显微操作技术(全面)

2.胚胎预处理
为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般 用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化 并变薄或去除透明带。
3.胚胎分割
在进行胚胎切割时，先将发育良好的胚 胎移入含有操作液滴的培养皿中，操作液常用 杜氏磷酸缓冲液，然后在显微镜下用切割针或 切割刀把胚胎一分为二。
不同阶段的胚胎，切割方法略有差异： （１）桑椹胚之前的胚胎这一阶段胚胎因为卵裂球 较大，直接切割对卵裂球的损伤较大。常用的方 法是用微针切开透明带，用微管吸取单个或部分 卵裂球，放入另一空透明带中，空透明带通常来 自未受精卵或退化的胚胎。 （２）桑椹胚和囊胚的分割对于这一阶段的胚胎， 通常采用直接切割法。操作时，用微针或微刀由 胚胎正上方缓慢下降，轻压透明带以固定胚胎， 然后继续下切，直至胚胎一分为二，再把裸露半 胚移入预先准备好的空透明带中，或直接移植给 受体。
显 微 操 作 仪
显微操作技术包括
• 细胞拆合：把完整细胞的细胞核与细胞质用特殊的方 法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用 紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的 细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的 生物个体。 • 细胞重组：细胞融合技术与细胞核质分离技术结合， 在融合介质作用下，使胞质体与完整细胞合并，重新 构成胞质杂种细胞的过程。 • 胚胎工程：显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显 微切割等．
非洲爪蟾制作
哺乳动物核移植
• ，哺乳类的移核实验必须在显微操作仪下才能进行。
• 最早用来做移核试验的哺乳动物是小鼠。 1977年，美国缅因州巴尔港的杰克逊实验室用“ 亚无性繁殖”的方式，培育出7只单亲小鼠。 1981年1月，美国《科学》杂志封面刊登3只小 鼠的照片，他们将囊胚内细胞团细胞的核移入去核的 受精卵中，经培养移核卵发育至囊胚期，再将胚胎植 入同步孕鼠的子宫内，最后产下两雌一雄仔鼠，并发 育成了可育的个体。
细胞核移植技术已有几十年的历史,Gordon等人(1962)对 非洲爪蟾进行核移植获得成功。我国著名学者童第周等在鱼类
细胞核移植方面进行了许多工作．并取得了丰硕成果．近年来 国内外又相继获得哺乳动物卵核移殖的后代。显微注射技术的 应用也很广泛．1980年,Gordon等人首次将重组的病毒DNA用显 微注射法注入小鼠受精卵的原核中，在78只出生鼠中通过 Southern杂交．发现3只携带有注射的DNA．这是通过原核显微 注射法首次获得的转基因小鼠．显微切割技术则用于胚胎和染 色体的显微切割等。显微操作技术已成为细胞遗传学、生化细 胞学、胚胎发育以及基因工程等研究中的重要技术方法．
（六）胚胎的保存和培养
保存是使胚胎在体外一定条件下（降温）停 止发育，延长其在体外的生存时间，当需要时， 升温后进行移植。 培养则是在体温条件下，于培养液中，使之 继续发育。
（七）胚胎的移植
胚胎的移植也有手术法和非手术法两种 方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于 小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等 大动物 。
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优势(意义)
• 充分发挥雌性个体的繁 殖潜力 • 缩短供体本身的繁殖周 期 • 保持供体优良特性 • 大规模繁殖 • 节约成本\费用 • 可用于保护珍稀动物 • ……
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在20世纪60年代以来，对家畜胚胎的采取、 保存、移植等技术环节进行了大量的试验研究工 作，取得不少进展。 20世纪70年代以后，胚胎的移植技术可以说 发展到在畜牧生产中实际应用的阶段。
2.2微细胞核移植
• 微细胞：只有一条或几条染色体和一薄 层细胞质，外面包裹一层完整的细胞质 膜的核质体。利用秋水仙素先将细胞阻 断在染色体中期，然后培养，再用细胞 松弛素B处理得到。 以微细胞作供体， 通过与遗传性完整的受体细胞融合，可 以将微细胞内所含有的几条染色体转移 到受体细胞中去。
微 细 胞 杂 种 细 胞 的 制 作 过 程
近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改 良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转 基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基 因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。
(二)胚胎移植的基本原则
1.胚胎移植前后所处环境的同一性 （１）供体和受体在分类学上的相同属性
（２）动物生理上的一致性
（３）动物解剖部位的一致性 2.胚胎发育的期限 3.胚胎的质量
三、微型吸管 微型吸管主要用于移植细胞核，要求管口表面平滑无损， 口径要略大于细胞核而又小于单个细胞。制作过程为将直径2mm, 壁厚0.05mm,长10cm的毛细玻璃管固定在拉针器上，调好拉力强 度和电热丝温度，拉成微管。如热度过高，拉成的吸管没有开 口。这时则应在显微工具制作器上再加工成口径合适的微型吸 管，若无拉针器和显微工具制作器．也可用手工操作，在酒精 灯上将毛细管加热拉成吸管。
胚胎移植的实质
胚胎移植实质上是早期胚胎在
相同生理环境条件下空间位置
的转换，而胚胎本身的遗传物
质并不发生改变，因此各种性
状均能保持其原来的优良特性。
为什么胚胎移植能成功?
• 移动到任何一头动物子宫内都能发育吗?
• 同种动物发情排卵后,在一段时间内供体\受体具 有相同的生理环境
• 为什么能收集到胚胎?
利用细胞融合技术得到的重组细胞
1、2、3亲本细胞 • 4、6核体 • 5、7胞质体 • 8、9杂种细胞 • 10重组细胞 • 11胞质杂种细胞 • ⅠPEG介导 • ⅡHAT培养基筛选
鉴别与意义
• 利用双重标记法鉴别杂种细胞的真伪，可以采 用两个具有不同缺陷型的细胞作标志，或用 3H－胸腺嘧啶核苷作核标记，并使其吞入不 同颗粒的乳胶作为胞质标志，或者用3H－亮 氨酸等标记氨基酸作为胞质标记，也可用红绿 荧光的聚乙烯颗粒标记重组细胞。 • 意义：胞质杂种细胞是不同种系之间的一种真 正的新型细胞，在适宜的条件下能成功的生存 下去，它在物种的品种改良、医学及农业的各 个方面将产生重大的影响。
二、注射针
将外径lmm,内径0.8mm的毛细玻管固定在拉针器上。调好拉力强度
和电热丝温度，即可拉针。再将拉好的针在磨针器上磨出一45°斜口。
也可用单面刀片在橡皮垫上切成带斜面的针尖，然后在显微工具制作
器(microforge)上加工针尖部，使其锐利、光滑，便于刺入细胞。用 于细胞注射的针口直径为10～13微米。 DNA注射者的口径不足l微米, 显微镜下观察不到是否开口，只有试注射才可确定是否适用。一般DNA 注射针拉制后直接使用，不需再处理，因为在磨针器上加工会造成较 大的口径而不易控制注射量。且每次注射后，因压力降低、产生回流， 使DNA浓度降低。
显微工具的制作
一、持卵针 持卵针管是在显微注射时用来固定胚胎或卵的工具．由 毛细玻璃管拉制而成。将长7cm、直径1.0-1.25mm的毛细玻 璃管洗净、烤干后．在拉针器上拉成细针状。在外径100120微米的部位．用玻璃刀断成平口．用加热的白金丝靠近 平口的端部钝化并缩小至所需口径一般用于小鼠卵的管口直 径为20～30微米,兔卵者为50～70微米,在使用前把针管在酒 精灯火焰上加工成下图所示的形状。
Байду номын сангаас 流程图
• 对供体\受体的选择和处理 • 配种或人工授精 • 对胚胎的收集\检查\培养\保存 • 移植胚胎 • 移植后检查
(三)胚胎移植应具备的基本条件 1.胚胎来源
2.技术条件
3.受体母畜
（五）胚胎的检查
收集到的冲洗液，需静置10min。待胚胎 下沉后，移去上层液，再放于解剖镜下，检查 胚胎数量和发育情况。 正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）一 般外形整齐清晰，大小较一致， 分布均匀而紧密，发育速 度与胚胎日龄相一致。
核移植小鼠
第三节 胚胎显微操作技术
3.1胚胎移殖
胚胎移植（embryo transfer）：将动物 的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌 性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。 提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个 体称为受体。
提供胚胎的个体为 “供体”，接受胚 胎的个体为“受 体”，不管供体还 是受体动物都应为 雌性个体。
（八）供体和受体的术后观察
对术后的供体和受体不但要求注意它们的 健康情况，同时要留心观察它们在预定的时间 是否发情。 供体在下次发情时即可照常配种，或经过 二、三个月再重复作为供体，收集胚胎。受体 母畜术后如发情则说明未受胎，移植失败。
第四节 克隆技术
克隆（clongning）是指一个细胞或个体 以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群 细胞或一群个体。 在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵 子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体 的一门胚胎生物技术。 哺乳动物的克隆技术包括胚胎分割和细胞 移植两种。
• 早期胚胎一定时间内处于游离状态
• 供体和受体会不会发生排斥/
• 同种动物之间基本上不排斥
生 理 学 基 础
• 为什么移植的胚胎能保留供体双亲的特性?
• 胚胎虽然与受体有生理和组织上的联系,但遗传特 性不受受体的影响
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胚胎移植的技术程序
胚胎移植时，希望一次 从供体母畜得到多数胚胎， 所以要进行超数排卵处理， 同时，胚胎移植成功的根本 条件是供体和受体必须同时 发情，故需人为控制供受体 的发情时间，进行同期化处 理。
显微操作技术
显微操作技术(micromanipulation technique)是指在高倍复式显微镜下．利用显 微操作器(micrcmanipulator)进行细胞或早期
胚胎操作的一种方法．
显微操作器用以控制显微注射针或吸管（固定针管）在 显微镜视野内移动的、精确的机械装置。一般装在显微 镜载物台的两侧．也可装在显微镜的前面或一侧。
四、移卵针 取外径I. 5mm,长lOOmm的毛细玻管，在酒精灯上加热后用手拉 出一段内径为180微米的细管，用砂轮断成平口，再在酒精灯上进行 钝化以免移卵时损伤子宫壁。
五、玻璃微针 将直径3～5mm的玻棒在酒精灯上加热拉制成直径0.lmm的玻璃丝， 然后再拉成玻璃微针。玻璃棒都分作为柄用，也可装到解剖针柄上 使用。