅｒｉｏ)中ꎬｔｐ５３高表达与低温应激相关[６].在低温胁迫下ꎬ大黄鱼ｐ５３信号通路中相关基因的表达水平升高[７].在小于４０ħ的亚热激状态下ꎬ斑马鱼胚胎中的Ｐ５３蛋白可通过抑制过度热激反应而维持细胞稳态ꎬ促进细胞存活ꎻ但在４３ħ的高热激状态下ꎬ磷酸化的Ｐ５３可促进凋亡蛋白Ｂａｘ(Ｂ－ｃｅｌｌｌｙｍｐｈｏｍａ－２ＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＸｐｒｏｔｅｉｎꎬＢＡＸ)的表达ꎬ诱导细胞凋亡[８].这说明Ｐ５３在不同的压力状态下可以通过不同的调控机制对细胞产生影响.温度会影响鱼类的游泳㊁摄食和生殖洄游等行为ꎬ由于温度变化导致鱼类行为发生改变时ꎬ游泳９４３㊀第４期㊀㊀㊀㊀贾惠莲ꎬ等:转录调节蛋白ＴＰ５３基因敲除增加斑马鱼耐寒能力与运动行为的研究㊀㊀行为就成为鱼类此时最重要的环境适应指标[９].运动行为改变会导致ｔｐ５３的表达在不同组织细胞中出现差异.丁树哲等[１０]发现ꎬ运动训练后小鼠骨骼肌中ｔｐ５３的表达具有肌纤维类型特异性和运动强度敏感性.对ｔｐ５３与运动关系的研究中ꎬＥｌａｂｄ等[１１]敲除斑马鱼ｔｐ５３基因ꎬ４ｄｐｆ和５ｄｐｆ的斑马鱼对振动的反应能力下降ꎬ逃避能力降低.ＤＵＸ４(Ｄｏｕｂｌｅｈｏｍｅｏｂｏｘ４)基因过度表达不利于斑马鱼肌肉的发育ꎬ在小鼠中可导致肌肉退化ꎬ研究表明ＤＵＸ４对肌肉的影响具有ｔｐ５３依赖性[１２].目前已有研究均提示ꎬｔｐ５３基因与鱼类在极端环境下的存活情况相关ꎬ且在不同环境下的调控作用有所差异[８ꎬ１３].以往研究中ꎬ通过Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ法敲降斑马鱼胚胎在特异性㊁作用持续时间和敲降效率方面存在一定限制[１４].本文采用由ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９(Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄｒｅｇｕｌａｒｌｙｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄｓｈｏｒｔｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃｒｅｐｅａｔｓ/ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ９ꎬＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９)基因编辑技术获得的ｔｐ５３基因敲除斑马鱼ꎬ探究ｔｐ５３对斑马鱼耐寒能力的影响ꎬ发现ｔｐ５３基因敲除增加了斑马鱼的低温耐受能力和运动能力.本文为进一步研究鱼类耐寒机制和运动行为调节机制提供了依据.１㊀材料与试剂１.１㊀主要试剂本文的主要试剂:２ˑＴａｑＭａｓｔｅｒＭｉｘ(Ｐ１１１)购于Ｖａｚｙｍｅꎻ１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌꎬｐＨ８.０ＳＴ７８０购于ＢｅｙｏｔｉｍｅꎻＴＲＩｚｏｌＲｅａｇｅｎｔ(１５５９６０１８)购于Ａｍｂｉｏｎꎻ反转录试剂盒(ＲＲ０４７Ａ)购于ＴａＫａＲａꎻＳＹＢＲＧｒｅｅｎ(１７２５１２４)购于ＢＩＯ－ＲＡＤ.１.２㊀斑马鱼来源本文所用ＷＴ斑马鱼为ＡＢ品系ꎬＦ１代ｔｐ５３基因敲除杂合子斑马鱼ｔｐ５３＋/－由上海海洋大学水产与生命学院范纯新老师课题组赠予:由ＣＲＩＳＰＲ/Ｃａｓ９基因编辑技术获得Ｆ０代ｔｐ５３基因敲除型斑马鱼ꎬＦ０代与野生型斑马鱼交配获得Ｆ１代ｔｐ５３＋/－杂合子斑马鱼.本实验将Ｆ１代ｔｐ５３＋/－进行自交ꎬ筛选Ｆ２代中的ｔｐ５３－/－纯合子斑马鱼ꎬ为排除母体效应的影响ꎬ将筛选出的Ｆ２代ｔｐ５３－/－进行自交以获得Ｆ３代ｔｐ５３－/－ꎬＦ３代ｔｐ５３－/－用于实验.斑马鱼的敲除靶点位于ｔｐ５３基因的第五外显子ꎬ缺失的８个碱基为５ᶄ－ＣＣＣＴＣＣＡＣ－３ᶄ.所有实验用鱼均养殖在专用养殖循环水系统中ꎬ斑马鱼传代以人工成对交配的方式进行ꎬ养殖水温控为２８ħꎻ通过自动光照系统控制光照周期ꎬ光周期为７:３０ ２１:３０ꎬ暗周期为２１:３０ 次日７:３０ꎻ以新鲜孵化的丰年虾和草履虫对斑马鱼进行投喂.１.３㊀仪器与设备本文所使用的主要仪器:ＰＣＲ核酸扩增仪(Ｃ１０００ＴｏｕｃｈＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅ)购于ＢＩＯ－ＲＡＤꎻ斑马鱼胚胎孵化箱(ＭＩＲ－１５４－ＰＣ)购于Ｐａｎａｓｏｎｉｃꎻ恒温培养箱(１０００Ｂ１)购于江南仪表厂(宁波)ꎻ荧光定量ＰＣＲ仪(ＣＦＸ９６)购于ＢＩＯ－ＲＡＤꎻ１２孔板(Ｆ６０３２０２－９００１)购于ＢＢＩꎻ斑马鱼幼鱼行为轨迹分析系统(Ｄａｎｉｏｖｉｓｉｏｎ)购于Ｎｏｌｄｕｓꎻ斑马鱼专用养殖循环水系统为上海海圣水族养殖设备.０５３㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０２３年㊀㊀㊀㊀２㊀实验方法２.１㊀低温处理降温方案本文采用的梯度降温方案(如图１所示):水温以０.８３ħ/ｈ的速度从２８ħ匀速降至１８ħꎬ水温在１８ħ维持１２ｈ后ꎬ再以１ħ/ｈ的速度匀速降至１２ħꎬ在１２ħ维持１２ｈ后ꎬ继续以１ħ/ｈ的速度匀速降温至８ħꎬ此后不再降温.在整个降温过程中停止对斑马鱼投喂食物ꎬ避免因食物残留导致水质破坏影响实验结果.图１㊀斑马鱼低温处理降温方案２.２㊀实时荧光定量ＰＣＲ检测ｔｐ５３表达量本文按照图１对斑马鱼进行降温处理ꎬ斑马鱼全鱼和鱼鳃的取样点分别为２８ħꎬ８ħ－０㊁２㊁４和６ｈ.在每个取样点收取３尾全鱼(２月龄)样本混样ꎬ收取６尾斑马鱼(３.５月龄)鳃组织样本混样ꎬ用于提取ＲＮＡꎬＲＮＡ提取采用ＴＲＩＺＯＬ法.本文提取总ＲＮＡ后ꎬ取１μｇ总ＲＮＡ进行反转录ꎬ以获得的ｃＤＮＡ作为模板ꎬ以斑马鱼β－ａｃｔｉｎ作为内参基因ꎬ通过ＲＴ－ｑＰＣＲ法检测ｔｐ５３基因的ｍＲＮＡ表达量.引物设计在ＩＤＴ网站(ｈｔｔｐｓ://ｓｇ.ｉｄｔｄｎａ.ｃｏｍ)完成.ＲＴ－ｑＰＣＲ引物需要跨越内含子进行设计ꎬ产物长度在１００~２００ｂｐ之间ꎬ引物序列见表１.ＲＴ－ｑＰＣＲ程序:预变性９５ħ３ｍｉｎꎬ１个循环ꎻ变性９５ħ１０ｓꎬ退火６０ħ３０ｓꎬ３９个循环.每个样品设置３个生物学重复ꎬ采用２－әәＣｔ运算方法进行数据分析.表１㊀ＲＴ－ｑＰＣＲ和基因型鉴定引物序列ＰｒｉｍｅｒｎａｍｅＰｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄң３ᶄ)Ｓｉｚｅ/ｂｐＲＴ－β－ａｃｔｉｎ－ＦＣＴＴＴＧＡＧＣＡＧＧＡＧＡＴＧＧＧＡＡＣＣ２２ＲＴ－β－ａｃｔｉｎ－ＲＧＡＴＴＣＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＡＡＧＧ１９ＲＴ－ｔｐ５３－ＦＣＣＣＧＧＣＧＡＴＣＡＴＧＧＡＴＴＴＡＧ２０ＲＴ－ｔｐ５３－ＲＣＣＡＣＡＴＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＴＴＡＴＡＧ２３ｔｐ５３－ＦＧＣＴＡＡＡＣＴＡＴＡＡＣＡＡＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡ２５ｔｐ５３－ＲＡＡＡＴＧＴＣＴＧＴＡＣＴＡＴＣＴＣＣＡＴＣＣＧ２４２.３㊀Ｆ２代斑马鱼基因分型鉴定本文将Ｆ１代杂合子斑马鱼进行自交ꎬ获得Ｆ２代斑马鱼ꎬ剪取Ｆ２代斑马鱼尾鳍ꎬ加入２０μＬ５０ｍｍｏｌＮａＯＨ溶液ꎬ９５ħ裂解２０ｍｉｎꎬ涡旋振荡５ｓꎬ加入２μＬ１ｍｏｌＴｒｉｓ－ＨＣｌ(ｐＨ８.０)ꎬ振荡混匀ꎬ即获得ＤＮＡ模板ꎬ在靶点上下游设计引物进行ＰＣＲ扩增ꎬ基因型鉴定引物见表１.ＰＣＲ反应程序:９４ħ预变性５ｍｉｎꎻ９４ħ变性３０ｓꎬ５５ħ退火１５ｓꎬ７２ħ延伸１ｍｉｎꎬ３４个循环ꎻ７２ħ再延伸５ｍｉｎꎬ扩增产物约２４０ｂｐ.ＰＣＲ产物进行３％琼脂糖凝胶电泳ꎬ并通过Ｓａｎｇｅｒ测序验证ꎬ筛选出Ｆ２代敲除型纯合子ｔｐ５３－/－斑马鱼.本文提取ｔｐ５３－/－斑马鱼的总ＲＮＡꎬ以ＷＴ作为对照ꎬ通过ＲＴ－ｑＰＣＲ分析ｔｐ５３基因的ｍＲＮＡ表达量ꎬ引物㊁样品处理和数据分析方法同２.２.２.４㊀低温耐受实验本实验将２.５月龄ＷＴ(４２尾)和ｔｐ５３－/－(５０尾)斑马鱼进行低温处理(方案见图１)ꎬ统计斑马１５３㊀第４期㊀㊀㊀㊀贾惠莲ꎬ等:转录调节蛋白ＴＰ５３基因敲除增加斑马鱼耐寒能力与运动行为的研究鱼的生存时长和半数致死时间(Ｌｅｔｈａｌｔｉｍｅｔｏ５０％ｍｏｒｔａｌｉｔｙꎬＬＴ５０).半数致死时间按８ħ冷处理开始至每组斑马鱼死亡数量达到一半时的时间来计算.斑马鱼在低温下会逐渐失去平衡ꎬ不再游动.参考相关文献对鱼类冷处理后的恢复方法[１５]ꎬ每间隔０.５ｈꎬ将不再游动的斑马鱼转移到２８ħ养殖水中ꎬ观察其能否恢复ꎬ若不能恢复ꎬ则判定斑马鱼死亡.实验中记录每一尾斑马鱼的生存时长(实验开始降温的时刻记为０)ꎬ绘制生存曲线ꎬ并测量每一尾斑马鱼的体重和体长.２.５㊀运动行为学监测本实验随机选取生长状况良好的１月龄ＷＴ和ｔｐ５３－/－斑马鱼幼鱼转移至１２孔板中ꎬ每孔１尾ꎬ每组６尾ꎬ每孔加入４ｍＬ养殖水ꎬ并做好标记.本文采用Ｎｏｌｄｕｓ公司的ＤａｎｉｏＶｉｓｉｏｎ斑马鱼行为轨迹分析系统对斑马鱼进行运动行为学监测ꎬ先将斑马鱼转移至暗室中适应１５ｍｉｎꎬ以消除应激反应对实验造成的干扰ꎬ再进行数据采集ꎬ采集过程中ꎬ周围环境保持安静ꎬ以排除噪音对实验的干扰ꎬ先对２８ħ条件下斑马鱼的行为活动进行监测ꎬ然后调节温控系统将水温直接降至１８ħꎬ监测斑马鱼在１８ħ条件下的行为活动ꎬ导出斑马鱼的运动轨迹图和热图ꎬ导出数据并分析斑马鱼的移动距离㊁平均速度㊁最大加速度和活跃度.单次实验监测时长为１０ｍｉｎꎬ每个温度条件设置３组平行实验.２.６㊀数据分析本实验在ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ８软件中进行数据分析及作图:采用Ｔ－ｔｅｓｔ法分析独立样本显著差异性ꎬ采用Ｌｏｇ－ｒａｎｋ(Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ)ｔｅｓｔ法分析生存曲线差异ꎬ采用ＭａｎｎＷｈｉｔｎｅｙｔｅｓｔ法分析半数致死时间差异.Ｐ<０.０５表示差异具有统计学意义.３㊀结果与分析３.１㊀低温下斑马鱼ｔｐ５３表达水平变化为探究低温处理后ＷＴ斑马鱼ｔｐ５３基因的表达变化ꎬ本实验通过ＲＴ－ｑＰＣＲ法检测了样品中ｔｐ５３的ｍＲＮＡ表达水平ꎬ结果如图２所示.低温处理后全鱼和鳃中ｔｐ５３的ｍＲＮＡ表达水平均显著升高ꎬ说明低温处理诱导了ｔｐ５３的转录.图２㊀低温胁迫下ＷＴ斑马鱼中ｔｐ５３基因的ｍＲＮＡ表达注:Ｔ检验ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ差异显著ꎻ∗∗Ｐ<０.０１ꎬ差异非常显著ꎻ∗∗∗∗Ｐ<０.０００１ꎬ差异极其显著.２５３㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０２３年㊀㊀㊀㊀㊀㊀３.２㊀Ｆ２代斑马鱼基因分型筛选为了对Ｆ２代斑马鱼进行快速筛选ꎬ本实验剪取Ｆ２代斑马鱼尾鳍ꎬ在敲除靶点上游和下游分别设计引物进行ＰＣＲ扩增.各基因型对应的琼脂糖凝胶电泳图如图３(ａ)所示ꎬ泳道１为ｔｐ５３－/－ꎬ泳道２为ｔｐ５３＋/－ꎬ泳道３为ｔｐ５３＋/＋.为进一步确认筛选个体基因型正确ꎬ通过测序法对Ｆ２代进行鉴定ꎬ序列比对如图３(ｂ ｄ)所示ꎬ结果表明成功筛选出了缺失８ｂｐ的Ｆ２代纯合子突变体斑马鱼ｔｐ５３－/－.为了检测斑马鱼中ｔｐ５３基因的表达ꎬ本实验对ｔｐ５３－/－和ＷＴ斑马鱼的ｔｐ５３表达量进行ＲＴ－ｑＰＣＲ检测ꎬ结果如图３(ｅ)所示ꎬ与ＷＴ相比ꎬｔｐ５３－/－斑马鱼的ｔｐ５３基因表达水平显著降低(Ｐ<０ ００１)ꎬ具有统计学差异.从图３(ｆ)看出ꎬ缺失８个碱基导致移码突变ꎬ翻译过程提前终止.图３㊀对Ｆ２代ｔｐ５３基因敲除斑马鱼进行筛选注:Ｔ检验ꎬ∗∗∗Ｐ<０.００１ꎬ差异十分显著.３.３㊀敲除ｔｐ５３基因对斑马鱼低温耐受能力的影响为了探究敲除ｔｐ５３基因对斑马鱼低温耐受能力的影响ꎬ本实验对ＷＴ和ｔｐ５３－/－斑马鱼进行低温处理ꎬ分别统计这两种基因型斑马鱼的生存时长ꎬ绘制生存曲线如图４(ａ)所示.结果显示ｔｐ５３－/－斑马鱼在８ħ低温下的生存率比ＷＴ显著增加(Ｐ<０.０００１).图４(ｂ)中ꎬＷＴ斑马鱼的ＬＴ５０为３５３㊀第４期㊀㊀㊀㊀贾惠莲ꎬ等:转录调节蛋白ＴＰ５３基因敲除增加斑马鱼耐寒能力与运动行为的研究㊀㊀４ｈꎬｔｐ５３－/－斑马鱼的ＬＴ５０为２４.５ｈꎬ敲除ｔｐ５３基因后斑马鱼的ＬＴ５０显著增加(Ｐ<０.０００１).本实验分别测量这两种基因型斑马鱼的体重和体长ꎬ数据分析表明体重㊁体长与斑马鱼的生存时长不具有相关性(图４(ｃ ｄ)).显著性差异分析显示体长和体重均不具有显著性差异(图４(ｅ ｆ)).以上结果说明ꎬ敲除ｔｐ５３基因后ꎬ斑马鱼的低温耐受能力增强.图４㊀斑马鱼低温耐受实验注:ｎｓꎬ没有显著性差异.３.４㊀敲除ｔｐ５３基因对斑马鱼运动行为的影响为了探究敲除ｔｐ５３基因是否会影响斑马鱼的运动能力ꎬ本文利用斑马鱼行为轨迹分析系统在２８ħ和１８ħ条件下对１月龄ＷＴ和ｔｐ５３－/－斑马鱼进行运动行为学监测ꎬ针对斑马鱼的移动距离(图５(ａ))㊁平均速度(图５(ｂ))㊁最大加速度(图５(ｃ))和活跃度(图５(ｄ))进行统计学分析.数据分析发现:在２８ħ条件下ꎬｔｐ５３－/－斑马鱼的移动距离㊁平均速度和活跃度均比ＷＴ斑马鱼显著升高(Ｐ<０.０００１)ꎬ最大加速度没有发生显著变化.在１８ħ低温条件下ＷＴ和ｔｐ５３－/－斑马鱼的移动距离㊁平均速度和活跃度均显著降低(Ｐ<０.０００１)ꎬＷＴ斑马鱼的最大加速度没有发生显著变化ꎬ但ｔｐ５３－/－斑马鱼的最大加速度显著降低(Ｐ<０.０５).在１８ħ条件下ꎬ与ＷＴ相比ꎬｔｐ５３－/－斑马鱼的移动距离(Ｐ<０.０００１)㊁平均速度(Ｐ<０.０００１)和活跃度(Ｐ<０.００１)显著升高ꎬ最大加速度没有发生显著变化.４５３㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０２３年㊀㊀㊀图５㊀ＷＴ与ｔｐ５３－/－斑马鱼的运动能力监测注:Ｔ检验ꎬ∗Ｐ<０.０５ꎬ差异显著ꎻ∗∗∗Ｐ<０.００１ꎬ差异十分显著ꎻ∗∗∗∗Ｐ<０.０００１ꎬ差异极其显著.４㊀讨论与结论已有研究发现ꎬ经１８ħ低温驯化处理后ꎬ甲基化ＤＮＡ免疫共沉淀测序(ＭｅｔｈｙｌａｔｅｄＤＮＡｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬＭｅＤＩＰ－ｓｅｑ)结合ｑＰＣＲ分析结果显示ꎬ斑马鱼胚胎成纤维细胞ＺＦ４中ｔｐ５３表达水平升高[１６].低温下斑马鱼和罗非鱼ＲＰＬ１１/ＭＤＭ２/Ｐ５３通路中Ｐ５３㊁核糖体蛋白(ｒｉｂｏｓｏｍａｌｐｒｏｔｅｉｎｓꎬＲＰｓ)ＲＰＬ１１和ｍｄｍ２(ｍｕｒｉｎｅｄｏｕｂｌｅｍｉｎｕｔｅｓ２)㊁ｂａｄ(ＢＣＬ２ａｓｓｏｃｉａｔｅｄａｇｏｎｉｓｔｏｆｃｅｌｌｄｅａｔｈ)的表达水平上调[１７].大黄鱼肝脏㊁肌肉㊁脑㊁脾脏㊁鳃㊁肾㊁肠和心脏中ｔｐ５３的ｍＲＮＡ表达水平在１４ħ低温处理一定时间后也显著上调[７].本研究中ＷＴ斑马鱼全鱼和鳃中ｔｐ５３的ｍＲＮＡ表达水平在８ħ低温处理后显著升高ꎬ与已有研究结果一致.上述研究均提示ꎬｔｐ５３在鱼类抵抗外界低温胁迫方面发挥了重要作用ꎬ具体调控作用还需深入探究.为排除母体干扰ꎬ本文在得到Ｆ２代ｔｐ５３－/－斑马鱼后ꎬ将Ｆ２代中ｔｐ５３－/－斑马鱼自交ꎬ获得Ｆ３代ｔｐ５３－/－斑马鱼进行实验研究.线粒体主要来自母体提供的卵细胞ꎬ属于母系遗传.已有研究发现ꎬＰ５３参与了线粒体相关生物学过程的调控ꎬ包括线粒体介导的凋亡㊁自噬和活性氧生成等过程[１８].本文对ＷＴ和ｔｐ５３－/－斑马鱼进行低温处理ꎬ在８ħ低温下ꎬＷＴ斑马鱼ＬＴ５０为４ｈꎬｔｐ５３－/－斑马鱼５５３㊀第４期㊀㊀㊀㊀贾惠莲ꎬ等:转录调节蛋白ＴＰ５３基因敲除增加斑马鱼耐寒能力与运动行为的研究㊀㊀㊀ＬＴ５０为２４.５ｈꎬ敲除ｔｐ５３基因后斑马鱼在８ħ低温下的ＬＴ５０增加ꎬ低温耐受能力增强ꎬ斑马鱼的生存时长没有受到体重和体长的影响.鱼类在低温下运动能力减弱ꎬ持续暴露于低温下身体会逐渐失去平衡ꎬ最终死亡[１９].在低温耐受实验中观察到ꎬ当温度降至１２ħ时ꎬＷＴ斑马鱼可保持身体平衡ꎬ但伏在水底ꎻｔｐ５３－/－斑马鱼仍可游动ꎬ但活动迟缓.基于此现象ꎬ本文探究了敲除ｔｐ５３基因对斑马鱼游泳行为的影响ꎬ在２８ħ和１８ħ条件下ꎬ与ＷＴ相比ꎬｔｐ５３－/－斑马鱼的移动距离㊁平均速度和活跃度均显著升高ꎬｔｐ５３基因敲除后ꎬ斑马鱼运动能力增强ꎻ当温度降至１８ħ后ꎬ与２８ħ相比ꎬ两种基因型斑马鱼的移动距离㊁平均速度和活跃度均显著降低ꎬ运动能力减弱.斑马鱼的简单运动行为学分析包括对逃避反应和游泳行为的研究ꎬ对斑马鱼逃避行为研究较多的是听觉刺激诱发的快速逃跑行为[２０]ꎬ而游泳行为是斑马鱼自发的运动行为.当外界环境温度发生变化时ꎬ包括鱼类在内的绝大多数物种可通过热调控行为(如生境温度选择行为㊁游泳行为㊁摄食行为和生殖洄游行为等)或偏好来应对环境压力ꎬ其中游泳行为是最重要的环境适应指标[９].在ｔｐ５３与运动能力调节的研究中发现ꎬ运动会影响ｔｐ５３基因的表达ꎬ这与诱发应激的刺激类型㊁刺激强度和持续时间相关[２１].田振军等[２２]发现对大鼠进行为期８周的有氧跑台训练会显著降低ｔｐ５３的表达.本文中ꎬ缺失ｔｐ５３基因后ꎬ在避免外界光线和声音刺激的条件下ꎬ斑马鱼的运动能力增强ꎬ说明运动能力的增强与ｔｐ５３基因的表达水平降低相关.神经系统负责接收和处理各种信息ꎬ并通过对周围环境和机体状态进行评估来调控机体行为以适应生存环境[２３].在对脊髓性肌萎缩症(ＳｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙꎬＳＭＡ)小鼠模型的研究中ꎬＰ５３蛋白积累会抑制运动神经元和脊髓中间神经元的功能ꎬ这可能是导致小鼠出现肌无力和肌萎缩症状的原因之一[２４].ｔｐ５３基因敲除的小鼠可以抵抗神经元退化ꎬ缺失ｔｐ５３基因还能增加由诱导多能干细胞分化而来的运动神经元的存活率[２５].Ａｍｓｏｎ等[２６]在圆形旷场实验中发现ꎬｔｐ５３基因敲除小鼠会出现焦虑样行为ꎬ而Ｃａｍｐａｎａ等[２７]在高架十字迷宫中的研究结果与此相反.焦翠等[２８]在方形旷场实验中发现ꎬｔｐ５３基因缺失不会导致小鼠出现焦虑样行为ꎬ也不影响其自发运动能力ꎬ这与Ｃａｍｐａｎａ等[２７]观点一致ꎬ这表明开阔旷场的形状可能对测试结果有一定影响.上述研究结果显示ꎬｔｐ５３与肌肉运动和神经系统之间存在一定联系ꎬ详尽的作用机制有待进一步阐明.Ｈｕ等[２９]发现随着低温暴露时间延长ꎬ在罗非鱼和斑马鱼鳃中的凋亡信号逐渐增强.在应激条件下ꎬＰ５３过度积累激活凋亡相关基因表达ꎬ这可能会造成组织发生不可逆损伤ꎬ进而导致鱼类死亡[１７].野生型ｔｐ５３的表达会增加缺失ｔｐ５３的小鼠成纤维细胞对４４ħ高温的热敏感性ꎬ这可能是由于Ｐ５３依赖的细胞凋亡被激活所导致的[３０].Ｌａｎｇｈｅｉｎｒｉｃｈ等[３１]发现与野生型相比ꎬｔｐ５３基因敲除斑马鱼胚胎经紫外线处理后凋亡水平减弱ꎬ这与Ｐ５３通过调节Ｐ２１表达促进细胞凋亡这一过程被阻断相关.当面临生存压力时ꎬ适度的自噬有利于细胞存活[３２].对人㊁小鼠和线虫的研究中ꎬ将ｔｐ５３进行敲除㊁敲降或使用抑制剂抑制ｔｐ５３表达ꎬ都能诱发自噬ꎬ这提高了细胞在缺乏氧气和营养物质条件下的存活率[３３].将ＺＦ４细胞[３４]和ＨｅＬａ细胞[３５]在１０ħ低温短期处理后自噬增强ꎬ使用ＢａｆｉｌｏｍｙｃｉｎＡ１阻断细胞自噬后ꎬ细胞存活率降低.对小鼠脑卒中模型和原代神经元体外氧糖剥夺模型进行处理ꎬ结果均显示ｔｐ５３缺失后神经元的凋亡和自噬水平较低ꎬＰ５３表达被抑制后ꎬ通过ｐ５３/ＰＲＡＳ４０/ｍＴＯＲ途径保护脑卒中后的神经元免受损伤ꎬ该途径调节的神经元自噬和凋亡过程可能是这种保护作用的潜在机制[３６].在低温应激下ｔｐ５３表达上调可能引发机体损伤进而导致斑马鱼死亡.敲除ｔｐ５３基因后斑马鱼耐寒能力增强ꎬ在同等低温处理时长下ꎬ由ｔｐ５３导致的机体损伤减弱ꎬ这种损伤可能与ｔｐ５３调节的细胞凋亡和自噬过程相关.综合本文和前人研究结果ꎬｔｐ５３可以促进细胞凋亡发生ꎬ同时６５３㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０２３年㊀㊀㊀㊀抑制抗凋亡基因的转录ꎬ过量的Ｐ５３积累加速斑马鱼在低温下的组织损伤进程ꎬ这可能是导致鱼类在低温胁迫下死亡的原因.缺失ｔｐ５３后ꎬ斑马鱼对低温的耐受能力增强ꎬ这提示ｔｐ５３对斑马鱼低温应激可能发挥负调控作用ꎬ涉及的具体调节机制还需深入研究.本文验证了在斑马鱼中ｔｐ５３基因与低温耐受能力和运动能力相关.斑马鱼在经受低温胁迫后ꎬｔｐ５３表达水平上调ꎻ敲除ｔｐ５３基因后斑马鱼的低温耐受能力和运动能力增强.这为进一步研究鱼类低温适应和运动行为的调控机制提供了研究基础.参考文献:[１]㊀ＬｕＤＬꎬＭａＱꎬＷａｎｇＪꎬｅｔａｌ.Ｆａｓｔｉｎｇｅｎｈａｎｃｅｓｃｏｌｄｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｆｉｓｈｔｈｒｏｕｇｈｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇｌｉｐｉｄｃａｔａｂｏｌｉｓｍａｎｄａｕｔｏｐｈａｇｙ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙꎬ２０１９ꎬ５９７(６):１５８５－１６０３.[２]㊀刘丽丽ꎬ朱华ꎬ闫艳春ꎬ等.鱼类低温耐受机制与功能基因研究进展[Ｊ].生物技术通报ꎬ２０１８ꎬ３４(８):５０－５７.[３]㊀ＳｏｙａｎｏＫꎬＭｕｓｈｉｒｏｂｉｒａＹ.Ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｌｏｗ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｔｏｌｅｒａｎｃｅｉｎｆｉｓｈ[Ｊ].ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１８ꎬ１０８１:１４９－１６４.[４]㊀ＬｅｖｉｎｅＡＪ.ｐ５３:８００ｍｉｌｌｉｏｎｙｅａｒｓｏｆｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｎｄ４０ｙｅａｒｓｏｆｄｉｓｃｏｖｅｒｙ[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗｓＣａｎｃｅｒꎬ２０２０ꎬ２０(８):４７１－４８０.[５]㊀ＳｔｏｒｅｒＮＹꎬＺｏｎＬＩ.Ｚｅｂｒａｆｉｓｈｍｏｄｅｌｓｏｆｐ５３ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎＢｉｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ２(８):ａ００１１２３.[６]㊀ＬｏｎｇＹꎬＬｉＬＣꎬＬｉＱꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｔｒｅｓｓｒｅｓｐｏｎｓｅｓｉｎｌａｒｖａｌｚｅｂｒａｆｉｓｈ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１２ꎬ７(５):ｅ３７２０９.[７]㊀ＱｉａｎＢＹꎬＱｉＸꎬＢａｉＹꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅｐ５３ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｏｆｔｈｅｌａｒｇｅｙｅｌｌｏｗｃｒｏａｋｅｒ(Ｌａｒｉｍｉｃｈｔｈｙｓｃｒｏｃｅａ)ｒｅｓｐｏｎｄｓｔｏａｃｕｔｅｃｏｌｄｓｔｒｅｓｓ:Ｅｖｉｄｅｎｃｅｖｉａｓｐａｔｉｏｔｅｍｐｏｒａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓｏｆｐ５３ꎬｐ２１ꎬＭＤＭ２ꎬＩＧＦ－１ꎬＧａｄｄ４５ꎬＦａｓꎬａｎｄＡｋｔ[Ｊ].ＰｅｅｒＪꎬ２０２０ꎬ８:ｅ１０５３２.[８]㊀ＧｏｎｇＬꎬＺｈａｎｇＱＨꎬＰａｎＸꎬｅｔａｌ.ｐ５３ｐｒｏｔｅｃｔｓｃｅｌｌｓｆｒｏｍｄｅａｔｈａｔｔｈｅｈｅａｔｓｔｒｏｋｅｔｈｒｅｓｈｏｌｄｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１９ꎬ２９(１１):３６９３－３７０７.[９]㊀吕为群ꎬ袁明哲.温度变化对鱼类行为影响的研究进展[Ｊ].上海海洋大学学报ꎬ２０１７ꎬ２６(６):８２８－８３５.[１０]㊀丁树哲ꎬ陈彩珍ꎬ漆正堂ꎬ等.不同强度训练对大鼠骨骼肌ｐ５３和细胞色素氧化酶Ｉ亚基基因和蛋白表达的影响[Ｊ].中国运动医学杂志ꎬ２００８ꎬ２７(４):４５４－４５７.[１１]㊀ＥｌａｂｄＳꎬＪａｂｅｅｎＮＡꎬＧｅｒｂｅｒＶꎬｅｔａｌ.Ｄｅｌａｙｉｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｎｄｂｅｈａｖｉｏｕｒａｌａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓｉｎｔｈｅａｂｓｅｎｃｅｏｆｐ５３ｉｎｚｅｂｒａｆｉｓｈ[Ｊ].ＰＬｏＳＯｎｅꎬ２０１９ꎬ１４(７):ｅ０２２００６９.[１２]㊀ＷａｌｌａｃｅＬＭꎬＧａｒｗｉｃｋＳＥꎬＭｅｉＷＹꎬｅｔａｌ.ＤＵＸ４ꎬａｃａｎｄｉｄａｔｅｇｅｎｅｆｏｒｆａｃｉｏｓｃａｐｕｌｏｈｕｍｅｒａｌｍｕｓｃｕｌａｒｄｙｓｔｒｏｐｈｙꎬｃａｕｓｅｓｐ５３￣ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｍｙｏｐａｔｈｙｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＡｎｎａｌｓｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙꎬ２０１１ꎬ６９(３):５４０－５５２.[１３]㊀ＤｕｆｆｙＫＴꎬＷｉｃｋｓｔｒｏｍＥ.Ｚｅｂｒａｆｉｓｈｔｐ５３ｋｎｏｃｋｄｏｗｎｅｘｔｅｎｄｓｔｈｅｓｕｒｖｉｖａｌｏｆｉｒｒａｄｉａｔｅｄｚｅｂｒａｆｉｓｈｅｍｂｒｙｏｓｍｏｒｅｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｔｈａｎｔｈｅｐ５３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｐｉｆｉｔｈｒｉｎ￣α[Ｊ].ＣａｎｃｅｒＢｉｏｌｏｇｙＴｈｅｒａｐｙꎬ２００７ꎬ６(５):６７５－６７８.[１４]㊀张美玲ꎬ郝鑫ꎬ周成杰ꎬ等.哺乳动物雌性生殖细胞及早期胚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斑马鱼神经功能研究进展[Ｊ].中国科学:生命科学ꎬ２０１５ꎬ４５(３):２２３－２３６.[２４]㊀ＳｉｍｏｎＣＭꎬＤａｉＹꎬｖａｎＡｌｓｔｙｎｅＭꎬｅｔａｌ.Ｃｏｎｖｅｒｇｉｎｇｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｐ５３ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｄｒｉｖｅｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｉｎｓｐｉｎａｌｍｕｓｃｕｌａｒａｔｒｏｐｈｙ[Ｊ].ＣｅｌｌＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１７ꎬ２１(１３):３７６７－３７８０.[２５]㊀Ｍａｏｒ￣ｎｏｆＭꎬＳｈｉｐｏｎｙＺꎬＬｏｐｅｚ￣ｇｏｎｚａｌｅｚＲꎬｅｔａｌ.ｐ５３ｉｓａｃｅｎｔｒａｌｒｅｇｕｌａｔｏｒｄｒｉｖｉｎｇｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｃａｕｓｅｄｂｙＣ９ｏｒｆ７２ｐｏｌｙ(ＰＲ)[Ｊ].Ｃｅｌｌꎬ２０２１ꎬ１８４(３):６８９－７０８.[２６]㊀ＡｍｓｏｎＲꎬＬａｓｓａｌｌｅＪＭꎬＨａｌｌｅｙＨꎬｅｔａｌ.Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌａｌｔｅｒａｔｉｏｎｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈａｐｏｐｔｏｓｉｓａｎｄｄｏｗｎ￣ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｅｓｅｎｉｌｉｎ１ｉｎｔｈｅｂｒａｉｎｓｏｆｐ５３￣ｄｅｆｉｃｉｅｎｔｍｉｃｅ[Ｊ].ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａꎬ２０００ꎬ９７(１０):５３４６－５３５０.[２７]㊀ＣａｍｐａｎａＡＬꎬＲｏｎｄｉ￣ｒｅｉｇＬꎬＴｏｂｉｎＣꎬｅｔａｌ.ｐ５３ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｌｅａｄｓｔｏｉｍｐａｉｒｅｄｍｏｔｏｒｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚａｔｉｏｎｉｎｍｉｃｅ[Ｊ].ＥｕｒｏｐｅａｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＮｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅꎬ２００３ꎬ１７(１０):２１３５－２１４６.[２８]㊀焦翠ꎬ王俭妹ꎬ周雪颖ꎬ等.ｐ５３基因敲除对小鼠神经行为及桶状皮层神经元数目的影响[Ｊ].中国实验动物学报ꎬ２０２１ꎬ２９(１):３５－４１.[２９]㊀ＨｕＰꎬＬｉｕＭＬꎬＬｉｕＹＭꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｒｅｖｅａｌｓａｇｅｎｅｔｉｃｎｅｔｗｏｒｋｒｅｇｕｌａｔｉｎｇｔｈｅｌｏｗｅｒｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｌｉｍｉｔｉｎｆｉｓｈ[Ｊ].ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｐｏｒｔｓꎬ２０１６ꎬ６:２８９５２.[３０]㊀ＭａｔｓｕｍｏｔｏＨꎬＴａｋａｈａｓｈｉＡꎬＷａｎｇＸꎬｅｔａｌ.Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｐ５３￣ｋｎｏｃｋｏｕｔｍｏｕｓｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｗｉｔｈｗｉｌｄ￣ｔｙｐｅｐ５３ｉｎｃｒｅａｓｅｓｔｈｅｔｈｅｒｍｏｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙａｎｄｓｔｉｍｕｌａｔｅｓａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｈｅａｔｓｔｒｅｓｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＲａｄｉａｔｉｏｎＯｎｃｏｌｏｇｙＢｉｏｌｏｇｙＰｈｙｓｉｃｓꎬ１９９７ꎬ３８(５):１０８９－１０９５.[３１]㊀ＬａｎｇｈｅｉｎｒｉｃｈＵꎬＨｅｎｎｅｎＥꎬＳｔｏｔｔＧꎬｅｔａｌ.Ｚｅｂｒａｆｉｓｈａｓａｍｏｄｅｌｏｒｇａｎｉｓｍｆｏｒｔｈｅｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｄｒｕｇｓａｎｄｇｅｎｅｓａｆｆｅｃｔｉｎｇｐ５３ｓｉｇｎａｌｉｎｇ[Ｊ].ＣｕｒｒｅｎｔＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００２ꎬ１２(２３):２０２３－２０２８.[３２]㊀ＷｈｉｔｅＥ.Ａｕｔｏｐｈａｇｙａｎｄｐ５３[Ｊ].ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＰｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓｉｎＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１６ꎬ６(４):ａ０２６１２０.[３３]㊀ＴａｓｄｅｍｉｒＥꎬＭａｉｕｒｉＭＣꎬＧａｌｌｕｚｚｉＬꎬｅｔａｌ.Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆａｕｔｏｐｈａｇｙｂｙｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃｐ５３[Ｊ].ＮａｔｕｒｅＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙꎬ２００８ꎬ１０(６):６７６－６８７.[３４]㊀胡春兰.自噬在斑马鱼细胞冷应激过程中的作用机制研究[Ｄ].上海:上海海洋大学ꎬ２０１７.[３５]㊀胡春兰ꎬ陈良标ꎬ胡成枫ꎬ等.自噬在细胞冷应激中的作用研究[Ｊ].中国细胞生物学学报ꎬ２０１６ꎬ３８(９):１０７７－１０８３.[３６]㊀ＺｈａｏＪＬꎬＤｏｎｇＹＨꎬＣｈｅｎＸＹꎬｅｔａｌ.ｐ５３ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｐｒｏｔｅｃｔｓａｇａｉｎｓｔｎｅｕｒｏｎａｌＩｓｃｈｅｍｉａ/ＲｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎＩｎｊｕｒｙｂｙｔｈｅｐ５３/ＰＲＡＳ４０/ｍＴＯＲＰａｔｈｗａｙ[Ｊ].ＯｘｉｄａｔｉｖｅＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＣｅｌｌｕｌａｒＬｏｎｇｅｖｉｔｙꎬ２０２１ꎬ２０２１:４７２９４６５.(责任编辑㊀李㊀超)８５３㊀㊀㊀辽宁大学学报㊀㊀自然科学版２０２３年㊀㊀。
实验七利用RT-PCR分析基因表达
目录
• 引言 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验注意事项与技巧 • 实验总结与展望
01 引言
目的和背景
研究基因表达
通过RT-PCR技术，可以检测特定基因在细胞或组织中的表达情况， 从而研究基因的功能和调控机制。
疾病诊断
RT-PCR技术可用于检测病原体基因的表达，如病毒、细菌等，为 疾病的诊断和治疗提供依据。
选择合适的PCR缓冲液和镁离子浓度，优化PCR反应体 系。
控制PCR循环次数，避免过度扩增导致非特异性产物的 生成。
调整退火温度和延伸时间，根据引物和模板的特性进行 优化。
使用高质量的DNA聚合酶和dNTPs，确保PCR反应的 准确性和效率。
06 实验总结与展望
本次实验成果回顾
实验目的实现
成功利用RT-PCR技术对目标基因在不同样本中的表达水平进行了 分析。
提高反转录效率和特异性方法
选择合适的引物，设计特异性强 的引物序列，避免非特异性扩增 。
使用高质量的RNA模板，避 免使用降解或污染的RNA。
优化反转录反应条件，如反应温 度和时间等，提高cDNA合成效 率。
在反转录反应体系中加入适量的 RNase抑制剂，防止RNase对 cDNA的降解。
优化PCR反应体系和条件建议
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荧光定量PCR原理
荧光基团标记
在PCR扩增过程中，引入荧光基 团标记的特异性探针或引物。随 着PCR反应的进行，荧光信号不
断累积。
实时监测
通过荧光检测系统实时监测PCR反 应过程中的荧光信号变化。荧光信 号与PCR产物的数量成正比，因此 可以通过荧光信号的强度来推算 PCR产物的数量。
p53基因在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达
p53基因在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达
弓军胜;兰丽珍;张宝林;杨时昕
【期刊名称】《山西医药杂志》
【年(卷),期】2004(033)007
【摘要】目的探讨p53基因在病理性瘢痕成纤维细胞中的表达情况及其意义.方法取手术切除的正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织各8例为标本,通过细胞培养6～8代后,应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)的方法检测p53 mRNA的表达.结果p53 mRNA在正常皮肤高表达,而在增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组明显减弱,差异具有显著性(P＜0.05).结论p53基因介导了瘢痕疙瘩成纤维细胞的异常增生,是病理性瘢痕发生的分子机制之一.
【总页数】2页(P547-548)
【作者】弓军胜;兰丽珍;张宝林;杨时昕
【作者单位】山西医科大学第一医院,030001;山西医科大学第一医院,030001;山西医科大学第一医院,030001;山西医科大学第一医院,030001
【正文语种】中文
【中图分类】R3
【相关文献】
1.病理性瘢痕中VEGF与突变型P53基因表达的关系 [J], 蔡玉梅;朱世泽
2.病理性瘢痕成纤维细胞E2F1 mRNA的表达及其在瘢痕形成中的生物学作用 [J], 张怀军;邢新;王大为;李蠡;文军慧;黄兴华
3.病理性瘢痕及正常皮肤中成纤维细胞CD90表达情况的研究 [J], 苏卫国;李永林;詹升华;顾永平
4.Notch1表达下调抑制病理性瘢痕成纤维细胞增殖并诱导其凋亡 [J], 苏江维; 余慧; 杜坤; 汪洁; 柳林; 蔡剑
5.病理性瘢痕及正常皮肤中成纤维细胞CD90表达情况的研究 [J], 杨炳林;肖坚;陈昌明;陈文新;王合兵
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生化讨论课4.3
琼脂凝胶电泳原理：DNA分子在琼
脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子 筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分 出不同的区带。
模板合成cDNA第一条链； 2、Rnase水解活性/RNase H活性：水解
RNA与DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条
DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
T s i n gCheunat r Ua ln iSv oe ur st hi t yU noifv eCrhsi int ay
02 引物设计的工具
1.Primer premier : Premier是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探 针的设计和评估的软件，应该是使用范围最广的一款软件了。主要界面有序列编辑窗口 （Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和 Motif 分析窗口。
主要功能分四种，引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析功能。
2. Oligo7 : 该软件主要应用于核酸序列引物分析设计，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论 预测序列。作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，其主要功能包括：普通引物 对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。它的引物分析功能如此强大 以至于能风靡全世界。
https:///genban k/
自知自 强 行强 不 合不 息 一息 、厚厚经德德世载载致物物用
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检测p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义
检测p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义乳腺癌是威胁妇女健康的常见恶性肿瘤之一。
其中，乳腺浸润性导管癌是最常见的一种类型，尤其是在发达国家。
指南建议对癌症进行分类，以便为患者制定最佳的治疗方案。
因此，仔细研究乳腺癌的分子特征对于患者治疗非常重要。
p53是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞中有多种功能。
它可以通过不同的途径参与细胞周期调控，DNA修复，细胞凋亡和基因转录等生物学过程。
p53的功能受到多种信号通路的调节和调节。
p53功能的缺失或突变在多种肿瘤中都有报道，包括乳腺癌。
在乳腺癌中，p53的突变频率特别高，尤其是在乳腺浸润性导管癌中。
因此，p53的表达已成为乳腺癌的一个重要标志物。
研究表明，p53在患有乳腺浸润性导管癌的患者中表达水平显著升高。
这种高表达可能与p53的突变有关。
p53蛋白的突变可以导致其结构和功能的改变，从而影响其正常的细胞周期调节和DNA修复功能。
这些改变可能导致癌细胞的不受控制繁殖和肿瘤的恶性扩散。
因此，对p53蛋白在乳腺癌中的表达进行监测，可以帮助医生对患者进行更准确的诊断和治疗方案选择。
现代医学技术已经可以检测p53蛋白在乳腺癌中的表达。
通常，医生会在切除乳腺组织后，对癌细胞进行p53蛋白的染色，然后使用显微镜观察染色结果。
如果p53在癌细胞中完全缺失或表达异常高，这可能是乳腺癌的一个标志。
此外，还可以使用其他技术，如免疫印迹和RT-PCR，来检验p53蛋白的表达和突变。
综上所述，p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达意义非常重要。
这可以帮助医生为患者制定最佳的治疗方案。
因此，p53的检测需要成为乳腺癌分子诊断的一部分。
未来，我们需要进行更多研究，以加深我们对乳腺癌的分子机制的了解，从而制定更好的治疗方案。
P53基因在甲减肾组织中的表达及意义代永红
甲减是指组织中甲状腺激素作用不足或缺如的一种病态,其对肾脏结构和功能的损伤已日益受到人们的关注。
本文研究了甲减状况下大鼠肾脏组织P53mRNA的表达变化,以探讨甲减肾损伤的发病机制。
1 资料及方法1.1 实验分组选择40只健康Wistar 大鼠,雌雄各半,均为4~5周龄,体重为70~100克,随机平均分为HYPO组和CL组。
1.2 动物模型的复制二组大鼠通过给予不同碘浓度的饮水进行分组。
摄碘情况:CL组 10μg/d,HYPO组1.24 μg/d。
均在饲养16周后杀死,留存血清、肾脏组织,放置于-80℃冰箱中冻存备用。
1.3 甲状腺功能测定酶联免疫吸附方法测定TSH,试剂盒购自上海麦莎生物科技有限公司(96T/48T,美国原装进口)。
化学发光免疫分析方法测定血清TT3、TT4、FT3、FT4的水平,设备应用ACS:180全自动化学发光免疫分析仪(拜耳);试剂为ACS:180全自动化学发光免疫分析仪随机试剂(Siemens Medical Solutions Diagnostics)。
1.4 形态学变化以模型为基础,对二组大鼠肾脏组织进行切片,在光镜下观察其形态学变化。
1.5 RT-PCR样品采取-80℃保存的新鲜的肾脏组织,利用Trizol一步法抽提出总的RNA,再将其逆转成cDNA,再应用PCR的方法扩增目的基因P53。
P53引物序列为:上游5′-CCGT A TGCTGAGT A TCT-3′,下游5′-A C A A A C A C G A A C C T C A A-3′,扩增产物长度225b p。
内参照β-a c t i n引物序列为:上游5′-CATCACTATCGGCAATGAGC-3′,下游5′- 数为:预变性94℃2min,94℃×45s+56 ℃×45s+72℃×60s×28个循环,总延伸72℃5min。
1.6 统计学处理采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析,以(x±s)行数据表示,随机设计的两样本采用t检验,以P<0.05差异有统计学意义。
P53基因在血细胞中的表达
• 引物 2μ l
• RNA sin 0.5μ l • 65℃ 15分钟 • 立即放入冰浴
• 10mM dNTP 1μ l
• 5×RT 缓冲液 4μ l • 25mM MgCl2 4μ l • AMV 逆转录酶 3μ l • 37℃ 1.5小时
• 94℃ 5-10分钟
• 进行PCR
反应条件及试剂
PCR第一步
果复性温度太低，引物将产生非特异性复性，从而导致非特异性的DNA片段的扩增。复性通常在比理论计算的
引物和模板的溶解温度低3—5℃的条件下进行。 • PCR扩增所需的循环数目决定于反应体系中起始的模板拷贝数以及引物延伸和扩增的效率。一旦PCR反应进入几 何级数的增长期，反应会一直持续下去，直至某一成分成为限制因素。从这一点上来说，扩增产物中绝大多数应 该是特异性的扩增产物，而非特异性的扩增产物应该低到难以检测到的程度。用TaqDNA聚合酶（效率为0.7） 在一个含有10的5次方个拷贝的靶序列的反应体系中进行30个循环后往往可以做到上述的理想情况。
P53基因在血细胞中的表达
RT-PCR的应用
技术介绍：RT-PCR
• RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即 逆转录PCR
• RT- PCR首先经反转录酶的作用以RNA合成 cDNA，再以cDNA为模 板，扩增合成目的片段。
p53基因序列的获取
• 在Genbank上搜索AF136270.1得到p53基因的序列，显示有8个外显子，为了
提高特异性，选择包含2个外显子的序列，选择外显子3和7，复制其对应的序
列拼接在一起，在genbank的设计引物工具里面获取引物序列。详细步骤如下：
肝癌及癌旁组织中P53基因第七外显子转录水平的表达差异及临床意义
肝癌及癌旁组织中P53基因第七外显子转录水平的表达差异及临床意义陈益存;陆东东;谢蓓;蒋华云;曹祥荣;张锡然【期刊名称】《陕西医学杂志》【年(卷),期】2004(33)6【摘要】目的:研究启东区肝癌中P53基因第七外显子转录水平的表达及其与患者临床病理特征间的关系.方法:通过RT-PCR确定P53基因第七外显子在47对肝癌标本中的表达,并分析其与肝癌患者临床病理特征间的关系.结果:P53基因第七外显子在肝癌及其癌旁组织中均显示差异表达,其中17例为上调表达,30例为下调表达,上下调表达之间差异显著;女性、年龄≥45岁、AFP(+)、HBsAg(+)、癌栓(+)、肝硬化、病理Edmondson's Ⅲ级的病例中P53基因第七外显子均呈显著下调表达;Edmondson's I级病例肝癌组织中P53基因的EI显著高于Edmondson's Ⅲ级病例.结论: 启东肝癌中P53基因第七外显子转录水平上存在表达差异,且其异常表达与肝癌的临床病理特征有关.【总页数】3页(P495-497)【作者】陈益存;陆东东;谢蓓;蒋华云;曹祥荣;张锡然【作者单位】南京师范大学生命科学学院,南京,210097;南京师范大学生命科学学院,南京,210097;南京师范大学生命科学学院,南京,210097;南京师范大学生命科学学院,南京,210097;南京师范大学生命科学学院,南京,210097;南京师范大学生命科学学院,南京,210097【正文语种】中文【中图分类】R735.7【相关文献】1.肝癌及癌旁组织中P53基因及AFP、CEA表达异常及相关研究 [J], 李星;李伟;等2.Sirt1在肝癌及癌旁组织中的表达差异研究 [J], 王汉宁;冯志强;向国安;张洪义;陈开运;肖金丰;贺轲;段小鹏3.C-myc、p53基因和AFP在家兔诱发性肝癌及癌旁组织中的表达 [J], 陈华;吴小红;谢忠忱;刘亚千;李春海4.肝癌及癌旁组织中p53基因及AFP、CEA等表达异常及相关性研究 [J], 李星;楚贻康;李伟;王学春;张金池5.肝癌及癌旁组织中p53基因及AFP、CEA等表达异常及相关性研究 [J], 李伟;王学春;李星;张金池因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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RT-PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达
一、实验原理
细胞内RNA通常与蛋白质结核，防止RNA酶讲解，以核蛋白形式存在。
分离制备RNA 是必须先破碎细胞，使得核蛋白释放到溶液中，并进一步与蛋白质分离，然后再讲RNA 与其他成分分离，并保证RNA的完整性。
1、Trizol法
该法分离提取RNA产率高、纯度好且不易降解，是目前实验室中最常用的提取RNA
的方法。
Trizol是一种总RNS抽提试剂，含有苯酚（蛋白质变性，膜蛋白变性、
膜磷脂溶解、RNA酶变性保护RNA）、异硫氰酸胍（蛋白质变性、RNS酶抑制剂）等
物质，可以迅速溶解细胞同时保护RNA完整性。
之后再加入氯仿抽提，离心后，RNA
位于水相，用异丙醇可沉淀回收水相中的RNA。
2、RNA质量标准
RNA的均一性以及完整性，均一性在于有效去除其他成分，完整性在于最大限度减
少RNA酶对RNA的讲解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度：
A260/A280=1.7~2.0，低于该值表明有蛋白污染。
PCR
3、PCR
聚合酶链式反应是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术。
利用两段已
知序列度寡核苷酸作为引物，将两引物间特定的DNA片段进行复制，经过多次循环，使得模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。
其基本过程分为变性、退火、延伸三个
步骤。
变性是高温加热导致模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使得模板DNA
与高浓度引物间发生互补结合，延伸是在耐热DNA聚合酶参与下延伸引物。
每次循
环可作为下一次循环的模板，因此每经过一次循环特定DNA的分子数目扩增一倍。
4、RT-PCR
反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。
RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在
组织细胞中的表达情况。
成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然
后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。
本实验先用Oligo引物反转录合成细胞cDNA模板，再用p53特异引物进行PCR扩
增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53基因在两种肺癌细胞的表达水平。
二、实验步骤
1、细胞RNA的提取及鉴定
2、RT-PCR检测p53表达
三、 实验结果
1、 RNA 浓度=0.8299ug/ul
2、 A260=20.748
A280=10.436 A260/A280=2.01 3、 pcr 结果
四、 实验讨论
图中1、3、5、7组为A549细胞，是p53野生型，在390bp位置应产生扩增条带。
2、4、6、8、9为H1299细胞，是p53缺失型在390bp处不应产生扩增条带。
GAPDH为管家基因，在两种细胞中均应稳定表达，电泳后应在320bp处产生扩增条
带。
我们组做的是H1299型细胞，在390bp处未产生扩增条带，与实验结果相符
（后来发现应该做A549，可能听错了，不过我们整个实验从细胞到之后的步骤都
是按照H1299做的，结果没有问题）。
本实验室，除了第3组以外其他组的实验结果均与预期相符。
第3组为A549但未在390bp处产生扩增条带，第3组做了GADPH的阳性对照，结果在320bp处
出现了扩增条带，所以认为该组实验操作、RNA提取、pcr过程等均没有太大问题。
分析可能原因，据该组同学表示，他们在实验中间因为离心时液体洒出，曾经换
过一次细胞，不确定老师给他们地是否还是A549型细胞。
本次实验中我学会了以下几点：
(1)提取RNA并防止RNA被降解，在提取RNA过程中要需要保证蛋白质分离干净以
及抑制RNase活性与外界RNase混入体系使得RNA降解。
(2)为了使得RNA与蛋白质分离在萃取过程中要充分震荡混合。
(3)RNase无处不在，提取RNA时要格外注意。
(4)可以用A260/A280比值来判断RNA提取纯度，A260/A230表示碳水化合物如盐
的混入程度。
(5)pcr变性后要立即置于冰上，防止双链再结合。
(6)GAPDH为管家基因，稳定表达于各种细胞，可以用于做阳性对照。
(7)跑胶加样前要设计好每孔加什么，不要再出现这次的混乱现象。
(8)拿试剂时要看好老师的要求，不要再拿错了。
五、思考题
1、测定A260、A280、A260/A280的意义？
A260是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1至1.0。
A280是是
蛋白和酚类物质最高吸收峰的吸收波长。
A260/A280可进行核酸样品纯度评估,纯
RNA比值为2.0，一般提取RNA比值在1.7~2.0间较为合适，低于1.7表明有蛋白
污染，大于2.0可能出现一般降解，如重复读数无误并不表示纯度有问题。
2、如何避免RNA的降解？
需要创造一个无RNase的环境，并在操作各个环节尽量避免RNase的污染。
如实验
中加入异硫氰酸胍、RNasin为RNase抑制剂，再如实验操作中要专门使用无RNase
的水以及枪头，实验要戴口罩以及手套防止外界RNase污染试剂。
3、RT-PCR技术的基本原理？
反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。
RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在
组织细胞中的表达情况。
成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然
后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。
本实验先用
Oligo引物反转录合成细胞cDNA模板，再用p53特异引物进行PCR扩增，最后通
过琼脂糖凝胶电泳分析p53基因在两种肺癌细胞的表达水平。
4、RT-PCR的主要应用？
（1）基因定量：癌症基因及免疫基因定量
（2）病原菌侦测：Ecoli O157
（3）病毒侦测：HBV
（4）GMO检测
（5）SNP Genotyping
5、何为基因表达的细胞特异性？
具有相同遗传信息的同一个体细胞间其所利用的基因并不相同，主要分为两类,一类是维持细胞基本生命活动所必须的，称管家基因，如各种组蛋白基因,一类是指导合成组织特异性蛋白的基因，对分化有重要影响，称奢侈基因，即组织特异性表达的基因，如表皮的角蛋白基因、肌肉细胞的肌动蛋白基因和肌球蛋白基因、红细胞的血红蛋白基因等。
这类基因与各类细胞的特殊性有直接的关系, 是在各种组织中进行不同的选择性表达的基因，即使细胞特异性基因。
在特定组织中保持非甲基化或低甲基化状态，而在其他组织中呈甲基化状态。
6、p53的功能？
P53为人体抑癌基因，促进癌细胞凋亡，从而防止癌变，还具有帮助细胞基因修复缺陷的功能。
该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质，命名为p53。
但是另一方面，因其具有帮助细胞基因修复缺陷的功能，对于受化疗药物作用而受伤的癌细胞，则起修复作用，而不是使癌细胞自杀，造成被修复的癌细胞在治疗后成为新的肿瘤。