液体配制及实验方法

（一）液体配制

1.完全培养基

DMEM+10%FBS+1%双抗+（1%HAPS液）

若放置时间长于2周加1%谷氨酰胺

2.PBS

1000ml去离子水中溶解8.0gNaCl、0.2gKCl、2.89gNa2HPO4、0.26gNaH2PO4

3.胰酶

用之前调节PH值至7.6

4.CaCl2

将0.165gCaCl2粉末溶于10ml去离子水中配制成50X的溶液

每5ml胶原酶中加入100μl CaCl2溶液（终浓度3μmol/L）用于激活胶原酶的活性

5.双抗

终浓度：青霉素100万U/100ml 链霉素100万U/100ml

青霉素0.6μg为1个单位链霉素 1.2195μg为一个单位

称取青、链霉素粉末各0.6、1.2195g溶于10mlPBS中再定容至100ml

6.两性霉素B

100mg两性霉素B粉末溶于40mlPBS中，制成浓度为2.5mg/ml(1000X)的浓缩液

每100ml完全培养基中加入100μl 浓缩液，稀释为终浓度2.5μg/ml

7.细胞冻存液

20%DMSO+80%FBS(1mlDMSO+4mlFBS)

8STZ溶液

STZ溶于柠檬酸和柠檬酸三钠的盐溶液中

称取柠檬酸0.105g溶于5mlPBS 称取柠檬酸三钠0.145g溶于5mlPBS中混合两者制成10毫升的溶解液. 再将100mgSTZ粉末溶于该溶解液中制成浓度1%的STZ溶液，调节PH值至4.5，4°避光保存，由于STZ水溶性不稳定，溶液最好在半小时内使用完毕.

9油红O

原液：油红O 0.6g溶于异丙醇（99% ）100ml 。

稀释液：油红O 原液20ml ，蒸馏水20ml ，过滤后使用。

10茜素红

称取0.1g茜素红粉溶于100mlPBS，调节PH值到7.2，过滤后使用.

11成骨诱导液

配方：DMEM(H)+10%FBS+10mmol/Lβ-甘油磷酸钠+0.1μmol/L地塞米松+50mg/LVitC

1）β-甘油磷酸钠分子量：216 溶于水

10mmol/L=216mg/100ml

称取216mgβ-甘油磷酸钠粉末溶于100ml低糖完全培养基中

2）地塞米松分子量：392.5 在无水乙醇中的溶解度为1mg/ml.

0.1μmol/L=0.04mg/L

将100mg地塞米松溶于100ml无水乙醇中制成25000X的浓缩液

每100ml低糖完全培养基中加入4μl地塞米松浓缩液

3）VitC分子量176.1 溶于水

称取5mgVitC粉末溶于100ml低糖完全培养基中

12成脂诱导液

配方：DMEM(L)+10%FBS+10μmol/L地塞米松+200μmol/L吲哚美辛+0.5mmol/L3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）+10mg/L胰岛素

1）每100ml高糖完全培养基中400μl地塞米松浓缩液

2）吲哚美辛分子量：357.79 在无水乙醇中的溶解度为1g/50ml PH 7.4以下

0.2mmol/L=7.16mg/100ml

称取720mg吲哚美辛粉末溶于50ml无水乙醇制成200X的浓缩液

每100ml高糖完全培养基中加入500μl吲哚美辛浓缩液

3）IBMX分子量：222.25 在DMSO中的溶解度为1M(222.25mg/ml)

0.5mmol/L=1.1mg/100ml

将100mgIBMX粉末溶于1mlDMSO 制成100mg/ml(9100X)浓缩液

每100ml高糖完全培养基中加入11μlIBMX浓缩液

4）Insulin浓缩液浓度为10mg/ml(1000X)

每100ml高糖完全培养基中加入Insulin浓缩液100μl.

溶解粉末时均需先用少量液体溶解，再定容。

（二）细胞培养

1.骨髓基质干细胞（BMSC）、脂肪基质干细胞（ADSC）的原代培养

1）准备工作

所需液体：培养基，血清（FBS），胶原酶

消毒（器械、烧杯、滤纸、离心管等）（PBS,枪头，青瓶和塞子，5套器械+3~4个烧杯+滤纸，离心管50+15ml）

水浴锅调节温度至37°预热

配制BMSC清洗液将PBS倒入50ml的烧杯中加2%双抗和200ul两性霉素

配制ADSC清洗液由于脂肪组织易污染，故将清洗液装入青瓶中，每100mlPBS加2%双抗和20~40ul两性霉素

配制骨髓冲洗液（PBS+3%FBS）即300ul血清

BMSC冲洗液及胶原酶可放入37度水浴锅或温箱中预热

2）取组织

将SD大鼠（4周60-80g）引颈处死，用75%酒精浸泡5-10分钟

取大鼠内脏脂肪，取脂肪时剪开皮肤及剪取脂肪分别用两套器械减少污染，将取好的腹部脂肪放入事先配制好的青瓶清洗液中

取大鼠长骨，尽量将附着的肌肉剔除干净，若骨头断裂髓腔暴露，污染可能性大，弃之。

将取出的脂肪及骨头分别在清洗液中清洗3-5次

3）收集细胞

ADSC: 将清洗后的脂肪组织在广口小青瓶中剪碎，加入适量II型胶原酶（每1ml脂肪组织加1ml胶原酶）以及CaCl2（200X），将混合物移至15ml离心管中37°C

水浴30分钟（每间隔十分钟震荡15秒）,30分钟后将混悬液用细胞筛网滤过，

并用终止夜（10%FBS的PBS）2ml终止消化，收集液体至离心管，1500rpm离

心5-6分钟，弃上清重悬细胞，细胞计数并种入培养瓶中，加适量培养基，在培

养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.

BMSC：用器械剪去长骨两端，暴露骨髓腔，5ml注射器冲洗骨髓腔，收集液体至离心管，1000rpm离心8分钟，弃上清重悬细胞，细胞计数并种入培养瓶中，加适

量培养基，在培养瓶上标记动物种属、细胞类别、原代、日期.

2.换液

每2-3天一次，具体时间和频率根据细胞状态及培养基的颜色而定.

准备物品：PBS、试管吸管

步骤：吸出培养基，PBS清洗2遍，再加入培养基. 原代细胞首次换液时无需PBS清洗.

3.传代

原代细胞7天后传代，之后每2-7天传代，依据细胞密度及状态而定

传代时根据细胞密度选择所传的瓶数，一般1瓶90%融合的细胞可传2-4瓶.

准备物品：15ml离心管、试管吸管、培养瓶、PBS、培养基、胰酶（ph调至7.4-7.6）

步骤：1）吸出培养基，用PBS清洗2遍（应彻底清除培养基，否则血清会影响胰酶的消化作用）