RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达

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cDNA
假阳性对照（出现的PCR扩增 条带一致，有时更整齐更明亮）
假阴性对照（什么条带没有）
汇报人：李尽美
日期：2016-11-21
Northern 印记杂交
特异性引导
PCR
基因表达水平
Ques
反转录酶
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依 赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： (1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条 链；
(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； (3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补 的双链cDNA.
引物设计12
所选引物
确定参数
cDNA size:434bp
变性 退火 55度 45秒
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94度
30秒
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延伸 73度 60秒
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循环 27次
确定参数
变性
模板DNA由双链变成单链，有 利于与引物结合。可根据模板的 复杂程度调整变性温度和时间， 一般情况下94C 30秒可使各种 复杂的DNA分子完全变性。
03
05
特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为 引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特 异的PCR扩增。
Ques
查找P53序列
使用GENBANK，P53登陆号AH007667 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank
查找P53序列
查找P53序列
确定参数
退火温度：50℃~54℃
Ques
检测基因的表达
琼脂糖凝胶电泳分离产物：
根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，取适量 PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好 的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。 成像系统成像分析。
检测基因的表达
Marker（DNA分子量标准）
引物设计
PRIMER PREMIER 5.0 Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序 引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗 口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（ Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引 物设计功能。
引物设计1
启动界面
引物设计2
在此输入需扩增的DNA序列
引物设计3
引物设计4
引物设计5
引物设计6
引物设计7
引物设计8
Hairpin：发夹结构 Dimer：二聚体 False Priming：错配 Cross Dimer：交叉二聚体
引物设计9
引物设计10
引物设计11
保存
选择满意的引物
设计引物确定参数
检测p53基因在血细胞中的表达
Ques
基因检测的方法
在DNA水平
Northern印记杂交 RT-PCR .......
在MRNA水平
在蛋白质水平
Northern印记杂交
Reverse Transcription PCR
反转录
RNA提取
随机六核苷酸引 物引导
cDNA
Oligo(dT)引导
P53基因
P53基因
命名 该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质 功能作用 重要的抑癌基因，防止癌变 细胞基因的修复功能
RT-PCR
RT-PCR(反转录PCR技术)
RNA的反转录（reverse transcription ）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技 术。
基因表达的检测方法 反转录的引物 在GenBank中查找p53基因
反转录可用的引物
01
随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子 全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中 赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中 96%来源于rRNA。 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。 因 绝 大 多 数 真 核 细 胞 mRNA 具 有 3’ 端 Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可 被转录。
查找P53序列
引物设计的原则
引物应用核酸系列保守区内设计 并具有特异性
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碱基要随机分布
产物不能形成二级结构
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引物自身及之间不能有连续4个碱 基的互补
百度文库
引物长度一般在15~30碱基之间
引物5′端可以修饰 引物3’端不可修饰
G+C含量在40%~60%之间
引物3′端要避开密码子的第3位
Ques
退火
四项 参数
变性的DNA快速冷却至40－ 60C可使引物和模板DNA发生 结合。可根据引物的长度和G＋ C的含量选择复性温度
延伸
一般是70－75C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。<1kb， 1分钟；>1kb的可适当延长时 间。
循环次数
理论上20－25个循环PCR产物的 累计即可达到最大值、实际操作中 25－30较合理。