薄层色谱
色谱学 第三章 薄层色谱
在吸附色谱过程中，溶质、溶剂和吸附剂三 者是相互联系而又相互竞争的，如此构成了 整个层析分离过程 。 在薄层吸附色谱过程中，主要为物理吸附， 无选择性。因之吸附剂与多元组分溶液接触 时，一方面任何溶质都可被吸附（当然单位 重量吸附剂所能吸附物质的量，即“吸附量” 会因物质种类而异），另一方面，吸附剂也 可吸附流动相分子。由于物理吸附是可逆的， 故被吸附的分子同时也可被解吸出来。
偶氮染料 偶氮苯 对甲氧基偶氮苯 苏丹黄 苏丹红 对氨基偶氮苯 对羟基偶氮苯
Ⅱ 0.61 0.28 0.18 0.11 0.04 0.01
表3-2 硅胶活度分级法 Rf Ⅲ Ⅳ 0.70 0.83 0.43 0.67 0.30 0.53 0.13 0.40 0.07 0.20 0.01 0.07
除上二种外，还有其他一些吸附剂。吸附剂品种如下： （1）硅胶：薄层色谱用为200~250目粒度，规格很多，一般如有石膏作粘 结剂，称硅胶G；石膏含量为5~20%，一般为10~13%，亦有用淀粉作粘 结剂的，称硅胶S，不加粘结剂者称硅胶H或硅胶N，为了便于观察组分的 斑点，也可在硅胶中加入荧光指示剂。如果又加有粘结剂时，则称为硅胶 GF或硅胶GF254，即吸收254nm紫外光。 （2）氧化铝：根据加有粘结剂情况不同，有H、G、HF、GF等品种。 （3）硅镁吸附剂：即费罗里硅土，使用前要在130℃下活化二小时。 （4）纤维素：长度仅为2~20微米的短纤维，分天然纤维和微晶纤维两种 形式，也可加粘合剂、一般用于亲水性物质的分离，如羟基化物等，但缺 点为不能用浓硫酸等腐蚀性溶剂进行显色。 （5）聚酰胺：这是一种使用广泛的有机吸附剂，多用于分离酚类化合物， 样品容量大，但粘结能力差，可加入纤维素或淀粉作粘结剂。 （6）烧结薄层板：这是一种多次使用的薄层板，是由200~300目石英或玻 璃粉，与200~300目硅胶或氧化铝按1：25重量混合，用乙醇调成浆料，涂 在玻璃板上。0.25~0.3毫米厚，然后在700~780℃高温下烧结，即成烧结板。 烧结板用一次后可用乙醇或其它有机溶剂洗涤，最后用水洗干净后烘干再 继续使用。
薄层色谱法
课程：分析制样技术
薄层色谱法
一、薄层色谱法概念及原理
• 薄层色谱法（常用TLC表示）又称薄层层析，属于固－
液吸附色谱。 • 样品在薄层板上的吸附剂（固定相）和溶剂（移动相）之
间进行分离。由于吸附剂对不同组分的吸附能力的不同， 使它们在薄层上的移动速度也有差别，从而得以分离，显 然试样中吸附能力最弱的组分在薄层中移动距离最大，而 试样中吸附能力最强的组分在薄层中移动距离最小。
四、注意事项
1）展开时，层析缸中的有机溶剂蒸气必须达到饱和，否则，Rf值将不能重现。
2）在薄层用的吸附剂中，硅胶适用于酸性和中性组分的分离，碱性组分与硅胶有相互 作用，不易展开，或发生拖尾现象，不好分离；氧化铝适用于碱性好中性组分的分离 ，但不适用于酸性组分的分离。
3）如果单一展开剂效果不好，可以用混合溶剂，通过改变溶剂组分和比例来调整展开 剂的极性，从而达到分离效果的目的。
二、吸附剂与展开剂的选择
（2）展开剂：
选择展开剂时，主要考虑极性，其洗脱能力与极性成正比 。分离极性大的化合物赢选用极性展开剂，而分离极性小 或非极性的化合物应选用极性小的展开剂。 单一溶剂极性大小顺序如下： 酸>吡啶>甲醇>乙醇>正丙醇>丙酮>乙酸乙酯>乙醚>氯 仿>二氯甲烷>甲苯>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>石 油醚
① 蒸气显色法：利用样品组分与单质碘、液溴、浓氨水等物质的蒸气作用
而显色。将上述易挥发物质放于密闭容器中，再将展开剂已完全挥发的薄层板 放入则显色。
② 显色剂显色法：将一定浓度的显色剂溶液均匀喷洒在薄层上，是样品组
分显色。
③ 紫外显色法：某些化合物在紫外光照射下回发出荧光，可将展开剂挥发
实验四（）薄层色谱
实验四（）薄层⾊谱实验四（1）薄层⾊谱⼀、实验⽬的1、学习学习薄层⾊谱法的原理，了解其意义和应⽤。
2、掌握薄层板的制作及薄层⾊谱的操作⽅法。
⼆、实验原理薄层⾊谱法是以薄层板作为载体，让样品溶液在薄层板上展开⽽达到分离的⽬的，故也称为薄层层析。
它是快速分离和定性分析少量物质的⼀种⼴泛使⽤的实验技术，可⽤于精制样品、化合物鉴定、跟踪反应进程和柱⾊谱的先导（即为柱⾊谱摸索最佳条件）等⽅⾯。
1、薄层⾊谱常⽤的吸附剂硅胶和氧化铝是薄层层析常⽤的固相吸附剂。
化合物极性越⼤，它在硅胶和氧化铝上的吸附⼒越强，所以吸附剂均制成活性精细粉末。
活化通常是加热粉末以脱去⽔分。
硅胶是酸性的，⽤来分离酸性或中性的化合物。
氧化铝有酸性、中性和碱性的，可⽤于分离极性或⾮极性的化合物。
商⽤的硅胶和氧化铝薄层板可以买到，这些薄板常⽤玻璃或塑料制成。
溶剂在薄层板上爬升的距离越长，化合物的分离效果越好。
宽的薄层板也可⽤于量较⼤的样品，具有1~2mm厚的⼤板可⽤于50~1000 mg样品的分离制备。
2、样品的制备与点样样品必须溶解在挥发性的有机溶剂中，浓度最好是1~2%。
溶剂应具有⾼的挥发性以便于⽴即蒸发。
丙酮、⼆氯甲烷和氯仿等是常⽤的有机溶剂。
分析固体样品时，可将20~40mg样品溶到2mL 的溶剂中。
在距薄层板底端约1cm处，⽤铅笔划⼀条线，作为起点线。
⽤⽑细管（内径⼩于1mm）吸取样品溶液，垂直地轻轻接触到薄层板的起点线上。
样品量不能太多，否则易造成斑点过⼤，互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离效果。
3、展开将选择好的展开剂放在层析缸中，使层析缸内空⽓饱和，再将点好样品的薄层板放⼊层析缸中进⾏展开。
使⽤⾜够的展开剂以使薄层板底部浸⼊溶剂3~5mm，但溶剂不能太多，否则样点在液⾯以下，溶解到溶剂中，不能进⾏层析。
当展开剂上升到薄层板的前沿（离顶端5~10mm处）或各组分已明显分开时，取出薄层板放平晾⼲，⽤铅笔划出前沿的位置后即可显⾊。
薄层色谱
表 1 一些常用的显色剂
显色剂
配制方法
检出对象
浓硫酸
10%H2SO4
大多数有机化合物在加热后可显 出黑色斑点
碘蒸气
将薄层板放入缸内被碘蒸气饱和数 很多有机化合物显黄棕色
分钟
碘的氯仿溶液
0.5%碘的氯仿溶液
同上
5%磷钼酸乙醇溶液，喷后 120℃烘
硝酸铈铵
6%硝酸铈铵的 2mol／L 硝酸溶液 显色剂，多元醇在黄色底色上有
棕黄色斑点
香兰素-硫酸
3g 香兰素溶于 100mL 乙醇中，再加 高级醇及酮呈绿色
入 0.5mL 浓硫酸
茚三酮
0.3g 茚三酮溶于 100mL 乙醇，喷 氨基酸、胺、氨基糖
后,110℃热至斑点出现
东北师范大学化学学院综合化学实验学习资料
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了荧光）。也可将展开完毕的薄 层板烘干后用显色剂喷雾显色。常用的显色剂有碘和三氯化铁水溶液等。许多有机化合物能 与碘生成棕色或黄色的络合物，利用这一性质，在一密闭容器中（一般用展开缸即可）放几 粒碘，将展开并干燥的薄层板放入其中，稍稍加热，让碘升华，当样品与碘蒸气反应后，薄 层板上的样品点处即可显示出黄色或棕色斑点。除饱和烃和卤代烃外，均可采用此方法。
有关，其活性随含水量的增加而下降。活化温度：硅胶板于烘箱中逐渐升温至 105～110℃ 烘 30min；氧化铝板于 150～160℃烘 4h。活化后的薄层板放在干燥器内保存备用。
（3）点样 在距薄层板底端 8~10mm 处，划一条线，作为起点线。用毛细管（内径小于 1mm）吸 取样品溶液（一般以氯仿、丙酮、甲醇、乙醇、苯、乙醚或四氯化碳等作溶剂，配成 1%溶 液），垂直轻轻地接触到薄层的起点线上。如溶液太稀，一次点样不够，第一次点样干后， 再点第二次、第三次，多次点样时，每次点样都应点在同一圆心上。点样次数依样品溶液浓 度而定，一般为 2~5 次。若样品量太少时，有的成分不易显出；若量太多时易造成斑点过大， 互相交叉或拖尾，不能得到很好的分离。点样后的斑点直径以扩散成 1~2mm 圆点为度。若 为多处点样时，则样点间距为 1~1.5cm。 （4）展开 薄层的展开需在密闭的容器中进行。先将选择的展开剂放在层析缸中，使层析缸内的空 气饱和 5~10min，再将点好试样的薄层板放入层析缸中进行展开。样点的位置必须在展开剂 液面之上。当展开剂上升到薄层的前沿（离顶端 5~10mm）或各组分已明显分开时，取出薄 层板，立即用铅笔或小针划出溶剂前沿的位置，晾干或烘干后即可显色。根据标样对照或 Rf 值的不同对各组分进行鉴定。 展开剂的选择主要是根据样品的极性、溶解度和吸附剂的活性等因素来综合考虑。溶剂 的极性越大，则对化合物的洗脱力越大，即 Rf 值也越大。如发现样品各组分的 R f 值 较大， 可考虑换用一种极性较小的溶剂，或在原来的溶剂中加入适量极性较小的溶剂展开，如原用 氯仿为展开剂，则可加入适量的苯。相反，如原用展开剂使样品各组分的 R f 值较小，则可 加入适量极性较大的溶剂，如氯仿中加入适量的乙醇试行展开，以达到分离的目的。 （5）显色 展开完毕，取出薄层板, 划出前沿线，如果化合物本身有颜色, 就可直接观察它的斑点。 如果本身无色，可用显色剂法或紫外光照射法显色。用硅胶 GF254 制成的薄板层，由于加入
薄层色谱
和颜色的深浅，并与标准品在相同条件下展开所得 到的一系列已知不同浓度的标准斑点相比较，而近 似地判断样品中所测成分的含量。 2 测面积法
展开后色谱上的斑点面积与化合物含量间，符 合一定的线性关系。 3 仪器测定法
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3 仪器测定法
用光密度计或称薄层扫描仪（TLC Scanner）扫描定量， 该方法已成为薄层定量的主要方法。 1.吸收测定法
相对比移值，即相对于某一物质x的Rf值，用Rx 表示。 其定义为：Rx＝组分的Rf值／物质x的Rf值 组分A相对于物质B的“相对比移值” RB =a/b
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三.薄层色谱的操作
吸附剂的选择 薄层板的制作 展开剂的选择 点样 展开 定位与显色 薄层层析的定量测定
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(一) 薄层层析用的吸附剂
常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、纤 维素、聚酰胺等。
吸附剂的选择：首先决定于样品成分的性质， 即它们的溶解性、酸碱性、极性以及是否与 吸附剂起化学反应等；
其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及其 价格等。
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(二) 薄层板的制作
层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（纸浆、纤维素、硅胶、 中性氧化物、聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化键合硅胶等）均匀 地涂在在薄层板（玻璃板、金属板或弹性塑料板）上，干燥 （110℃活化）后即可使用。
2.点样量
点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的 灵敏度有关。一般来说，样品量最小为几ng，常用 量为几至几十µg，制备型的分离可以点样到mg量。 总之点样量随分离目的而定。
3.点样方式 最好是直径3—5mm的圆点。
常用的点样方式
a 一般点样 b 径向点样 c 条状点样 d 线形小孔点样
薄层色谱和柱层析
薄层色谱和柱层析一、薄层色谱（TLC）1.原理：薄层色谱是一种基于分子在固体表面和流动相之间相互作用的分离技术。
它使用薄层固定在玻璃或铝板上的吸附剂（例如硅胶或氧化铝）来分离混合物中的化合物。
在色谱板上涂覆样品后，通过液态或气态的流动相让混合物成分在吸附剂上移动，不同化合物的移动速度不同，从而实现分离。
2.应用：薄层色谱被广泛应用于药物化学、食品科学、环境科学和生命科学等领域。
它通常用于混合物的分析，确定混合物中是否存在特定化合物。
此外，它也可用于纯化样品中的化合物，通过可视化或其他检测方法来定位目标化合物位置。
3.操作步骤：薄层色谱的操作步骤主要包括：（1）准备色谱板：将吸附剂均匀涂覆在固定的玻璃或铝板上，使其成为薄层。
（2）样品的涂覆：将待分离的混合物溶解在适当的溶剂中，并用微量移液管将样品均匀地涂覆在色谱板上。
（3）开展分离：将涂覆了样品的色谱板悬挂在色谱槽中，加入合适的溶剂溶液，使之满足色谱板的一端。
（4）显色：在色谱板完全干燥后，通过目视或化学法将化合物可视化。
常用的显色剂包括碘、紫外线灯或化学染色剂。
二、柱层析（CC）1.原理：柱层析是一种基于分子在固定填料（固相）和流动相之间相互作用的分离技术。
根据样品的特性选择不同的固相材料，并将其装填在柱中。
当样品通过柱时，不同化合物与固相发生不同程度的相互作用，从而分离。
2.应用：柱层析广泛应用于化学和生物化学领域，用于分离和纯化化合物。
它可用于药物合成中的纯度检查、食品中毒素的分离、蛋白质的纯化等。
柱层析的分离效果通常较好，纯度高。
3.操作步骤：柱层析的操作步骤主要包括：（1）准备填料和柱子：根据需要选择适当的固相材料，并将其装填在柱子中。
（2）样品的预处理：将待分离的样品预处理，如溶解在适当的溶剂中，并清除杂质。
（3）样品注入：将样品注入柱中，注意控制样品体积和注入速度。
（4）洗脱：通过加入不同组成的洗脱液（流动相），使样品中不同化合物以不同速率从柱中洗脱。
薄层色谱分析
吸附可逆
吸附过程是可逆的，被吸附物在一定条件下可 以解吸出来。在单位时间内被吸附于吸附剂的 某一表面积上的分子和同一单位时间内离开此 表面的分子之间可以建立动态平衡，称为吸附 平衡。
吸附层析过程就是不断地产生平衡与不平衡、 吸附与解吸的动态平衡过程。
以上信息部分源 于网上资料，部 分为自己见解， 希望大家看后给 予指正与补充。
一般实验中应用较多的是以吸附剂为固定相的薄 层吸附层析。
吸附
吸附是表面的一个重要性质。任何两个相都可 以形成表面，吸附就是其中一个相的物质或溶 解于其中的溶质在此表面上的密集现象 。
如：以前实验中我们利用活性炭吸附一些物质
吸附的产生
物质分子之所以能在固体表面停留，这是因为 固体表面的分子（离子或原子）和固体内部分 子所受的吸引力不相等。在固体内部，分子之 间相互作用的力是对称的，其力场互相抵消。 而处于固体表面的分子所受的力是不对称的， 向内的一面受到固体内部分子的作用力大，而 表面层所受的作用力小，因而气体或溶质分子 在运动中遇到固体表面时受到这种剩余力的影 响，就会被吸引而停留下来。
薄层色谱，或称薄层层析(thin— layer chromatography）简介
是以涂布于支持板上的支持物作为固 定相，以合适的溶剂为流动相，对混 合样品进行分离、鉴定和定量的一种 层析分离技术。
薄层色谱法（TLC）
系将适宜的固定相涂布于玻璃板、塑料或铝基片 上，成一均匀薄层。待点样在薄层一端展开后， 根据比移值（Rf）与适宜的对照物按同法所得的 色谱图的比移值（Rf）作对比，用以进行药品的 鉴别、杂质检查或含量测定的方法。
注：Rf=溶质移动的距离/溶液移动的距离。 表示物质移动的相对距离。
薄层色谱法优点
薄层色谱法
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薄层色谱法
（thin layer chromatography; TLC) （一）概述 1.背景
1938年俄国人首先实现了在氧化铝薄层上分离一 种天然药物。1965年德国化学家出版了“薄层色 谱法”一书，推动了这一技术的发展。 因TLC法设备简单，分析速度快，分离效率高， 结果直观，很快被用作定性和半定量的方法。 70年代中后期发展了高效薄层色谱。80年代以后 发展了薄层色谱光密度扫描仪，和各步操作的仪 器化，并实现了计算机化。
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展开时的注意事项
产生原因：展开槽未被展开剂饱和。尤其是 使用混合溶剂时，极性较弱和沸点较低的溶 剂，在薄层边缘容易挥发，使边缘部分的展 开剂中极性溶剂的比例增大，Rf相对增大。 同一物质在同一薄层板上出现中间部分的Rf 值比边缘的Rf值小，即边缘效应。
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展开时的注意事项
消除办法：若在展开前先将展开槽与薄层
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六味地黄丸中牡丹皮的薄层图谱
1.丹皮酚； 2～5.六味地黄丸
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薄层色谱法（TLC)应用实例
二、醋酸可的松中其他甾体的检查
取本品，加氯仿-甲醇(9︰1) 制成每1ml 中含10mg的溶 液，作为供试品溶液；精密量取适量醋酸可的松，加氯仿甲醇(9︰1) 稀释成每1ml 中含0.10mg的溶液，作为对照溶液。 照薄层色谱法（附录Ⅴ B）试验，吸取上述两种溶液各5μl， 分别点于同一硅胶Ｇ薄层板上，以二氯甲烷-乙醚-甲醇-水 (385︰60︰15︰2) 为展开剂，展开后，晾干，在105 ℃干燥 10分钟，放冷，喷以碱性四氮唑蓝试液，立即检视。供试品 溶液如显杂质斑点，不得多于3 个，其颜色与对照溶液的主 斑点比较，不得更深。
⑵点样
将试样用最少量展开剂溶解，用毛细 管蘸取试样溶液，在薄层板上点样。在样 点上轻轻画出一条平行于玻璃板底边的细 线。薄层色谱板载样量有限，勿使点样量 过多。
薄层色谱(TLC)
薄层色谱薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。
是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法。
它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。
因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。
此外，在进行化学反应时，薄层色谱法还可用来跟踪有机反应及进行柱色谱之前的一种“预试”，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
一、基本原理色谱法的基本原理是利用混合物中各组分在某一物质中的吸附或溶解性能的不同，或和其它亲和作用性能的差异，使混合物的溶液流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组份分开。
薄层色谱是一种微量、快速和简便的色谱方法。
由于各种化合物的极性不同，吸附能力不相同，在展开剂上移动，进行不同程度的解析，根据原点至主斑点中心及展开剂前沿的距离，计算比移值（Rf）。
化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。
在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物，薄层色谱可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达500mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。
特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。
二、实验基本流程铺板点样展开显色计算Rf值铺板取7.5x2.5cm左右的载玻片5片，洗净晾干。
在50mL烧杯中，放置3g硅胶G，逐渐加入0.5﹪羧甲基纤维素钠水溶液(CMC)8mL，调成均匀的糊状，涂于上述洁净的载玻片上，用手将带浆的玻片在水平的桌面上做上下轻微的颠动，制成薄厚均匀、表面光洁平整的薄层板，涂好的硅胶G的薄层板置于水平的玻璃板上，在室温放置0.5h后，放入烘箱中，缓慢升温至110℃，恒温0.5h 后取出，稍冷后置于干燥器中备用。
薄层色谱法
4.点样过程 确定点样位置
吸取点样溶液
点样。
a.用铅笔在距薄层底边1.5-2.0cm处画一条起始线，在起始线上作 好记号作为点样位置，每个位置之间的距离为1.0-1.5cm； b.用点样设备吸取一定量的溶液； c.于点样位置上的吸附剂轻轻接触，点样设备内的溶液就会自动被 其吸附，形成直径最好为2-4mm的圆点或宽度为5-10mm的条带，完 成一次点样。 注意：若需要在同一个位置多次点样，则每点一次，应带溶剂挥干 后再点下一次，避免斑点扩散；当一块薄层板上需点几个样品时， 点样设备不能混用。
薄层板上的斑点位置确定之后，可对物质进 行定性鉴别、杂质检查和含量测定。
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第三节 在药物分析中的应用
主要用于中药、化学药物、生物制品等的定 性鉴别、杂质检查、含量测定。
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一、在鉴别方面的应用
通常采用对照物比较法进行定性鉴别。在保证 各斑点分离度达到标准的前提下，如果样品的 Rf与对照物的Rf相同，则可认为该组分与对照 物为同一物质。 为了结果的准确可靠，应采用多种不同的展开 系统进行展开，如果所得到的Rf都与对照品一 致，则可认定两者是同一物质。
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锯齿扫描
(1)单波长扫描：使用一种波长的光线对薄 层进行扫描。 (2)双波长扫描：是采用两种不同波长的光 束先后扫描所要测定的斑点，并记录下此两 波长吸光度之差，可以消除薄层背景吸收的 干扰。
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化合物斑点的吸收光谱
单波长与双波长扫描曲线的比较
6.定量方法
2.仪器：光源、单色器、薄层板台、检测器、色谱工作站 3.测量方法：根据对光测定方式的不同，可分为三种
透射法：测量反射光的强度 反射法：测量透射光的强度
L 光源；MC 单色 器；P 薄层板； S 斑点； PD 光电 检测器
薄层色谱法
第二部分色谱分析第一章薄层色谱法（TLC）一薄层色谱法概述薄层色谱法是一种基于混合物组分在固定相和流动相之间的不均匀分配或保留而将其分离的方法。
与HPLC不同，TLC将固定相涂铺在栽板上，使之形成均匀的薄层。
被分离的样品溶液点加在薄层板下沿的位置，再把下沿向下放入盛有流动相（深度约5mm）的密闭缸中，进行色谱展开，实现混合组分分离。
被展开的组分斑点即色谱谱带，通过适当技术对色谱谱带进行处理可得到定性和定量的检测结果。
薄层色谱法具有技术比较简单，操作容易，分析速度快，高分辨能力，结果直观，不需昂贵仪器设备就可以分离较复杂混合物等特点。
二薄层色谱法中的薄层板、薄层板的涂铺、点样和展开（一）薄层板TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。
可通过改变涂层材料的化学组成或对材料表面进行化学改性来实现改变薄层色谱分离的选择性。
此外，固定相的物理性质，如比表面积、比空容、平均孔径等也对其色谱行为产生影响。
（1）载体对TLC载体的基本要求为：机械强度好、化学惰性好（对溶剂、显色剂等）、耐一定温度、表面平整、厚度均匀、价格适宜。
（2）固定相TLC固定相包括改性固定相和未改性固定相两类。
硅胶和氧化铝是最常用的两种未改性固定相。
（3）粘合剂在制备薄层板时，一般需在吸附剂中加入适量粘合剂，其目的是使吸附剂颗粒之间相互粘附并使吸附剂薄层紧密的附着在载板上。
常用的粘合剂可分为无机粘合剂和有机粘合剂两类。
（4）荧光指示剂荧光指示剂是便于在薄层色谱图上对一些基本化合物斑点（无颜色斑点、无特征紫外吸收斑点）定位的试剂。
加入荧光指示剂后，可以使这些化合物斑点在激发光波照射下显出清晰的荧光，便于检测。
（二）薄层板的涂铺涂板方法可以分为涂布法、倾注法、喷洒法及浸渍法四类，其中涂布法是应用最广泛的涂板方法。
TLC固定相薄层涂铺大多采用湿法匀浆，要求薄层均匀、平整、无气泡、不易造成凹坑和龟裂。
薄层板活化处理可以获得适宜活性，提高色谱分离效率和选择性。
薄层色谱法
• 理论塔片n主要是吸附剂性质的函数 • k 反映了两种溶质的平均迁移速度，其由流动相溶
剂强度 决定 • 取决于吸附剂和流动相的组成
• 溶剂优化规则：
• 增加溶剂强度，使Rf值增大，但也可能降低分 离能力。
– k ∞ 9 4 2 1 0.5 0 – Rf 0 0.1 0.2 0.33 0.5 0.67 1
– 3.分离度
– R=
2(Ls.2-Ls.1) W1+W2
– 因Ls=Rf L0，同时对相邻的两个斑点，假定 W1=W2=W
–
则R=
L0
Rf.2-
W
Rf.1
= L0
W
×⊿Rf
– 与n=16[Ls/W] 2式合并，得：
参 比
前
沿
Ls
– 注意： – 同一物质在不同展开方式中得到的比移值是不相同的
。 – 在同样溶剂的重复n次的多次展开后的比移值
(Rf)n=1-(1-Rf)n
• 2. 相对比移值（Rx）
– 在难以确定溶剂前沿的位置时，需要引入相对比移值 （Rx） Rx=Ls/Lr
– 二、分离效能参数
• 1.理论塔板数 • n=16[Ls/W] 2 ，考虑静态扩散对起始斑点半
一般，被分离组的极性强，选择吸附 能力弱的吸附剂；反之，选吸附能力较强 者。
种类：
• 硅胶—为使用最广泛的薄层材料 • 氧化铝—有碱性、中性、酸性 • 硅藻土—为化学中性吸附剂 • 纤维素—天然多糖类 • 聚酰胺—为特殊类型有机薄层材料，对能形
成氢键的物质有特别的选择性
• 硅胶：化学分子式为mSiO2·nH2O,多孔性 微粒，表面带有硅醇基，呈弱酸性。
薄 层 色 谱
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3.展开
薄层色谱的展开是在密闭容器中进行的。 将展开剂（6mL环己烷和2mL苯的混合物）倒入层析缸中， 待层析缸中充满溶剂蒸气后，将点好样的层析板放入缸中展开。 点样的位置必须在展开剂液面之上。当展开剂展开至距顶 端0.5～1cm时，取出层析板用铅笔画出溶剂前沿位置，晾干。
经过薄层层析后，没有经过光照的偶氮苯在薄层板上只有一 个斑点，而经过光照的偶氮苯有两个斑点。
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比移值
在薄板上混合物的各个组分 上升的高度与展开剂上升的 前沿之比称为该化合物的比 移值，用Rf表示。
前沿线
色斑 起始线
薄层色谱示意图
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实验装置
吸附剂薄层 原样点
10
2
5
1 0
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易被吸附的物质相对移动较慢，在薄层板上移动的距离 就小；反之，较难被吸附的物质相对移动较快一些，在薄层 板上移动的距离则大。
经过一段时间的展开，混合物中各组份在薄层板上连续不 断地进行吸附和解吸附过程，从而使各组份移动的速度产生 差异，不同物质就被彼此被分开，最后形成互相分离的斑点。
薄层色谱法优点
5.将点好样的板放入层析缸，展开，在展开剂离顶 部1cm 的时刻取出，用铅笔画出前沿的位置， 并划出斑点的位置。
6.在另一块板上重复一次实验。 7.计算顺反偶氮苯的的比移值，并确定哪个斑点是
顺式偶氮苯。
注意事项
1．层析缸不要洗，废液要倒入废液缸 2．薄板要放平。 3．注意观察展开剂的位置，作好标记。
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4.计算Rf
前沿线
色斑
起始线
第二章 薄层色谱
3、展开 、 吹干样点， 吹干样点，竖直放入盛有展开剂的有盖展开 瓶中。薄层色谱的展开， 瓶中。薄层色谱的展开，需要在密闭容器中进行 为使溶剂蒸气迅速达到平衡， 。为使溶剂蒸气迅速达到平衡，可在展开槽内衬 一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂， 一滤纸。在层析缸中加入配好的展开溶剂，使其 高度不超过1cm。将点好的薄层板小心放入层析 高度不超过 。 缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。 缸中，点样一端朝下，浸入展开剂中。盖好瓶盖 观察展开剂前沿上升到一定高度时取出， ，观察展开剂前沿上升到一定高度时取出，尽快 在板上标上展开剂前沿位置。晾干，观察斑点位 在板上标上展开剂前沿位置。晾干， 计算Rf值 展开剂要接触到吸附剂下沿， 置，计算 值。展开剂要接触到吸附剂下沿，但 切勿接触到样点。盖上盖子，展开。 切勿接触到样点。盖上盖子，展开。待展开剂上 行到一定高度（由试验确定适当的展开高度）， 行到一定高度（由试验确定适当的展开高度）， 取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。 取出薄层板，再画出展开剂的前沿线。
第二章 食品分析中常用仪器 检测方法
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薄层色谱法
一、原理 最常用的薄层色谱也属于液-固吸附色谱 固吸附色谱。 最常用的薄层色谱也属于液 固吸附色谱。吸 附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。 附剂被涂布在玻璃板上，形成薄薄的平面涂层。 干燥后在涂层的一端点样 涂层的一端点样， 干燥后在涂层的一端点样，竖直放入一个盛有少 量展开剂的的有盖容器中。展开剂接触到吸附剂 量展开剂的的有盖容器中。 涂层，借毛细作用向上移动。 涂层，借毛细作用向上移动。经过在吸附剂和展 开剂之间的多次吸附 溶解作用， 多次吸附-溶解作用 开剂之间的多次吸附 溶解作用，将混合物中各组 分分离成孤立的样点，实现混合物的分离 分离。 分分离成孤立的样点，实现混合物的分离。
薄层色谱法(TLC)
增大。
正己烷 环己烷 四氯化碳 甲苯 氯仿 正丁醇 乙酸乙酯 丙 乙醇 水
溶剂的洗脱能力随溶剂的极性增大而增强
当一种溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合 溶剂作为展开剂。先用一种极性较小的溶剂为基础溶 剂展开混合物，若展开不好，用极性较大的溶剂与前 一溶剂混合，调整极性，再次试验，直到选出合适的 展开剂组合。
五 结果计算与判断
展开结束后，经过各种显色操作后，样品中各个成 分的斑点可能出现了不同程度的分离，为了表达各 成分的相对位置（极性）通常以比移值作为称量斑 点位置的指标。
比移值Rf＝(斑点中心与原始样点之间的距离)/(溶剂 前沿与原始样点之间的距离)
各种物质的Rf 随要分离化合物的结构，滤纸或薄层 板的种类、溶剂、温度等不同而不同，但在条件固 定的情况下，Rf对每一种化合物来说是一个特定数值。
常用硅胶的规格：硅胶H，硅胶G，硅胶GF254等
• 氧化铝：a.极性吸附剂，较硅胶强。 b.物理吸附为主，氢键吸附为辅
c.微碱性，不直接用于酸类成分的分离
碱性氧化铝：适用于碳氢化合物、生物碱以及其它碱 性化合物的分离。 中性氧化铝：应用最广，适用于醛、酮、醌以及酯类 化合物的分离。 酸性氧化铝：适用于有机酸类的分离。
薄层色谱法（TLC）
韩春明
一 概述
TLC是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱 法。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于 少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另 一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，将样品 点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此，又可 用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温 度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质。此外， 在进行化学反应时，薄层色谱法还可用来跟踪有机反 应及进行柱色谱之前的一种“预试”，常利用薄层色 谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
薄层色谱
薄层色谱薄层色谱，或称薄层层析（Thin-Layer Chromatography），是以涂布于支持板上的支持物作为固定相，以合适的溶剂为流动相，对混合样品进行分离、鉴定和定量的一种层析分离技术，是一种快速分离诸如脂肪酸、类固醇、氨基酸、核苷酸、生物碱及其他多种物质的特别有效的层析方法。
薄层色谱法是一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。
一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品，因此又可用来精制样品。
因此，薄层色谱法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。
此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。
在我国新推出的2010版药典中，降低了薄层色谱分析所占的比例，这似乎表明着薄层色谱分析方法将会逐渐被替代，但是在实际的工作中，薄层色谱法以其快速、简便的优势一直活跃在分析检测的一线，加上电动点样机和薄层扫描仪的出现，加快了点样和检测的速度和质量，使得这一技术在生产分析中起到了重要作用。
一、薄层色谱的分类1、常规薄层色谱TLC分离的选择性主要取决于固定相的化学组成及其表面的化学性质。
常规薄层色谱的固定相为未改性的硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素和聚酰胺等，平均颗粒度20μm，点样量1~5μL，展开时间30~200min，检测限1~5ng。
以正相色谱占主导地位，设备简单，所需资金投入少；不足之处是分离所需时间长，有明显的扩散效应。
2 高效薄层色谱高效薄层色谱（HPTLC）采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性。
C2、C8和C18化学键合硅胶板为常见反相薄层板。
高效板厚平均100~250μm、点样量0. 1~0. 2μL，展距3~6cm，展开时间3~20min，最小检测量0. 1~0. 5μg，较常规TLC可改善分离度，提高灵敏度和34重现性，适用于定量测定。
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薄层色谱与柱层析和纸层析比较
(1)快速 (2)分离效率高(多柱路) (3)灵敏度高(斑点扩散小,比纸色谱高10-100倍) (4)显色方法多样(腐蚀性显色剂) (5)图象易保存
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二. 基本参数
比移值（Rf） Rf =原点至组分点中心的距离/原 点至溶剂前沿的距离 组分A的Rf =a/c 组分B的Rf =b/c
常用的点样方式
a 一般点样
b 径向点样
c 条状点样
d 线形小孔点样
e 样品填入沟槽
径向展开与普通展开的区别
展开操作
1.展开槽的密闭 目的是使展开槽被展开剂蒸气饱和并使展开剂组成 不变。 2.展开槽的饱和 为避免“边缘效应”，在薄层板用展开剂蒸气饱和 有时是必要的。 3.展开距离 常规薄层最长展距为20cm;高效薄层展距最长为 10cm。 4.展开温度
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• 图1 • 1.防风通圣丸2.妙济丸3.心通口服液4.天麻丸5.十全 大补丸6.黄氏响声丸7.木瓜片8.止痛化瘤片9.石斜夜 光丸10.川穹茶调浓缩丸11.补肾益脑丸12.逍遥丸13. 黄连上清丸14.丸味羌活丸15.乌鸡白凤丸16.人参再 造丸。“标”为蒿本内酯对照品
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Thank you
本组成员:
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建立含当归、 川穹 中成药中藁本内酯的薄层色谱 TLC
实际上当归 川穹中藁本内酯含量远高于阿魏酸和川芎嗪 在药材中的含量。已有大量研究报道蒿本内酯对心血管系 统有较强药理活性。 因此 将藁本内酯作为含当归 川穹 中成药中活性检测成分是最有科学依据的
但由于藁本内酯结构特殊稳定性差，其藁本内酯对照品 制备难 保存更难现还未有文献报道中成药制剂中的藁本 内酯检测分析 ，我们可以通过薄层色谱来分析
2 专属性显色剂
指能使某一类或少数几类官能团或化合物显色的试剂。 例如2%2，4-二硝基苯肼乙醇溶液喷后在120℃加热10分钟，醛 酮在黄橙色背景上显红色或橙色斑。
四、薄层色谱法 在中成药分析中的应用
当归 、川穹是养血活血的常用传统中药。也是 中成药制剂的常用药材。现常用阿魏酸和川芎嗪作 为当归、川芎的指标检测成
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5.展距对结果的影响
展距对结果的影响，硅胶HPTLC 分离洋甘菊油， a）3 cm、b）5 cm、c）7 cm、d）9 cm。
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(六)薄层层析的定性检测
展开完毕后，把薄层从层析缸中取出，用铅笔划出或 小针刺出展开剂前缘的位置，随即进行显色，以确定各个 斑点的位置、Rf值和显色情况，从而判断试样中含有哪些 组分。
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新型薄层色谱内标法测定葛根素含量
• 以大豆甙元为内标物在高效硅胶薄层板上测定葛根素注射液， 中药葛根及中成药玉泉丸中葛根素的含量，建立了新型TLC内 标法测定葛根素的新方法。 • 仪器材料：CS-9000型双波长扫描仪（日本岛津），定量点样毛 细管（Drummond scientific A）,高效硅胶G薄层板（青岛 海洋化工厂，200mm×100mm，50mm×100mm， 30mm×100mm） • 薄层扫描条件：在高效硅胶G薄层板上以甲醇－乙酸乙酯－石 油醚－水（1.8:6:4:0.35）为展开剂，展距为8cm,在365nm紫外 光下观察斑点位置。葛根素Rf＝0.35,大豆甙元Rf＝0.71。 • 定量：锯齿反射扫描。
常用的薄层色谱法以吸附剂为固定相,属于吸附色谱的范畴
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特点
薄层色谱与液相色谱法比较
HPLC TLC
在一块板上点上多个样品 同时进行分离
每次只能分析一个样品
对样品制备要求高，必须不 用毕一次弃去，可直接用 含可吸留在柱上的杂质，否 样品的粗提物点样 则柱性能受损 可用检测器种类较少 展开后可用多种手段检测
1 通用显色剂
(1) 浓硫酸或50%的硫酸溶液：极大多数有机物质，喷此种显色 剂后立刻或在加热到110—120℃并经数分钟后出现棕色到黑色斑 点。 (2) 酸碱指示剂溶液：例如0.3%溴甲酚绿甲醇溶液，在绿色背景 上显现黄色斑，表示是脂肪族羧酸。 常用的通用显色剂还有：5%磷钼酸乙醇、 碱性高锰酸钾溶液、 硝酸银-氢氧化铵试剂、荧光显色剂等。
• 吸附剂的选择：首先决定于样品成分的性 质，即它们的溶解性、酸碱性、极性以及 是否与吸附剂起化学反应等； • 其次要考虑吸附剂、载体是否容易得到及 其价格等。
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(二) 薄层板的制作
层析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（纸浆、纤维素、硅胶、 中性氧化物、聚酰胺、多孔性玻璃粉，硅烷化键合硅胶等）均匀 地涂在在 薄 层板 （玻 璃 板、金属 板 或弹性塑 料 板 ）上， 干 燥 （100℃-105 ℃活化），时间一般为30min,后即可使用.也可 放在干燥器内备用
相对比移值（Rst） 其定义为：Rst＝原点至样品斑点中心的距离／ 原点至参考物斑点中心的距离 组分A相对于物质B的“相对比移值” RB =a/b
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三.薄层色谱的操作
• 吸附剂的选择 • • • • • 薄层板的制作 展开剂的选择 点样 展开 显色
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(一) 薄层层析用的吸附剂
• 常用的薄层层析吸附剂有硅胶、氧化铝、 纤维素、聚酰胺等。
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2.棒状薄层色谱（Rod-TLC）
将样品点在薄层棒上，经点样、展开后 将被分离后的色谱棒通过适当的机械传动 装置，水平地穿过检测氢火焰的中心，使 化合物燃烧裂解，形成离子碎片和自由电 子，再由电极收集它们并产生与化合物量 成正比的电流信号而测出各物质的含量。
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3.超薄层色谱（Ultra Thin-layer Chromatography）
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(四 ) 点
样
1.样品溶液 一般用甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等挥发性有机 溶剂，最好用与展开剂极性相似的溶剂溶解试样，配 成0.5%~1%的试液。 2.点样量 点样量的多少与薄层的性能、厚薄及显色剂的 灵敏度有关。一般来说，样品量最小为几ng，常用量 为几至几十µg，制备型的分离可以点样到mg量。总之 点样量随分离目的而定。 3.点样方式 最好是直径3—5mm的圆点。
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(三)薄层层析中展开剂的选择
主要根据极性的不同来选择流动相展开剂。
各种展开剂按其极性不同排序为： 烷烃<烯烃<醚类<硝基化合物<二甲胺<酯 类<酮类<醛类<硫醇<胺类<酰胺<醇类<酚类 <羧酸
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在具体工作中，展开剂的选择还必须进 一步通过实践，一般可用下列方法： (1)查阅文献 (2)微型薄层 ：用小玻片铺上薄层，用各 种经初步选择认为可能应用的展开剂展开， 从而选择适当的展开剂，再用于一般的薄层 层析。用微型薄层，节省材料和时间。
有色物质经展开后呈现明显的色斑，很易判断。
对于无色物质，可根据化合物的性质，用物理检 出法、化学检出法、酶与生物检出法和放射性检出法进行
显色。
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1.化学检出法
化学检出法是在薄层上使用一种或数种 化学试剂与被检出物质反应，生成有颜色 的化合物而定位。这种试剂叫显色剂。
显色剂 一般分为两类，即通用显色剂 和专属性显色剂。
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薄层色谱（TLC）与基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱
（MALDI-TOF-MS）联用分析大脑中磷脂
• 薄层色谱条件： 高效硅胶60薄层板（10×10cm）（Terck， Germany） • 展开剂 氯仿：甲醇：水：三乙胺（30:35:7:35 v/v/v/v） • 层析槽 CAMAG，Switerland • 样品量 5µL • 显色条件 PRIMULINE（Direct Yellow 59）溶于丙酮/水（80:20v/v ） 中，UV254nm观察紫色斑点 • 检测 取下斑点，用75µL氯仿+75µL甲醇+75µL 0.9%Nacl水溶液洗 脱，涡旋搅拌，离心分离，蒸干有机相，剩余物溶于 20µL基质溶液， 直接用MALDI-TOF-MS检测
中成药分析
本组成员:
薄层色谱法
（Thin-layer Chromatography，TLC）
1 2
前言
基本参数
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薄层的基本操作
薄层色谱在中成药分析中的应用一.前言Fra bibliotek定义:
薄层色谱法通常指以吸附剂为固定相的一种 液相色谱法。即将固定相在玻璃、金属或塑 料等光洁的表面上均匀地铺成薄层，试样点 在薄层的一端，流动相借毛细作用流经固定 相,使被分离的物质展开。
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五、 特殊的薄层
1. 高效薄层色谱（HPTLC） 2. 棒状薄层色谱（Rod-TLC） 3. 超薄层色谱 （Ultra Thin-layer Chromatography）
1.高效薄层色谱（HPTLC）
HPTLC是在普通薄层基础上发展起来的一种更为 灵敏、精细的薄层技术。高效薄层是采用小颗粒吸 附剂制备的均匀薄层，分离效率比普通薄层提高三 倍，检出灵敏度增加，分析时间缩短。 高效薄层色谱由于吸附剂颗粒小，流动相展开速 度慢，平衡易于达到，质量传递的阻滞作用往往可 以忽略不计，展开后斑点的大小主要由化合物分子 扩散系数决定。化合物展开后只要不走在溶剂前沿， 均呈小而圆整的斑点。
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标 9 101112 1314 15 16
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标 9 101112 1314 15 16
从图 1 可看出 2，3，7，8，13，15，16 在蒿本内酯对照品点 处没有类似的荧光斑点， 说明这几个中成药制剂中 TLC 检测不到 当归，川穹的有效成分寞本内酯，可以初步判断这几个制剂中当 归 ，川穹的药材加入量很低或没有加入正品当归，川穹药材。
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样品溶液制备:取各中成药用研钵研磨成细末状，分别称取2 g 各药细末加入10 mL 的甲醇溶解,再用超声波清洗机分别超声 30 min，离心，取上清液作为供试样,备用.称取藁本内酯对照 品10 mg 加入10 mL 甲醇溶解,作为对照样品，备用