第5章 食品卫生微生物学检验方法

第七节 鲜乳中抗生素残留检验
检验方法：
第一法：嗜热链球菌抑制法 第二法：嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法
原理、检验程序、操作步骤见讲义。 特别注意： 1、两种方法检测的抗生素都有最低检出限，当结果 可疑时，建议重新检测一次。 2、报告方式：抗生素残留阳性或阴性。
二、检验方法
第一法：平板菌落计数法 第二法：菌落总数PetrifilmTM测试片法(2010版已删)
检验程序、操作步骤见讲义。 特别注意： 1、菌落总数的计算方法。 2、计算菌落总数的公式：N=∑C/（n1+0.1n2）d
n1和n2代表的是平板数，而不是菌落数！ 3、菌落总数的报告中有关数字的修约原则。 4、菌落总数的报告方式：是以每克（或每毫升）样 品中细菌的菌落形成单位（CFU）数来表示的。
(2010版已删)
检验程序、操作步骤见讲义。
特别注意：
1、大肠菌群的报告方式：大肠菌群MPN计数是以每克（或每毫 升）样品中大肠菌群的MPN 值（最可能数）来表示的。大肠菌 群平板计数和大肠菌群测试片法是以每克（或每毫升）样品中大 肠菌群菌落形成单位（CFU）数来表示的。 2、查看大肠菌群MPN检索表时，表内数字要根据检样量不同作 相应调整。 3、大肠菌群平板菌落计数的结果应注意要通过证实试验后的阳 性比例进行校正。 4、大肠菌群平板计数和大肠菌群测试片法中的菌落数的选择： 大肠菌群平板计数选择菌落数在30~150之间的平板；大肠菌群 测试片法选择菌落数在15~150之间的测试片。
2、O抗原的鉴定
用A～F多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做 对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。
被A～F多价O血清凝集者，依次用O4；O3、10；O7； O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结 果，判定O群。被O3、10血清凝集的菌株，再用O10、 O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、 E3、E4各亚群。
绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色 色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘 露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热性的DNA酶。
二、检验程序 检验程序、操作步骤见讲义。
特别注意：
1、结果报告：在25g（或25mL）样品中检出或未检出金黄 色葡萄球菌。
2、致病性金黄色葡萄球菌可产生血浆凝固酶。这种酶在适宜 的温度下可使血浆凝固成块状，而非致病性葡萄球菌不能 产生血浆凝固酶。
菌落总数的测定(平板活菌计数法)是根据微生物在 固体培养基上所形成的菌落(即由一个单细胞繁殖而成、 且肉眼可见的子细胞群体)的生理及培养特征进行的。 也就是说，一个菌落即代表一个单细胞。
由于所计算出的菌数是培养基上长出来的菌落 数，故不包括死菌，因此菌落总数的测定是活菌计 数。
细菌菌落总数实际上仅为检样中总细菌数的一 部分，其余细菌皆因种种原因未能长出。
第五节 金黄色葡萄球菌检验
一、概述
金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂 窝组织炎，还可引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等 系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，金黄色葡 萄球菌在食品中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒， 这在我国细菌性食物中毒事件中仅次于沙门氏菌和副溶血 弧菌。因此，检验食品中金黄色葡萄球菌有实际意义。
（3）如培养基接种后产生黑色沉淀，是因为某些细菌（如大 多数沙门氏菌菌株）能分解蛋白胨中的含硫氨基酸，生 成硫化氢，硫化氢和培养基中的铁盐反应，生成黑色的 硫化亚铁沉淀。
大肠杆菌、沙门氏菌 和志贺氏菌在TSI上
的反应结果
大肠杆菌：分解葡萄糖产酸产气，大多数能分解乳糖， 不产生H2S。 （斜面黄色色，底部黄色，产气， 无黑色沉淀。图4）
第五章 食品卫生微生物学检验
第一节 第二节 第三节 第四节 第五节 第六节 第七节
菌落总数测定 大肠菌群计数 沙门氏菌检验 食品中霉菌和酵母菌数的测定 金黄色葡萄球菌的检验 食品中乳酸菌检验 鲜乳中抗生素残留检验
第一节 菌落总数测定
一、概述
菌落总数是指食品检样经过处理，并在一定条 大肠菌群计数
一、概述 大肠菌群是指一群在36℃下培养48h内能发酵乳
糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢 杆菌。
大肠菌群是肠道中存在最普遍且数量最多的一群 细菌，常将其作为人畜粪便污染的指标，推断食品中 肠道致病菌污染的可能。
二、检验方法
第一法：大肠菌群MPN计数 第二法：大肠菌群平板计数 第三法：大肠菌群PetrifilmTM测试片法
（1）只能利用葡萄糖的细菌（如沙门氏菌），分解葡萄糖产 酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸因接触空 气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性 产物，故使斜面后来又变红；底部由于是在厌氧状态下， 酸类不被氧化，所以仍保持黄色。
（2）能发酵乳糖的细菌（如E.coli），可产生大量的酸，使
整个培养基（斜面和底部）均呈现黄色。
3、一般食品中污染的金黄色葡萄球菌数在106~109/g（mL） 时才引起食物中毒，因为毒素的产生与菌量的多少有关。 （“金黄色葡萄球菌计数”另有检验标准。）
4、对于从食物中毒标本中分离出的金黄色葡萄球菌，还应 检查其是否产生肠毒素，才能确定其是否为食物中毒的病 原。
第六节 食品中乳酸菌检验
一、概述 乳酸菌：是一类可发酵糖主要产生大量乳酸
不被A～F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏 菌因子血清中的9种多价O血清检查，如有其中一种血清 凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确 定O群。
3、H抗原的鉴定
不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8 种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集， 则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐 一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。
O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的(如2.5%一 3%)培养基上再检查。
如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取 菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸 后再检查。
H抗原发育不良时，将菌株接种在0.7%～0.8%半固体琼 脂平板的中央，候菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检 查；或将菌株通过装有0.3%～0.4%半固体琼脂的小玻管 1～2次，自远端取菌培养后再检查。
霉菌和酵母菌在PDA培养基上生长良好，但用PDA做平板 计数时，必须加入抗菌素以抑制细菌。
孟加拉红(虎红)培养基中的孟加拉红和氯霉素具有抑制细菌 的作用；孟加拉红还可抑制霉菌菌落的蔓延和生长；在菌落背 面，由孟加拉红产生的红色有助于霉菌和酵母菌菌落的计数。
粮食和食品中常见的曲霉和青霉在高盐察氏培养基上的分离 效果良好，它具有抑制细菌和减缓毛霉科菌种的生长速度的作 用。
沙门氏菌：分解葡萄糖，不发酵乳糖，大多数产生H2S， 多数产气。（斜面红色，底部黄色，产气，产 生黑色沉淀。图3）
志贺氏菌：分解葡萄糖产酸不产气，大多不发酵乳糖， 不产生H2S。 （斜面红色，底部黄色，不产气， 无黑色沉淀。图2）
沙门氏菌的血清学分型鉴定
1、抗原的准备
一般采用1.5%琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗 原。
4、Vi抗原的鉴定
用Vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤 寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。
第四节 食品中霉菌和酵母菌数的测定
一、概述 由于遭受霉菌和酵母菌的侵染，粮食和食品常常发生霉
变，有些霉菌的有毒代谢产物会引起某种急性或慢性中毒， 特别是有些霉菌的毒素具有强烈的致癌性，大量食入或长期 少量食入霉菌毒素，皆能诱发癌症。目前已知的产毒霉菌， 如青霉、曲霉和镰刀霉在自然界广泛分布，对食品侵染的机 会也很多。因此，对食品加强霉菌的检测，在食品卫生学上 有重要意义。
的细菌统称。 食品微生物检验中的乳酸菌主要为乳杆菌属、
双歧杆菌属和链球菌属中的嗜热链球菌等。
二、检验方法
检验程序、操作步骤见讲义。
特别注意： 1、菌落数的选择：与“菌落总数检验”中的菌落数 选择相同，选择乳酸菌菌落数在30～300之间的平 板进行计数。 2、乳酸菌数的报告方式：与菌落总数的报告方式相 同，是以每克（或每毫升）样品中所含乳酸菌数 （CFU/g或CFU/mL）表示。
沙门氏菌的检验方法包括5个步骤：前增菌、选择性增菌、 平板分离、生化试验、血清学鉴定。
二、检验方法：
检验程序： 见右图
结果报告： 在25g（或25mL）
样品中检出或未检出 沙门氏菌。
三糖铁琼脂（TSI）试验原理
1、TSI适合于肠杆菌科细菌的鉴定。用于观察细菌对糖的利 用和硫化氢（变黑）的产生。
2、TSI含有乳糖、蔗糖和葡萄糖（比例为10:10:1）。
霉菌和酵母菌的测定：是指食品检样经过处理，在一定 条件下培养后，所得的1g成1mL检样中含有的霉菌和酵母菌 数(对于粮食样品，是指1g粮食表面的霉菌总数)。
霉菌和酵母菌主要作为判定食品被霉菌和酵母菌污染程 度的标志，以便对被检样品进行卫生学评价时提供依据。
二、检验程序
操作步骤见讲义。
特别注意：
1、菌落数的选择： 选择菌落数在10～150之间的平皿计数。 2、报告方式：以每克(或毫升)食品所含霉菌和酵母数以个 /g(个/mL)表示。 3、培养基的选择：要根据具体情况而定。
第三节 沙门氏菌检验
一、概述
沙门氏菌属是肠道杆菌科中最重要的病原菌属，它是引起 人类和动物发病及食物中毒的主要病原菌。在世界各地的食物 中毒中，沙门氏菌食物中毒一般占首位或第二位。
食品中即使有沙门氏菌，含量也较少，食品加工会使其受到 损伤而处于濒死状态。因此，为了分离食品中的沙门氏菌，必 须对加工食品进行前增菌处理，用无选择性的培养基使处于濒 死状态的沙门氏菌恢复活力，再进行选择性增菌，使沙门氏菌 得以增殖，而使大多数的其他细菌受到抑制。