非小细胞肺癌治疗靶向基因检测及质控-张杰 03.25

dHPLC Sizing
O
Electrophoresis Sizing
O Confirmation by sequencing
Capillary Electrophoresis
O Confirmation by sequencing
Sequencing Rxn
O
Clean-up
O
PCR
O
~10%
Confirmation by sequencing
L688P V689M P694X
18
Exons 1–16
V700D E709X I715S L718P S720X G735S V738F L730F V742A P733L T751I S752Y E746K D761N A763V N765A S768I T783A L792P L798F G810S N826S L833V L838V T847I I853T A859T E866K H835L H850N V851X G863D A864T
标本的获取

肿瘤标本获取的主要途径
手术(切除/切取)
支气管镜 (活检：中央型) 穿刺 (活检：周围型)

以临床医生认为最容易获取的方式 原发病灶 / 转移灶肿瘤组织 胸水等 制备蜡块 切片 HE染色 确认癌细胞
肺癌的活检标本通常仅含有少量肿瘤细 胞
经支气管肺活检
CT引导穿刺 肿瘤 <正常细胞的5%

NCCN指南建议NSCLC患者检测ALK
30
ALK阳性NSCLC总患者数约为HER2阳性乳腺癌患 者的70%，CML患者的3倍多
EGFR阳性肺癌（新发病数）208923例
ALK阳性肺癌（新发病数）34820例 其他
驱动突变肿瘤的每年发病数
乳腺癌 HER2阳性患 者49,631例
ALK阳性肿瘤患者34,820例
细胞学标本富集
直接测序要求使用肿瘤细胞含量较高(50–70%)的标本
Eberhard DA, et al. J Clin Oncol 2008; 26:983-984.
如何获取优质的标本：标本异质性

分子水平的肺癌细胞存在异质性 肿瘤内异质性 原发部位与转移部位的异质性
肿瘤异质性可能影响研究结果 如果可行，至少取得3个代表性部位的标本进行检测
Eberhard DA, et al. J Clin Oncol 2008; 26:983-984.
分子检测与靶向治疗的关键步骤
1
临床采集合适的 组织标本
2
选择合适的 检测方法
3
根据结果制定 治疗方案
基因突变检测影响因素
---方法学因素
ARMS & PNA-LNA clamp
qPCR: Real-time Detection

如何获取优质的标本：标本类型

尽可能取得大标本进行检测 临床常用的取样方法取得标本量通常较少
内镜活检、穿刺活检、细胞学标本(支气管刷检,
细针穿刺)
小标本检测失败率 53–66% (内镜活检与穿刺活 检) ，而切除活检标本的失败率仅24% 标本中肿瘤细胞的含量也十分重要

组织标本富集
EGFR 突变检测流程
标本采集及病理评估
DNA 抽提及质控
EGFR突变检测
ARMS
测序法
其它方法
检测报告
上海胸科医院2163例肺癌EGFR检测

腺癌 1420 例 鳞癌 236 例 腺鳞癌 43 例 大细胞癌 54 例 低分化癌（NOS） 51 例 其它类型 352 例
阳性率 60.1% (854 /1420) 阳性率 17% (40 / 236) 阳性率 53.5% (23 /43) 阳性率 18.5% (10/ 54) 阳性率 33.3% (17 / 51) 阳性率 46.3%（ 163 / 352 ）
Scorpions ARMS** 直接测序*** 42 25 40 33 0 24
共计
51.2% 100%
82例
30.5% 70.7% 82例
* 肺癌手术石蜡切片标本检测EGFR基因突变 ** IPASS 方法学 *** INTEREST方法学
中华病理学杂志 2008; 37(5):294-9.
ARMS vs. DNA测序
<1%
Steps 1 2 3
Pyro Sequencing
PCR/ SURVEYOR
PCR/ Nested PCR/ ME-PCR/ Sequencing PCR/ HRMA/ Sequencing Sequencing dHPLC
4
5
6
7
ARMS vs. DNA测序
结果 可分析 成功 率
不可分 检出率 析 突变 无突变
FISH
患者2： IHC显示无ALK表达 ，FISH显示无重排
Mino-Kenudson et al., Clin Cancer Res 2010;16:1561–1571.
38
Ventana IHC 试剂设计
ALK融合蛋白:
• 无ALK重排的NSCLC不表达ALK融合蛋 白 • 部分ALK融合蛋白表达较低

Exon 19 deletions and L858R account for approximately 85% of EGFR TK mutations
EGFR transcript Confer sensitivity or resistance to EGFR TKIs
Unclear effect on sensitivity to EGFR TKIs
EGFR 66.35%
T790M/ EGFR Mut = 5
开展项目




EGFR突变检测： EGFR 19-21外显子序列突变检测 EGFR拷贝数量改变检测 K-ras 12-13外显子序列突变检测 ALK-EML4融合基因检测
免疫组化法 FISH方法 RT-PCR方法
B-raf突变检测 ROS1突变检测
如何获取优质的标本：标本类型

石蜡组织：尽可能送检一年内的石蜡标本 石蜡切片：含肿瘤细胞越多越好(50%以上)；组织部位面积约6mm x 6mm以 上 包埋组织：组织块不小于0.5×0.5×0.5(cm) 新鲜组织：比石蜡等处理过的旧组织，DNA保存得更完整，对PCR实验更有 利，但一定要经病理学确认 含有肿瘤组织50%以上；重量≥10ｍg(约米粒大小以上)，经PBS或生理盐 水冲洗干净 取癌组织的中心位置组织块(避开坏死区域)，固定于10%中性福尔马林溶 液中，尽快送病理科
上海交通大学附属胸科医院
张杰
Mutations of Some Driver Genes in Neversmoking Women With Adenocarcinoma
PI3K 1.92%
P53 1.92%
KRAS 1.92%
Unknow 17.31%
BRAF 1.92%
EML4-ALK 8.65%

标本来源
手术切除标本 气管镜活检标本 经皮穿刺标本 淋巴结穿刺标本 胸水/心包 细胞学标本 血清DNA标本及循环细胞

标本相关问题
标本异质性 标本类型 标本的收集和储存
取样中存在的问题

肿瘤的位置
肿瘤生长的部位有时难以进行内科穿刺
活检，需要依靠外科手术活检取材 细针穿刺时使用的器材尺寸可能影响细胞 的获取量及DNA的质量 由于无法保证每次都能取得足够的标本， 需要一些适用于小标本的检测方法
EGFR基因突变检测方法的选择
优化检测途径，最大限度提高检测敏感性、降低假阳性 和假阴性率以获得可靠的检测结果对每个患者来说都至关重要
DNA 测序在部分地区仍然是EGFR 检测的金标准 其他方法，比如ARMS可能比直接测序更敏感，目前 已被广泛应用 新的EGFR基因检测方法层出不穷，其检验效能有待 进一步考证
野生型
ALK重排
36
ALK FISH 检测
正常
分裂
丢失
IHC用于检测ALK表达

采用高灵敏度的检测系统后，有越来越多的数据支持使用IHC作为初步 筛查
灵敏度和特异度都可达到很高水准。 与FISH相比，IHC是一种更常规的技术，成本更低，且工作强度也更低
ALK IHC
患者1： IHC显示ALK强表达 ，FISH显示重排
检测方法
67.7%
328/2163
15百度文库2%
84.8% 48.6%
1835/2163
EGFR突变率
60.2%
53.5%
33.3%
17%
18.5%
腺癌
鳞癌
大细胞癌
低分化癌
腺鳞癌
KRAS基因检测
腺癌
10/122
腺癌且EGFR阴性
10/48
8.2% 20.8%
肺癌个体化检测质量控制

检测标本 检测方法及试剂 实验室要求及检测人员资质要求 检测报告内容及格式
G719A/S
Deletions
Exon 17
D761Y D770_N771 insNPG
19 18 20
Exons 18–24
T790M
L858R
Exons 25–28
L861X
21
Riely, et al. Clin Cancer Res 2006; Murray, et al. J Thorac Oncol 2008
CML 10,000例左右
中国肿瘤登记年报，2012
临床&病理特征：ALK融合 vs EGFR突变
特征 EGFR EML4/ALK
组织学 亚型
吸烟状态 人种 发病年龄 性别
腺癌 TTF1+ 非粘液型
不吸烟 东亚 66y 女性
腺癌TTF1+ 粘液型
不吸烟 所有人种 52y 男 >女
与EGFR突变人群相比，ALK融合 人群年龄更轻
D5F3 rabbitt monoclonal antibody Optiview Amplification Kit Optiview DAB IHC Detection
Ventana IHC的原理:
• 使用具有高度敏感性和特异性的一 抗——D5F3 • 全自动仪操作，充分保证特异性 • 独有Optiview扩增技术，充分保证敏 感性
Clean-up
O
Sequencing Rxn
O
Clean-up
O
3-10%
10%
3-12%
Capillary Sequencing
Clean-up
O
Sequencing Rxn
O
20~30%
Capillary Sequencing
Clean-up
O
O
= 产物转移/加入试剂/开管操作
20~30%
Capillary Sequencing
Signal pattern of Vysis ALK Break Apart FISH Kit
FISH诊断
橘红色与绿色探针相互 临近或粘合：ALK 阴性
橘红色与绿色探针相互分离或 单个橘红色探针：ALK阳性
荧光原位杂交技术（FISH）
1. FISH技术是美国药物临床试验中所采用的检测方法。
2. 采用“分离”分析，基因倒位和ALK重排后，红色和绿色探针分开 3. ≥ 15%的样本细胞中呈现分开的红色和绿色信号表示阳性结果1



临床标本与研究标本的差异
标本类型
肿瘤细胞 含量
标本处理
固定方式、试 剂、标本离体 时间各异 统一的保存以 及运送条件
其他分析前 、分析后 处理
不定
新鲜组织、 实际临床 蜡块、穿刺 随意性大，无 组织、脱落 严格要求 标本 细胞等
研究标本
统一要求
要求统一，被 病理所确认
尽量统一
标本是获得高质量检测结果的重要前提
测序法
敏感度 石蜡组织标本成功 率 商用试剂盒 流程与速度 数据分析要求 试剂成本 仪器成本 25% 低 无 复杂/慢 高 相对低 高
ARMS
1% 高 有 简单/快 低 相对高 低
1. Dacic S. Adv Anat Pathol 2008; 15(4):241-247. 2. 中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变检测专家组. 中华病理学杂志 2011; 40(10):700-702.
标本处理 ： • 离体后处理：及时切开、固定(尽快) • 固定液：10%中性福尔马林(pH≈7.0) (不推荐使用任何 其它溶液) • 固定液量： ≥10倍体积 • 固定时间：6~48小时 适宜的切片： • HE片确认*，癌细胞数≥200个 (不推荐依经验 盲取) • 常规切片(4~5μm厚，普通载玻片) • 连续切片8~10张 • 刀片：一次性(不推荐交叉使用)
TaqMan
qPCR: Real-time Detection
PCR/ RFLP
PCR
PCR
O
PCR
O
PCR
O
PCR
O
PCR
O
PCR
O
1%
~10%
Clean-up
O
SURVEYOR cleavage
O
RFLP
O
Heteroduplex
O
Clean-up
O
PCR
O
RFLP
O
Pyrosequencing Rxn