蛋白质等电点的测定
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蛋白质等电点的测定
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主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
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2
蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中 存在下列平衡：
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3
蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液 的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值 时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等， 在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不 向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质 都有变化，可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点。
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16
5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
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三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
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9
二、等电聚焦电泳
原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而 又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连 续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能 造成介质pH由酸到碱逐步变化。
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10
2)各种蛋白质pI不同
3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI 形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH 梯度
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4
最常用的方法是：
①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH ③浊度、分光光度法 ④基于蛋白质与离子交换的作用
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一、测定溶解度最低时的溶液PH
实验原理：
借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定 酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠 混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白 的等电点。
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20
0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
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14
（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
8.7
8.0
7.4
0.01M醋酸 （ml） 0.6
—
—
—
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0.1M醋酸 （ml）
—
0.3
1.0
—
1M醋酸 （ml）
—
—
— 1.6
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(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫 升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的 pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊 度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊 的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
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图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
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13
四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
6.75
10%过硫酸铵
0.05
10%TEMED
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝
胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋
白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值
等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的
区带。
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三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
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6
实验器材与试剂：
器材： • 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容
量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
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7
实验步骤：
(1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精 确地加入各试剂，然后混匀。
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3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。
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主要内容
(1)了解蛋白质的两性解离性质。 (2)学习测定蛋白质等电点的方法。
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蛋白质的解离性质
• 蛋白质是两性电解质。在蛋白质溶液中 存在下列平衡：
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3
蛋白质的等电点
• 蛋白质分子的解离状态和解离程度受溶液 的酸碱度影响。当溶液的pH达到一定数值 时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等， 在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不 向阳极移动，此时溶液的pH值称为此种蛋 白质的等电点。不同蛋白质各有其特异的 等电点。在等电点时，蛋白质的理化性质 都有变化，可利用此种性质的变化测定各 种蛋白质的等电点。
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5 .蛋白质条带聚焦位置的计算
求出蛋白质聚焦部位距凝胶条正极端的实际长度为：
蛋白区带中心距凝胶条正极端的距离 固定染色前凝胶条长度 固定染色后凝胶条长度
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三、浊度、分光光度法
溶液的pH值与蛋白质等电点相同时，静电荷为0，当溶液pH值大于蛋 白质等电点时，则羧基游离，蛋白质带负电荷。反之，溶液的pH值小 于蛋白质等电点时，则氨基电离，蛋白质带正电荷。溶液的pH值距蛋 白质等电点越远，蛋白质的电荷越多。反之则越ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ。
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二、等电聚焦电泳
原理：1）有一类两性电解质：它具有依次递变而 又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连 续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能 造成介质pH由酸到碱逐步变化。
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2)各种蛋白质pI不同
3）两性电解质载体在电场作用下，按各自pI 形成从阳极到阴极逐渐增加的连续而稳定的pH 梯度
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最常用的方法是：
①测其溶解度最低时的溶液pH值。 ②等电聚焦电泳测其净电荷为零时的PH ③浊度、分光光度法 ④基于蛋白质与离子交换的作用
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一、测定溶解度最低时的溶液PH
实验原理：
借观察在不同pH溶液中的溶解度以测定 酪蛋白的等电点。用醋酸与酷酸钠(醋酸钠 混合在酪蛋白溶液中)配制成各种不同pH值 的缓冲液。向诸缓冲溶液中加入酪蛋白后， 沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白 的等电点。
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0.1
蛋白质混合样品
0.1
混匀后置真空干燥器中抽气
10 min
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（3）将配好的凝胶溶液用细长头滴管加到预先准备好的玻管 中，至离上端1 cm处，再用注射器缓缓加水3-5 mm高。
（4）待凝胶聚合
2. 电泳
将装有胶的玻管固定到电泳槽上槽的洞中（安装时要保 证凝胶管垂直且橡胶塞孔密封不漏）在上槽中装入0.1mol/L 氢氧化钠溶液，在下槽中加入0.1mol/L磷酸缓冲液。连接到 电泳仪，接通电源，调电压至160 V，聚焦过夜，至电流降 为0，则可关闭电源。
试管号
1 2 3 4
蒸馏水 （ml）
8.4
8.7
8.0
7.4
0.01M醋酸 （ml） 0.6
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0.1M醋酸 （ml）
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0.3
1.0
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1M醋酸 （ml）
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(2) 向以上试管中各加酪蛋白的醋酸钠溶液1毫 升，加一管，摇句一管。此时1、2、3、4管的 pH值依次为5.9、5.3、4.7、3.5。观察其混浊 度。静置10分钟后，再观察其混浊度。最混浊 的一管的pH即为酪蛋白的等电点。
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图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图 (A为正面,B为剖面)
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四、操作方法 1. 凝胶柱的制备
（1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶
表 10mL 7.5%凝胶的配制
试剂名称
体积(mL)
凝胶贮液
2.5
两性电解质载体
0.5
蒸馏水
6.75
10%过硫酸铵
0.05
10%TEMED
以聚丙烯酰胺凝胶为电泳支持介质，并在凝
胶中加入两性电解质载体，在电场作用下，蛋
白质在此pH梯度的凝胶中泳动，当迁移至pH值
等于pI处时，就不再泳动，而被浓缩成狭窄的
区带。
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三、实验试剂与仪器 1）两性电解质 2）30％丙烯酰胺溶液 3）TEMED 4）10％过硫酸铵溶液 5）负极缓冲液：0.1M NaOH 6) 正极缓冲液：0.1M 磷酸或硫酸 7) 固定液：10％（W/V）三氯乙酸 8) 染色液 9) 脱色液 10) 蛋白质等电点标准 11) 电泳仪 12) 圆盘电泳槽
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实验器材与试剂：
器材： • 水浴锅、温度计、200毫升锥形瓶、100毫升容
量瓶、吸管、试管、试管架、乳钵 试剂： (1)0.4％酪蛋白醋酸钠溶液 (2)1.00摩尔／升醋酸溶液 (3)0.10摩尔／升醋酸溶液 (4)0.01摩尔／升醋酸溶液
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7
实验步骤：
(1) 取同样规格的试营4支，按下表颠序分别精 确地加入各试剂，然后混匀。
可编辑ppt
15
3．剥胶
电泳结束后，取下凝胶管，用蒸馏水洗净两端电极液，在 凝胶条的正极端作上标记。用灌满水的注射器长针头插入凝胶 与玻管管壁之间，边压水边慢慢转动玻管，推针前进，同时注 入水，靠水流压力和润滑力将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶条 即可流出。
4 .固定染色
取出凝胶条放在一块洁净的玻板上，用尺量出固定前的凝 胶条长度。放入带盖试管中加入固定液。固定20min2后，倒 掉固定液后用脱色液漂洗2次，再染色1h，用蒸馏水漂洗数次 后用脱色液脱色，直至蛋白质区带清晰，量出蛋白带距正极端 的距离。