RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理RT-PCR（Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于检测基因表达水平。
其原理是通过逆转录将RNA转化为cDNA，并利用聚合酶链式反应（PCR）扩增目标基因的序列，最终定量检测目标基因的表达水平。
下面将详细介绍RT-PCR的原理。
1.逆转录（Reverse Transcription）逆转录是RT-PCR的第一步，主要是将目标基因的RNA转化为互补的DNA，即cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶（Reverse Transcriptase）和引物（Primers）的参与。
首先，待检测的RNA通过加热来解旋成为单链。
然后，在逆转录反应中，引物（Primers）结合在RNA的末端，提供一个起始点。
逆转录酶（Reverse Transcriptase）将引物作为模板，合成互补的DNA链。
引物一般选择Oligo-dT引物，它可以与RNA的多聚腺苷酸尾端结合，从而引导逆转录酶合成cDNA链。
此外，逆转录反应还需要dNTP（脱氧核苷酸三磷酸盐）和逆转录缓冲液等辅助物资。
2. PCR扩增（Polymerase Chain Reaction）逆转录后得到的cDNA是目标基因的复制物。
为了增加检测敏感性，需进一步扩增cDNA序列。
在PCR扩增过程中，引物（Primers）的作用是选择目标基因的特异序列，通过引物与目标序列的互补配对，使DNA聚合酶（DNA Polymerase）能够在相应的温度下在该位置合成新的DNA链。
PCR扩增需要参与的物质有DNA聚合酶、引物、dNTP、缓冲液和模板DNA。
引物是PCR反应中的关键，其中一对引物的设计应使其能够选择性地与目标基因序列的两个位点互补，从而能够在接下来的扩增反应中产生目标DNA片段。
PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和扩增。
首先，通过高温（通常为94℃至96℃）变性步骤将目标DNA链分离为两个单链。
p53基因与蛋白质水平检测技术方法
p53基因与蛋白质水平检测技术方法
检测p53基因和蛋白质水平的常用技术方法有：
1. 基因测序：通过测序技术检测p53基因的DNA序列，从而
确定基因是否存在突变或缺失。
2. PCR（聚合酶链反应）：通过特异性引物扩增p53基因的片段，采用凝胶电泳或实时荧光定量PCR测定扩增产物的数量。
3. Southern印迹：通过限制性内切酶切割DNA并通过凝胶电
泳分离DNA片段，然后将片段转移到膜上并进行特异性探针
杂交，来检测p53基因是否存在缺失或重组。
4. Northern印迹：通过RNA提取、琼脂糖凝胶电泳和探针杂
交技术，来检测p53基因的转录水平。
5. Western印迹：通过蛋白质提取、SDS-PAGE凝胶电泳、膜
转移和抗体识别等步骤，来测定p53蛋白质的表达水平。
6. 免疫组织化学染色：通过对组织标本进行抗体染色，来观察p53蛋白质在组织中的表达。
7. 免疫荧光染色：通过使用荧光标记的抗体与细胞中的p53蛋白质结合，然后通过荧光显微镜观察p53蛋白质的分布和表达情况。
8. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：通过特异性抗体与p53蛋白
质结合，在酶的作用下产生发光或色素反应来测定p53蛋白质的浓度。
9. 质谱法（Mass spectrometry）：通过分析p53蛋白质的质量和碎片谱图，确定蛋白质是否含有突变。
以上这些方法可以在基础科研和临床实验室中使用，用于检测p53基因和蛋白质的水平，以研究其在细胞内的作用及与疾病的关联。
RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告
RT PCR 方法检测细胞中p53基因的特异表达预习报告1310301315 张铨一、RT PCR技术1.基本原理聚合酶链反应(PCR)技术是利用DNA聚合酶在体外条件F．催化一对特异引物之间特异DNA片段合成的基因扩增技术。
PCR包括三个基本过程：(1)变性，在高温度条件下使双链模板DNA变性、解链，成为两条单链DNA；(2)退火，在较低温度时使加入的引物单链DNA模板特异性结合；(3)延伸，在适当的温度下，Taq DNA聚合酶从结合到DNA模板上的引物3’-OH 端开始．根据碱基互补配对原则，按照DNA模板核苷酸序列，进行DNA链的延伸，合成与模板互补的新的DNA分子，，这三个过程组成一个循环周期；每个周期合成的产物又可作为下一个周期的模板，如此循环往复，经过若干次循环后，目的DNA片段的拷贝数大最增加。
RT-PCR方法由两部分组成：(1)cDNA的合成：以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下以Oligo（dT）16或特异的下游引物合成与mRNA互补的cDNA片段(2)PCR扩增：以已合成的cDNA为模板，使用上、下游引物在耐热的DNA聚合酶作用下进行标准的PCR扩增。
12.实验方法【实验材料】1．试剂(1)β-actin引物上游引物：5 7一ATG CGA ATT CCC AAC CGT GAA AAG ATG A-3’下游引物：5 7一ATG CGG ATC CGA AGG AAG GCT GGA AAA一3’(2)Promega RT-PCR试剂盒(3)酚／氯仿：1：1混合(4)醋酸钠：3mol／L，pH5．2(5)无水乙醇2．仪器基因扩增仪(PCR仪)，5415R型离心机，电泳仪，电泳槽，紫外检测仪，制冰机，低温冰箱，可调式取液器，解剖用具。
3．耗材0．2ml、1．5ml Ep管，20μl和200μl吸头若干个。
【实验步骤】1．反转录合成cDNA(1)RNA预变性(打开RNA二级结构)：取1支0．2ml Ep管加入样品RNA 2μl无RNase水 7μl70℃，10min，立即置冰上。
RT PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达
RT-PCR方法检测细胞中p53基因的特异表达一、实验原理细胞内RNA通常与蛋白质结核，防止RNA酶讲解，以核蛋白形式存在。
分离制备RNA 是必须先破碎细胞，使得核蛋白释放到溶液中，并进一步与蛋白质分离，然后再讲RNA 与其他成分分离，并保证RNA的完整性。
1、Trizol法该法分离提取RNA产率高、纯度好且不易降解，是目前实验室中最常用的提取RNA的方法。
Trizol是一种总RNS抽提试剂，含有苯酚（蛋白质变性，膜蛋白变性、膜磷脂溶解、RNA酶变性保护RNA）、异硫氰酸胍（蛋白质变性、RNS酶抑制剂）等物质，可以迅速溶解细胞同时保护RNA完整性。
之后再加入氯仿抽提，离心后，RNA位于水相，用异丙醇可沉淀回收水相中的RNA。
2、RNA质量标准RNA的均一性以及完整性，均一性在于有效去除其他成分，完整性在于最大限度减少RNA酶对RNA的讲解。
通常采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度：A260/A280=1.7~2.0，低于该值表明有蛋白污染。
PCR3、PCR聚合酶链式反应是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术。
利用两段已知序列度寡核苷酸作为引物，将两引物间特定的DNA片段进行复制，经过多次循环，使得模板上特定DNA拷贝数呈指数级增长。
其基本过程分为变性、退火、延伸三个步骤。
变性是高温加热导致模板DNA双链间的解离，退火是降低温度使得模板DNA与高浓度引物间发生互补结合，延伸是在耐热DNA聚合酶参与下延伸引物。
每次循环可作为下一次循环的模板，因此每经过一次循环特定DNA的分子数目扩增一倍。
4、RT-PCR反转录聚合酶链式反应是将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增。
RT-PCR实质上是对mRNA的扩增，我们常用此法克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
成熟的mRNA3’端有Poly尾可与Oligo特异性结合，然后在反转录酶催化下以mRNA为模板合成一条互补DNA链称为cDNA。
rt-pcr检测基因表达水平的原理
rt-pcr检测基因表达水平的原理一、 rt-pcr检测基因表达水平的基本原理1. rt-pcr技术是一种用来检测基因表达水平的常用方法，其中rt代表逆转录（reverse transcription），pcr代表聚合酶链式反应（polymerase ch本人n reaction）。
2. rt-pcr技术通过将RNA转录成cDNA，然后进行聚合酶链式反应来扩增特定基因的片段，从而检测基因的表达水平。
3. rt-pcr检测基因表达水平的原理可以分为逆转录和聚合酶链式反应两个步骤。
4. 逆转录是将RNA转录成cDNA的过程，通过逆转录酶（reverse transcriptase）的作用，RNA可以被转录成cDNA。
5. 聚合酶链式反应是将cDNA扩增的过程，通过聚合酶和引物（primer）的作用，cDNA可以被扩增成大量的目标片段。
二、 rt-pcr检测基因表达水平的具体步骤1. 提取RNA：首先需要从待检测的组织或细胞中提取总RNA，保证RNA的完整性和纯度对后续实验非常重要。
2. 逆转录：将提取的RNA进行逆转录反应，将RNA转录成cDNA。
逆转录反应需要逆转录酶和随机引物或特异性引物。
3. pcr扩增：将逆转录后得到的cDNA进行聚合酶链式反应，使用特异性引物对目标基因进行扩增。
聚合酶链式反应的过程需要聚合酶、引物和dNTP。
4. 分析结果：最后通过凝胶电泳或实时荧光定量PCR等方法对扩增产物进行定量和分析，得到基因表达水平的信息。
三、 rt-pcr检测基因表达水平的优缺点1. 优点：rt-pcr检测基因表达水平的灵敏度高，可以检测低表达基因；检测结果定量化准确，能够得到基因的具体表达量；方法简单、快速、高效，适用于大规模的基因表达分析。
2. 缺点：需要严格控制反应条件和引物设计，以避免假阳性结果；受到RNA的完整性和纯度的影响，需谨慎处理RNA样本；无法区分剪接异构体，对于复杂基因的表达分析存在局限性。
细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达
实验报告实验题目：细胞RNA的提取及鉴定、RT-PCR检测p53基因的表达报告人：张铨合殷悦涵实验日期：2021.4.26一、实验原理1. 细胞RNA的提取及鉴定细胞内RNA通常与蛋白质结合，以核蛋白〔RNP〕的形式存在。
别离、制备RNA时首先须破碎细胞，使RNP释放到溶液中并与蛋白质别离，然后将RNA同其他的细胞成分别离开并保证RNA的完整性。
Trizol法别离提取的RNA产率高、纯度好且不易降解，它是一种总RNA抽提试剂，可以直接从细胞或组织中提取总RNA。
由于RNase能迅速降解RNA，所以需创造一个无RNase的环境，在各个环节防止它的污染。
评价RNA质量的标准是RNA的均一性和完整性，采用紫外分光光度法测定RNA的浓度和纯度，纯RNA的A260/280=2.0，实验室条件下一般在1.7-2.0之间，低于该值说明有蛋白污染，需要进一步抽提。
2. RT-PCR检测p53基因的表达PCR是一种体外大量扩增特异DNA片段的分子生物学技术，利用序列作为引物，将两引物之间的特定DNA片段进行复制，经过屡次循环是模板上特定DNA 拷贝数呈指数级增长。
根本过程为变性、退火、延伸三个步骤循环往复进行，每一轮过后特定的DNA片段的分子数增加一倍。
RT-PCR将mRNA反转录合成cDNA后再经PCR进行大量扩增，实质上是对mRNA 的扩增，常利用此技术克隆cDNA或分析某一特异基因在组织细胞中的表达情况。
本实验先以Oligo引物来反转录合成细胞cDNA模板，然后采用p53特异性引物进行PCR扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析p53在两种肺癌细胞〔A549和H1299〕中的表达水平。
二、实验材料及设备材料：肺癌细胞A549〔野生型〕和H1299〔p53缺失型〕、p53引物、GAPDH 引物试剂：Trizol试剂、氯仿、异丙醇、无RNase水、乙醇、、Promega RT-PCR 试剂盒、2*TaqPCR mix 、DNA染料：GoldView、5*TBE、6*上样缓冲液、DNA分子量标准、琼脂糖耗材：Ep管、吸头、一次性手套、口罩设备：5415R型冷冻离心机、NanoDrop2000超微量分光光度计、高压消毒锅、恒温枯燥箱、制冰机、可调式取液器、PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外检测器、凝胶成像系统、冰箱三、实验步骤1. 细胞RNA的提取及鉴定〔一〕RNA提取取1*106个细胞与1.5mlEp管→加0.2ml氯仿摇匀→4℃，12000rpm离心15min分层→取上层水相入新的Ep管中参加等体积异丙醇，摇匀，室温静置10min →4℃，12000rpm离心10min，RNA沉淀→弃上清，加1ml75%乙醇洗涤沉淀→4℃，12000rpm离心5min→弃上清，晾干，用30μl无RNase水溶解沉淀〔二〕RNA浓度和纯度测定取2ulRNA溶液，用NanoDrop2000超微量分光光度计测定260nm和280nm 波长的OD值，并记录Abs260/Abs280比值及RNA浓度2. RT-PCR检测p53基因的表达〔一〕反转录合成cDNA1.RNA预变性：取一支0.2mlPCR管参加样品RNA2μg，以无水RNase水补足体积至9μl，70℃，10min，立即置于冰上。
p53基因名词解释细胞生物学
P53基因名词解释细胞生物学在细胞生物学中，p53基因是一个备受关注的重要主题。
它作为一种关键的细胞生物学基因，在细胞的生命周期和分化过程中扮演着主要角色。
p53基因的发现和研究对于人类疾病的治疗和预防有着重要的意义。
本文将根据这一主题，深入探讨p53基因在细胞生物学中的作用和意义。
1. p53基因的概念p53基因是一种编码蛋白质的基因，位于人类染色体17号上。
它被称为“细胞生物学的守护神”，具有调控细胞凋亡、DNA修复和细胞周期的重要功能。
p53基因在细胞生物学中扮演着重要的角色，其突变和异常可导致细胞异常增殖和癌症等疾病的发生。
2. p53基因的作用p53基因在细胞的生命周期中发挥着关键作用。
它能够感知DNA损伤和其他生物压力，通过激活相关的信号传导通路来引导细胞做出应对。
p53基因在细胞分化和增殖中起着重要的调控作用，保护细胞不受外界环境的损伤。
3. p53基因与细胞凋亡细胞凋亡是细胞生物学中一个重要的现象，而p53基因在其中扮演着关键的角色。
当细胞受到损伤或其他不利因素时，p53基因能够启动凋亡程序，促使受损细胞自行逝去，以保护整个器官或组织不受进一步的伤害。
4. p53基因在癌症中的作用p53基因在细胞生物学中的另一个重要作用是抑制肿瘤的发生。
正常情况下，p53基因能够监测细胞的DNA损伤并进行修复，或者促使受损细胞凋亡。
然而，在很多癌症中，p53基因被突变或失活，导致肿瘤细胞失去了正常的生长和凋亡调控，从而促进了癌症的发生和发展。
5. 个人观点和总结p53基因作为细胞生物学中一个备受关注的主题，其在细胞凋亡、DNA修复和癌症抑制中的作用备受肯定。
我个人认为，对p53基因的深入研究将有助于我们更好地了解细胞生物学中的重要调控机制，为相关疾病的治疗和预防提供新的思路和方法。
在本文中，我们对p53基因在细胞生物学中的重要性进行了全面的探讨，并介绍了其在细胞凋亡和癌症发生中的作用。
通过对p53基因的研究，我们可以更好地理解细胞的生命周期和调控机制，为相关疾病的预防和治疗提供更深入的认识和新的治疗策略。
P53基因的结构及表达
P53基因的结构及表达P53蛋白主要分布于细胞核浆，能与DNA特异结合，其活性受磷酸化、乙酰化、甲基化、泛素化等翻译后修饰调控。
正常P53的生物功能好似“基因组卫士（guardian of the genome）”，在G1期检查DNA损伤点，监视基因组的完整性。
如有损伤，P53蛋白阻止DNA复制，以提供足够的时间使损伤DNA修复；如果修复失败，P53蛋白则引发细胞凋亡;如果p53基因的两个拷贝都发生了突变，对细胞的增殖失去控制，导致细胞癌变。
P53基因是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因，在短短的十多年里，人们对P53基因的认识经历了癌蛋白抗原，癌基因到抑癌基因的三个认识转变，现已认识到，引起肿瘤形成或细胞转化的P53蛋白是P53基因突变的产物，是一种肿瘤促进因子，它可以消除正常P53的功能，而野生型P53基因是一种抑癌基因，它的失活对肿瘤形成起重要作用。
P53蛋白还分布于线粒体、核仁等结构，并且与细胞骨架有相互作用关系。
P53基因在人类、猴、鸡和鼠等动物中相继发现后，对其进行了基因定位，人类P53基因定位于17P13，鼠P53定位于11号染色体，并在14号染色体上发现无功能的假基因，进化程度迥异的动物中，P53有异常相似的基因结构，约20Kb长，都由11个外显子和10个内含子组成，第1个外显子不编码，外显子2、4、5、7、8、分别编码5 个进化上高度保守的结构域，P53基因5个高度保守区即第13～19、117～142、171～19 2、236～258、270～286编码区.P53基因转录成2.5KbmRNA，编码393个氨基酸蛋白，分子量为43.7KD，P53基因的表达至少受转录及转录后二种水平的调控.在停止生长或非转化细胞中P53mRNA水平很低，但刺激胞液后mRNA显著增加.持续生长的细胞，其mRNA 水平不随细胞周期而出现明显变化，但经诱导分化后mRNA水平降低，部分是转录后调控.P53基因的转录由P1、P2二个启动子控制.P1启动子位于第一外显子上游100～250bp，P2位于第一内含子内，在启动子中包含1个NF1蛋白结合位点和一个转录因子AP1相关蛋白的结合位点，对正常P53基因的转录，不仅需要二个启动子的平衡作用，而且P53 基因内含子也起作用，如内含子中有正调控作用，其调控有组织特异性. P53 基因位于人类17号染色体含11 个外显子，其转录翻译编码的野生型P53 蛋白由393个氨基酸残基组成，包含多个功能域。
实验七利用RT-PCR分析基因表达
目录
• 引言 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果分析 • 实验注意事项与技巧 • 实验总结与展望
01 引言
目的和背景
研究基因表达
通过RT-PCR技术，可以检测特定基因在细胞或组织中的表达情况， 从而研究基因的功能和调控机制。
疾病诊断
RT-PCR技术可用于检测病原体基因的表达，如病毒、细菌等，为 疾病的诊断和治疗提供依据。
选择合适的PCR缓冲液和镁离子浓度，优化PCR反应体 系。
控制PCR循环次数，避免过度扩增导致非特异性产物的 生成。
调整退火温度和延伸时间，根据引物和模板的特性进行 优化。
使用高质量的DNA聚合酶和dNTPs，确保PCR反应的 准确性和效率。
06 实验总结与展望
本次实验成果回顾
实验目的实现
成功利用RT-PCR技术对目标基因在不同样本中的表达水平进行了 分析。
提高反转录效率和特异性方法
选择合适的引物，设计特异性强 的引物序列，避免非特异性扩增 。
使用高质量的RNA模板，避 免使用降解或污染的RNA。
优化反转录反应条件，如反应温 度和时间等，提高cDNA合成效 率。
在反转录反应体系中加入适量的 RNase抑制剂，防止RNase对 cDNA的降解。
优化PCR反应体系和条件建议
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荧光定量PCR原理
荧光基团标记
在PCR扩增过程中，引入荧光基 团标记的特异性探针或引物。随 着PCR反应的进行，荧光信号不
断累积。
实时监测
通过荧光检测系统实时监测PCR反 应过程中的荧光信号变化。荧光信 号与PCR产物的数量成正比，因此 可以通过荧光信号的强度来推算 PCR产物的数量。
p53判读标准
p53判读标准
p53的判读标准主要包括以下几个方面：
1. 正常或野生型p53：细胞核呈弱至中等不均匀着色。
2. p53异常或过表达：细胞核呈强阳性着色，且肿瘤细胞中可能含有阴性、弱阳及强阳性细胞。
3. p53异常胞质表达：细胞质弥漫中等或强阳性着色，且缺乏细胞核着色。
4. p53亚克隆性表达：一种以上染色模式组合存在于至少5%的肿瘤细胞中。
同时，P53蛋白的表达可以通过PCR反应和Taq酶试剂盒进行检测。
染色强度及阳性细胞数量也是判读标准之一，具体分为以下3级：
1. 阳性细胞数5%\~10%为弱阳性。
2. 阳性细胞数11%\~50%为中度阳性。
3. 阳性细胞数>50%为强阳性。
另外，如果p53的表达在不同类型的宫颈癌组织学中存在显著差异，那么需要进一步研究其具体标准。
以上信息仅供参考，如果您还有疑问，建议咨询专业人士。
生化讨论课4.3
琼脂凝胶电泳原理：DNA分子在琼
脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子 筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型 不同，电泳时的泳动率就不同，从而分 出不同的区带。
模板合成cDNA第一条链； 2、Rnase水解活性/RNase H活性：水解
RNA与DNA杂合体中的RNA； 3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条
DNA链为模板合成互补的双链cDNA.
T s i n gCheunat r Ua ln iSv oe ur st hi t yU noifv eCrhsi int ay
02 引物设计的工具
1.Primer premier : Premier是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序引物以及杂交探 针的设计和评估的软件，应该是使用范围最广的一款软件了。主要界面有序列编辑窗口 （Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（Restriction Sites）和 Motif 分析窗口。
主要功能分四种，引物设计、限制性内切酶位点分析、DNA 基元(motif)查找和同源性分析功能。
2. Oligo7 : 该软件主要应用于核酸序列引物分析设计，同时计算核酸序列的杂交温度（Tm）和理论 预测序列。作为目前最好、最专业的引物设计软件，Oligo的功能很强，其主要功能包括：普通引物 对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。它的引物分析功能如此强大 以至于能风靡全世界。
https:///genban k/
自知自 强 行强 不 合不 息 一息 、厚厚经德德世载载致物物用
T s i n gCheunat r Ua ln iSv oe ur st hi t yU noifv eCrhsi int ay
检测p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义
检测p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达及意义乳腺癌是威胁妇女健康的常见恶性肿瘤之一。
其中，乳腺浸润性导管癌是最常见的一种类型，尤其是在发达国家。
指南建议对癌症进行分类，以便为患者制定最佳的治疗方案。
因此，仔细研究乳腺癌的分子特征对于患者治疗非常重要。
p53是一种肿瘤抑制蛋白，在细胞中有多种功能。
它可以通过不同的途径参与细胞周期调控，DNA修复，细胞凋亡和基因转录等生物学过程。
p53的功能受到多种信号通路的调节和调节。
p53功能的缺失或突变在多种肿瘤中都有报道，包括乳腺癌。
在乳腺癌中，p53的突变频率特别高，尤其是在乳腺浸润性导管癌中。
因此，p53的表达已成为乳腺癌的一个重要标志物。
研究表明，p53在患有乳腺浸润性导管癌的患者中表达水平显著升高。
这种高表达可能与p53的突变有关。
p53蛋白的突变可以导致其结构和功能的改变，从而影响其正常的细胞周期调节和DNA修复功能。
这些改变可能导致癌细胞的不受控制繁殖和肿瘤的恶性扩散。
因此，对p53蛋白在乳腺癌中的表达进行监测，可以帮助医生对患者进行更准确的诊断和治疗方案选择。
现代医学技术已经可以检测p53蛋白在乳腺癌中的表达。
通常，医生会在切除乳腺组织后，对癌细胞进行p53蛋白的染色，然后使用显微镜观察染色结果。
如果p53在癌细胞中完全缺失或表达异常高，这可能是乳腺癌的一个标志。
此外，还可以使用其他技术，如免疫印迹和RT-PCR，来检验p53蛋白的表达和突变。
综上所述，p53蛋白在乳腺浸润性导管癌中的表达意义非常重要。
这可以帮助医生为患者制定最佳的治疗方案。
因此，p53的检测需要成为乳腺癌分子诊断的一部分。
未来，我们需要进行更多研究，以加深我们对乳腺癌的分子机制的了解，从而制定更好的治疗方案。
E6AP与P53在宫颈癌组织中的表达及意义
E6AP与P53在宫颈癌组织中的表达及意义作者：修晓新赵彤彤李思思王俊清来源：《中国保健营养·下旬刊》2012年第12期【摘要】目的主要研究E6AP与P53在宫颈癌中的表达及其意义。
方法对45例宫颈癌、10例CIN及10例正常宫颈组织标本采用免疫组化法检测P53蛋白，RT-PCR技术检测E6AP 基因的表达。
结果宫颈癌和CIN组织中P53蛋白表达的阳性率明显高于正常宫颈，差异有统计学意义。
E6AP基因在宫颈癌组织中表达高于CIN及正常宫颈组织，E6AP的表达水平随临床分期的进展而升高。
P53阳性宫颈癌组织中的表达明显高于阴性组织中的E6APmRNA表达，差异有统计学意义。
结论 E6AP的表达与P53的表达关系密切，参与了宫颈上皮组织癌变的发生，并且在宫颈癌的发展中起重要作用。
【关键词】：细胞内的E6相关蛋白；p53蛋白；宫颈癌宫颈癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，是引起女性癌症相关性死亡的重要原因。
本文应用免疫组化方法检测宫颈癌中P53的表达，RT-PCR技术检测E6AP基因的表达，进而分析它们在宫颈癌变及发生、发展中的关系。
1 材料和方法1.1 标本来源和处理选取2010年6月至2012年6月大连医科大学附属第一医院妇产科手术切除和活检的宫颈癌患者标本45例，CIN患者10例、正常宫颈组织10例，患者取标本前均未接受放、化疗及免疫治疗。
其中鳞癌41例，腺癌4例；按组织学分级：高分化19例，中分化19例，低分化7例；临床分期按FIGO2009年标准：Ⅰ期25例，Ⅱ期16例，Ⅲ期4例。
36例行手术治疗，术后证实淋巴结转移8例，未转移28例。
将所取标本组织分为两块，一块10%福尔马林固定，常规石蜡包埋切片；另一块经液氮速冻后，储存于-80℃保存备用。
1.2 免疫组化检测P53蛋白表达按照免疫组化方法SP二步法进行，采用PBS液代替一抗作为阴性对照。
结果判定标准：P53蛋白以胞浆、细胞核和核周缘出现棕黄色颗粒为阳性，根据染色强度及阳性细胞数量将阳性表达分为3级：①阳性细胞数5%-10%为弱阳性（+）；②阳性细胞数11%-50%为中度阳性（++）；③阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。
RT-PCR检测血细胞中p53基因的表达
P53基因
命名 该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质 功能作用 重要的抑癌基因，防止癌变 细胞基因的修复功能
RT-PCR
RT-PCR(反转录PCR技术)
RNA的反转录（reverse transcription ）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技 术。
基因表达的检测方法 反转录的引物 在GenBank中查找p53基因
退火
四项 参数
变性的DNA快速冷却至40－ 60C可使引物和模板DNA发生 结合。可根据引物的长度和G＋ C的含量选择复性温度
延伸
一般是70－75C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。<1kb， 1分钟；>1kb的可适当延长时 间。
循环次数
理论上20－25个循环PCR产物的 累计即可达到最大值、实际操作中 25－30较合理。
查找P53序列
引物设计的原则
引物应用核酸系列保守区内设计 并具有特异性
1
5
碱基要随机分布
产物不能形成二级结构
2 3
4
6 7
8
引物自身及之间不能有连续4个碱 基的互补
引物长度一般在15~30碱基之间
引物5′端可以修饰 引物3’端不可修饰
G+C含量在40%~60%之间
引物3′端要避开密码子的第3位
Ques
1
2
3
4
cDNA
假阳性对照（出现的PCR扩增 条带一致，有时更整齐更明亮）
假阴性对照（什么条带没有）
汇报人：李尽美
日期：2016-11-21
03
05
特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为 引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特 异的PCR扩增。
P53基因在血细胞中的表达
结果分析
用相应的5-8ul DNA Marker,2%琼 脂糖凝胶电泳，电压110-120V， 30-45分钟。 于紫外透视仪下观察有无特异性扩增 带，并照相记录。 β -actin扩增产物大小540bp，340 bp。 GAPDH扩增产物大小142bp。
注意事项
• 双链DNA的变性温度是由双链中C+G的含量决定的，C+G含量越高，模板DNA的溶解温度就越高。在选择的 变性温度下，模板链越长变性所需时间就越长。如果变性温度过低或变性时间过短，会使仅仅富含A+T区域变性。 当模板DNA的G+C含量超过55%的时需要更高的变性温度。 • 复性过程采用的温度至关重要如果复性温度太高，寡核苷酸引物不能与模板很好的复性，扩增效率将会降低。如
序列有8个外显子
选择的是3和7两个外显子，上
面数字指这个外显子，该选择
只是为了使其特异性更高，便 于提高实验准确度。
该基因全部碱基序列
这是p53基因的全部碱基序列，
找到3号和7号所对应的序列， 复制其序列，然后打开genbank 所提供的引物设计工具
引物设计步骤
将3号和7号外显子序列复制到右图
最佳引物
根据上述引物设计原则，选择第一个引物序列， 其Tm值符合条件，GC%在合理范围内
血细胞RNA提取
• 1、冰冷的PBS液 5-10ml洗涤细胞两次，加入Trizol 1ml， 混匀，室温静置15min • ２、小滴管吹打，使细胞完全裂解，然后完全转移至1.5ml EP管内 • 3、加入0.2ml的氯仿，剧烈震荡混匀30s。室温静置10min， 上层水相，下层为酚相 • 4、4度离心，15000rpm，15min • 5、将上层水相移至另一EP管内，400-500ul，切勿吸到蛋白， 加入等量的异丙醇，充分混匀，室温静置10min。然后4度， 15000rpm，离心10min
RT-PCR在基因表达检测中的应用
RT-PCR在基因表达检测中的应用基因表达的检测有几种方法。
经典的方法（仍然重要）是根据在细胞或生物体中所观察到的生物化学或表型的变化来决定某一特定基因是否表达。
随着大分子分离技术的进步使得特异的基因产物或蛋白分子的识别和分离成为可能。
随着重组DNA技术的运用，现在有可能检测．分析任何基因的转录产物。
目前有好几种方法广泛应用于于研究特定RNA 分子。
这些方法包括原位杂交．NORTHERN凝胶分析．打点或印迹打点．S－1核酸酶分析和RNA酶保护研究。
这里描述RT-PCR从RNA水平上检查基因表达的应用。
RT-PCR检测基因表达的问题讨论关于RT-PCR技术方法的描述参见PCR技术应用进展，在此主要讨论它在应用中的问题。
理论上1μL细胞质总RNA对稀有mRNA扩增是足够了（每个细胞有1个或几个拷贝）。
1μL差不多相当于50－100，000个典型哺乳动物细胞的细胞质中所含RNA的数量，靶分子的数量通常大于50，000，因此扩增是很容易的。
该方法所能检测的最低靶分子的数量可能与通常的DNAPCR相同；例如它能检测出单个RNA分子。
当已知量的转录RNA（用T7RNA聚合酶体外合成）经一系列稀释，实验结果表明通过PCR的方法可检测出10个分子或低于10个分子，这是反映其灵敏度的一个实例。
用此技术现已从不到1个philadelphia染色体阳性细胞株K562中检测到了白血病特异的MRNA的转录子。
因此没必要分离polyA+RNA，RNA/PCR法有足够的灵敏度来满足绝大多数实验条件的需要。
将PCR缓冲液同时用于反转录酶反应和PCR反应，可简化实验步骤。
我们发现整个反应过程皆用PCR缓冲液的结果相当于或优于先用反转录缓冲液合成CDNA，然后PCR缓冲液进行PCR扩增循环。
当然，值得注意的是PCR缓冲液并不最适合第一条DNA链的合成。
我们对不同的缓冲液用于大片段DNA合成是否成功还没有进行过严格的研究。
反转录酶的选择似乎对实验方法成功与否并不十分重要。
人野生型p53基因的克隆及原核表达
人野生型p53基因的克隆及原核表达王继;高瑞娟;袁大巍;王丽【期刊名称】《吉林大学学报（理学版）》【年(卷),期】2009(47)5【摘要】利用RT-PCR方法由人外周静脉血淋巴细胞中获得人p53 cDNA片段,并将其克隆入原核表达载体pQE40中,构建重组质粒pQE40-p53;转化于E.coliM15宿主菌,经IPTG诱导,表达了N端融合6His的p53融合蛋白.利用6His与Ni2+高亲合力结合的性质,经镍柱纯化、透析袋分级透析复性、 Western Blot鉴定,结果表明获得了纯化的6His-p53融合蛋白.【总页数】4页(P1077-1080)【作者】王继;高瑞娟;袁大巍;王丽【作者单位】东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024;东北师范大学,遗传与细胞研究所,长春,130024【正文语种】中文【中图分类】Q78【相关文献】1.卵巢癌的p53基因治疗实验研究——人野生型p53基因真核细胞表达质粒的构建 [J], 关婷;崔满华;李守柔PIO增强MRI检测人野生型p53基因转染动脉粥样硬化易损斑块的研究 [J],陈荣红;祁春梅;李东野;蔡文标;武维恒;姚丽娜;张超3.稳定表达野生型p53基因人骨肉瘤细胞株的建立与鉴定 [J], 雷晓晶;韩鹏飞;吕智4.脉冲电场联合野生型p53基因诱导人宫颈癌Hela细胞凋亡 [J], 李好山;熊正爱;周玮;李成祥;姚陈果;孙才新5.尿刊酸修饰的壳聚糖介导野生型p53基因转染对人肺腺癌细胞系H1299增殖和凋亡的影响 [J], 王伟;姚静;周建平;李夷平;陶磊因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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特异性引导
PCR
基因表达水平
Ques
反转录酶
逆转录酶（reverse transcriptase）是存在于RNA病毒体内的依 赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性： (1)依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条 链；
(2)Rnase水解活性：水解RNA:DNA杂合体中的RNA； (3)依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补 的双链cDNA.
引物设计12
所选引物
确定参数
cDNA size:434bp
变性 退火 55度 45秒
1
94度
30秒
2
3
延伸 73度 60秒
4
循环 27次
确定参数
变性
模板DNA由双链变成单链，有 利于与引物结合。可根据模板的 复杂程度调整变性温度和时间， 一般情况下94C 30秒可使各种 复杂的DNA分子完全变性。
查找P53序列
引物设计的原则
引物应用核酸系列保守区内设计 并具有特异性
1
5
碱基要随机分布
产物不能形成二级结构
2 3
4
6 7
8
引物自身及之间不能有连续4个碱 基的互补
引物长度一般在15~30碱基之间
引物5′端可以修饰 引物3’端不可修饰
G+C含量在40%~60%之间
引物3′端要避开密码子的第3位
Ques
反转录可用的引物
01
随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子 全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中 赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中 96%来源于rRNA。 Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。 因 绝 大 多 数 真 核 细 胞 mRNA 具 有 3’ 端 Poly(A )尾，此引物与其配对，仅mRNA可 被转录。
03
05
特异性引物：用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为 引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特 异的PCR扩增。
Ques
查找P53序列
使用GENBANK，P53登陆号AH007667 /genbank
查找P53序列
查找P53序列
引物设计1
启动界面Biblioteka 引物设计2在此输入需扩增的DNA序列
引物设计3
引物设计4
引物设计5
引物设计6
引物设计7
引物设计8
Hairpin：发夹结构 Dimer：二聚体 False Priming：错配 Cross Dimer：交叉二聚体
引物设计9
引物设计10
引物设计11
保存
选择满意的引物
确定参数
退火温度：50℃~54℃
Ques
检测基因的表达
琼脂糖凝胶电泳分离产物：
根据产物长度制作适宜浓度的琼脂糖凝胶，取适量 PCR产物，加上样缓冲液充分混合，点样于事先做好 的琼脂糖凝胶点样孔中，10V/cm电泳45－60min。 成像系统成像分析。
检测基因的表达
Marker（DNA分子量标准）
1
2
3
4
cDNA
假阳性对照（出现的PCR扩增 条带一致，有时更整齐更明亮）
假阴性对照（什么条带没有）
汇报人：李尽美
日期：2016-11-21
退火
四项 参数
变性的DNA快速冷却至40－ 60C可使引物和模板DNA发生 结合。可根据引物的长度和G＋ C的含量选择复性温度
延伸
一般是70－75C，此时Taq DNA聚合酶活性最高。<1kb， 1分钟；>1kb的可适当延长时 间。
循环次数
理论上20－25个循环PCR产物的 累计即可达到最大值、实际操作中 25－30较合理。
P53基因
P53基因
命名 该基因编码一种分子量为53kDa的蛋白质 功能作用 重要的抑癌基因，防止癌变 细胞基因的修复功能
RT-PCR
RT-PCR(反转录PCR技术)
RNA的反转录（reverse transcription ）和 cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技 术。
基因表达的检测方法 反转录的引物 在GenBank中查找p53基因
设计引物确定参数
检测p53基因在血细胞中的表达
Ques
基因检测的方法
在DNA水平
Northern印记杂交 RT-PCR .......
在MRNA水平
在蛋白质水平
Northern印记杂交
Reverse Transcription PCR
反转录
RNA提取
随机六核苷酸引 物引导
cDNA
Oligo(dT)引导
引物设计
PRIMER PREMIER 5.0 Primer Premier5.0是由加拿大的Premier公司开发的专业用于PCR或测序 引物以及杂交探针的设计、评估的软件，其主要界面分为序列编辑窗 口（Genetank），引物设计窗口（Primer Design），酶切分析窗口（ Restriction Sites）和纹基分析窗口（Motif），这里我们主要介绍其引 物设计功能。