实验 盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定

实验盐酸小蘖碱的提取分离与鉴定
一、实验目的与要求
1．学习生物碱的初步提取分离方法。

2．掌握利用柱层析分离纯化、薄层层析鉴定药用植物成分的方法。

二、基本原理
生物碱是植物中含氮的碱性有机化合物,大都有明显的生理活性,是许多中草药中的有效成分。

它们是人类对植物研究得最早最多的一类有效成分,现已分离出有六千余种。

这些生物碱在植物体内一般均与有机酸或无机酸结合成盐而存在,只有弱碱性生物碱往往呈游离状态,还有一些是与糖结合成苷而存在。

小檗碱又名黄连素,是最先由毛莨科黄连（Coptis chinensis Fran）和芸香科黄柏(Phellodendron amurense Rup.)等植物中提出的一种黄色生物碱。

黄连属植物的根茎、须根、叶中等都含有小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马亭等生物碱[1],我国黄连药材产量占世界第一位。

现已发现，唐松草属（Thalictrum）、小檗科的小檗属(Berberis L.)、十大功劳属(Mahomia Nuff)及防己科的天仙藤属（Fibraurea）等都可作为提取小檗碱的资源植物。

本实验即是用小檗属植物三颗针(Berberis julianae schneid.)或黄连属黄连作为提取小檗碱的原料;
R
N+
R1
R2
R4
R3
化合物R R1R2R3R4
小檗碱－O－CH2－O－OCH3OCH3H
甲基黄连碱－O－CH2－O－－O－CH2－O－CH3
黄连碱－O－CH2－O－－O－CH2－O－H
掌叶防己碱OCH3OCH3OCH3OCH3H
药根碱OH OCH3OCH3OCH3H
古伦胺碱OCH3OH OCH3OCH3H
黄连类生物碱结构
三颗针及黄连中均含有小檗碱(分别为1%,5.1%)以及巴马亭(掌叶防已碱,Palamtine)、药根碱(Jatrorrhicine)等,它们均有明显的抗炎作用。

小檗碱是一种季铵碱,其游离碱为黄色针晶,Mp.145℃(乙醚),微溶于水,能溶于热水和乙醇中，难溶于苯、丙酮、氯仿，几乎不溶于石油醚。

小檗碱与氯仿、丙酮、苯在碱性条件下均能形成加成物。

小檗碱盐酸盐难溶于冷水，易溶于热水；硫酸盐易溶于水。

溶解度分别为:小檗碱,1∶２０（冷水）,1∶100(冷乙醇);盐酸盐,1∶500(冷水);硫酸盐,1∶30(冷水),利用这些特性提取盐酸小檗碱。

三、仪器与试剂
1.仪器：层析柱、研钵、烧杯、硅胶薄层板、滤纸、抽滤装置、紫外灯、层析缸等
2.试剂与样品：三颗针根粉(或黄连根粉),0.5%硫酸，石英砂，脱脂棉，石灰乳，10%盐酸，浓盐酸，氧化铝，95%乙醇，无水乙醇，10％氢氧化钠溶液,滤纸，硅胶，氯仿-氨-甲醇(30∶1∶8),氯仿-乙醇- 盐酸 (1∶1∶1，下层)
四、实验内容与步骤
1 小檗碱粗品的制备
方法一取三颗针的根粗粉(过20目筛)20g,以0.5%硫酸适量润湿,拌以50g石英砂,混匀,装入底部塞有脱脂棉的层析柱中,关闭活塞。

加入适量0.5%硫酸,使之浸没药面,浸泡一昼夜。

逐渐加入0.5%硫酸即开始渗漉,约收集200 mL溶液。

再用150 mL左右0.5%硫酸浸泡
一天并渗滤。

收集液用石灰乳中和多余硫酸,调pH＝7,滤除沉淀,向滤液中加5%量食盐至饱和,并以10%盐酸调至pH2-3,静置(过夜),滤出沉淀。

并用少量水洗涤。

向沉淀中加适量热水溶解,用石灰乳调节pH8.5-9.8,趁热滤除杂质,滤液在搅拌下加浓盐酸至pH2,冷却静置,滤取析出的沉淀,水洗涤至中性,抽干。

50℃以下干燥,即为盐酸小檗碱粗品(成品)。

方法二[2]取三颗针的根粗粉(过20目筛)20g,置于500 mL烧杯中，加入8倍量0.5%硫酸水溶液使之浸没药面,浸泡24h，用脱脂棉过滤。

滤液加石灰乳中和多余硫酸,调pH＝12,静置30 min，滤除沉淀,滤液用10%盐酸调至pH2-3,再向滤液中加10%（W/V）量食盐[3],搅拌使完全溶解后，继续搅拌至溶液出现为混浊现象为止，静置(过夜),滤出沉淀。

并用少量水洗涤至中性,抽干。

50℃以下真空干燥,即为盐酸小檗碱粗品。

1盐酸小檗碱精制
方法二所得小檗碱还需精制。

取所得粗品(未干燥)放入20倍量沸水中，搅拌溶解后，继续加热数分钟，趁热过滤[4]。

滤液滴加一滴浓盐酸，静置(过夜),滤取结晶，用蒸馏水洗数次,抽干，50℃以下真空干燥，即为精制盐酸小檗碱
2氧化铝柱层析分离纯化盐酸小檗碱[5]
a 氧化铝层析柱制备:
取一支2.0cm×30cm层析柱,柱底覆盖少许脱脂棉,柱内加入一定体积95%乙醇,打开活塞,让溶液慢慢流出。

此时将已搅拌混均的氧化铝95%乙醇悬液(层析氧化铝120-140目,25-30g)不断加入层析柱内,至加完后,轻敲柱体,使各部分氧化铝均匀紧密一致。

待氧化铝沉降稳定(表面应平整),表面保持有少量溶剂(0.5cm左右)，关闭活塞。

b 进样:
取约50 mg左右的盐酸小檗碱粗品，用尽量少的无水乙醇溶解制成溶液。

用吸管吸取样液沿柱壁四周小心加入,打开层析柱活塞使有溶剂滴下,待液面近与氧化铝表面相平,迅速用少量无水乙醇将柱壁样液洗下,待液面下降后再洗,反复多次,直至表面溶剂无色,让样品完全持留于氧化铝中,并保留有1cm左右溶剂,此时加入少许石英砂覆盖氧化铝表面,并沿管壁加入足量洗脱剂。

在此过程中要准确迅速,洗涤溶剂尽量少并尽可能不要扰动,氧化铝表面平整。

c 洗脱:
使溶剂继续滴下,(注意向柱内添加无水乙醇,保持柱体湿润),洗脱样品。

按每流分5-10 mL收集洗脱液,并着重收集各个色段(从下至上):鲜黄色、桔红色(棕色段可不再洗脱),收集到的洗脱液经浓缩后进行检测鉴定。

d 氧化铝再生回收:
层析后弃去氧化铝柱上端带深色部分,取出剩余氧化铝,依次用10％氢氧化钠溶液和水洗涤,晾干后经400℃烘4-6小时活化再生即可备用。

3盐酸小檗碱的鉴定
a 纸层析鉴定[6]:
样品:柱层析分离出的鲜黄色段及桔红色段醇液
标准品:盐酸小檗碱醇液
展开剂:氯仿-乙醇-，下层)
显色方法:自然光或紫外灯下观察,计算各样点R f值并对各点归属作出判断。

b 硅胶薄层层析鉴定:
样品、标准品、显色方法均同上
展开剂:氯仿-氨-甲醇(30∶1∶8)
c 红外鉴定:
利用溴化钾压片法,常规测定其红外光谱数据,并与标准品对照.
注释
1．各地产黄连根茎小檗碱及总生物碱含量分别为4.2-6.7%，6.6-9.6%；栽培种比野生种含量少20％左右。

黄连除根茎作药材外，各部位均含小檗碱，黄连须根0.8-5.5％，叶为1.49％，老叶为2.5-2.8％，花为
0.56％，种子为0.23％.
2．浸泡药材粗粉的硫酸水溶液，浓度不宜过高，一般为0．2-0．3％为宜。

若硫酸水溶液浓度过高，小檗碱可成为硫酸氢小檗碱，其溶解度（1：100）明显较硫酸小檗碱（1：30）为小，降低提取效率。

硫酸水溶液浸出效果与浸泡时间有关，浸泡12小时约可浸出小檗碱80％，浸泡24小时，可浸出92％。

常规浸出应浸泡多次，使小檗碱提取完全，本实验中浸出液只收集第1次的浸泡液。

3．盐析时，加入氯化钠的量，以提取液量的10％计算，即可达到析出盐酸小檗碱的目的。

氯化钠的用量不宜过多，否则溶液的相对密度增大，造成盐酸小檗碱微细结晶呈悬浮态难以下沉。

4．在精制盐酸小檗碱过程中，因盐酸小檗碱放冷极易析出结晶，所以加热煮沸后，应迅速抽滤或保温过滤，防止溶液在过滤过程中冷却，析出盐酸小檗碱结晶，过滤困难，降低收率。

5．进行柱层析分离时,洗脱过程中需及时补加洗脱剂保持柱体润湿均匀;若柱体干裂,则分离无法进行。

6．纸层析检测时需预先要将层析纸在展开剂气氛中饱和15-30分钟,否则分离效果不佳。

7．红外光谱数据:IR.νKBrmax cm-11505（芳环）,1471(Ar-O-C),1360(CH３),1030(C-O-C)。

思考题
1．在提取过程中为什么用稀硫酸冷浸而不用稀盐酸冷浸？加入食盐的目的是什么?
2．小檗碱有哪三种可以互变的结构式?哪一种最稳定?
3．如果利用黄连叶片作原料,那么如何提取小檗碱?。