高分子量小麦谷蛋白亚基

③浓缩效应 蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成
层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
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● 实验材料、药品和器材
实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照 实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像
仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移 液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。
● 实验操作步骤
1、小麦谷蛋白提取程序 ①取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中，
加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器 上混合均匀； ②将离心管放入65℃水浴锅中水浴45min后取 出离心管放，室温冷却； ③将冷却后的离心管12000转/min离心30min， 保存于 4℃ 冰箱备用。
2 电泳程序 ①封板：利用1%琼脂封板，以防玻璃板漏胶； ②凝胶配制：见表 1。 ③ 制胶：按表1的配方分别配制 8% 和 15% 两种分离 胶，然后用两个取液器进行以下操作，先吸取1.0ml已经 混匀的 15% 分离胶，加到玻璃板之间，再向 15% 分离 胶中加入 8% 的分离胶0.5ml ，充分混匀后，从中吸取 1.0ml加到玻璃板之间，如此反复操作上述步骤，
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小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）与小 麦的加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的 一项重要指标。HMW-GS作为一种分子标记，有 助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。十二烷基 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目 前分离小麦 HMW-GS 的主要方法，此方法具有准 确、微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤 其是可以分析半粒无胚籽粒的 HMW-GS 组成，所 剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方 法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选 的重要方法。
12.5 ------
-----1.25
0.5
0.5
0.1
0.5 (0.25) 0.5 (0.25) 0.1
0.03 (0.02) 0.02
0.01
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④ 点样：将胶板放在电泳槽中加入电极缓冲液至高 出内侧 玻璃板上边约0.5cm，用微量进样器吸取蛋白 质10-20ul分别加在每个样品槽底部凝胶面上。
1 简述小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE 原理及其注意事项。
2 封板和灌胶时为什么不能产生气泡？本实验是否 需在低温下进行？电泳后上下槽的电极缓冲液能 否混合存放？
3 根据实验过程总结如何做好SDS-PAGE？关键步 骤有那些？
4 绘制中国春等5个样品的电泳图谱带型。
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实验药品：丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,,N,-四
甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、
甘油、十二烷基硫酸 钠、考马斯亮蓝等。
试剂配制：
①麦谷蛋白提取液：4g SDS + 1g DTT + 250 ml 0.5M Tris-HCl (PH = 6.8)+ 20 ml甘油 + 30 mg溴酚蓝 + 蒸馏水定溶至 100 ml。
❖ 各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在 电场向一定电极，以一定的速度泳动。
❖ 迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量 的大小以及分子的形状等因素。
②分子筛效应 由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网
络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别 不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛 分能力即分子筛效应。
⑦ 拍照：利用凝胶成像仪或者普通像机拍照观察。
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● 结果分析
1 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，
按Payne的数字命名法命名，见图1
图1小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，
2 小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱 部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱见图 2
实验一 小麦高分子量谷蛋白亚基测定
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● 实验内容：
测定小麦高分子量谷蛋白亚基
●实验目的:
①掌握利用不连续十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺 凝胶电泳(SDS-PAGE)分离小麦高分子量谷 蛋白 亚基（HMW-GS）百度文库法；
②了解小麦高分子量谷蛋白亚基的命名方法； ③识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱。
●实验原理：
小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE 系 统集电荷效应、分子筛效应和浓缩效应为一体，在 这三种效应的共同作用下，把小麦谷蛋白亚基按分 子量大小分离开来。
以亚基组成已知的中国春小麦品种做对照，就 可以对待测小麦品种的 HMW-GS 组成进行鉴定。
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❖ ①电荷效应
● 注意事项：
① 丙烯酰胺和双丙烯酰胺有很强的神经毒性，容易 吸附在皮肤上，且作用有积累性，称量时戴手套和 口罩；
② 封板和灌胶时都不能产生气泡，以防漏胶及谱带 弯曲；
③ 使用过的滴管、玻璃器皿要立即冲洗，以防止凝 固堵塞；
④ 平板玻璃昂贵，实验过程中要特别小心。实验结 束后认真清洗放回原处。
● 思考题
⑥ 3 M Tris-HCI（ PH = 8.8）: 36.3g Tris + 蒸 馏水定 溶至 100ml,用1 M HCI 调 PH = 8.8。
⑦ 10% SDS：SDS 10g + 蒸馏水定溶至100ml。
⑧ 10% 过硫酸铵：1g过硫酸铵 + 蒸馏水定溶10ml。
⑨ 染色液：100mg G-250 + 12 g三氯乙酸 + 蒸馏水定 溶至200ml。
⑤ 电泳：下槽为正极，上槽为负极，每胶板30mA稳 流电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部，电泳完毕。
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⑥ 卸胶、染色和脱色：卸下胶板，用手术剪撬开玻 璃板 ，将整块分离胶浸没在0.25%考马斯亮蓝溶液 中，放在摇床上缓缓摇动染色过夜；次日，取出凝 胶，蒸馏水漂洗直至呈现清晰可见的蛋白质色带。
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表1 分离胶与浓缩胶配方
成分
H2O 30%Acr 1M Tris-HCl (pH8.8) 1M Tris-HCl (pH6.8) 10%SDS 10%AP TEMED
8%分离胶 15%分离胶 5%浓缩胶
50ml
50ml
10ml
23.2
11.5
6.8
13.3
25.0
1.7
12.5 ------
②10×电极缓冲液：Tris-HCI 30.3 g + 甘氨酸 144 g + SDS 10 g + 蒸馏水定溶至 1000ml。
③30%丙烯酰胺：30 g + 蒸馏水定溶至 100ml。
④2%甲叉双丙烯酰胺：2 g + 蒸馏水定溶至 100ml。
⑤ 1 M Tris-HCI（ PH = 6.8）: 12.1g Tris + 蒸馏水定 溶至 100ml,用1 N HCI 调 PH = 6.8。
图 2 部分小麦高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱
HMW-GS的变异由Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三个位点上 的等位基因所控制，不同小麦基因型的高分子量谷蛋白亚基组 成不同，但也有相同。如中国春、红火麦、马奎斯和济麦20的 高分子量谷蛋白亚基SDS-PAGE图谱见 图 3
图3 中国春、红火麦、马奎斯和济麦20 高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱 图3 中国春、红火麦、马奎斯和济麦20 高分子量谷蛋白亚基 SDS-PAGE 图谱
直至距玻璃板上缘约 3cm 处时，向胶面上加一 层正丁醇，静置，直至分离胶凝固。倒置胶板， 流出正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面，用滤纸吸尽 多余水。
按表1配制5%浓缩胶，混匀后倒入玻璃板之 间，将梳子放置在玻璃板间，注意不要产生气 泡，静置至胶凝。待浓缩胶凝固后，垂直取出 梳子，加蒸馏水，甩出样品槽中的残胶。