高分子量小麦谷蛋白亚基汇总.
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实验一
小麦高分子量谷蛋白亚基测定
2017/9/29
1
● 实验内容：
测定小麦高分子量谷蛋白亚基
●实验目的:
①掌握利用不连续十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺
凝胶电泳(SDS-PAGE)分离小麦高分子量谷 蛋白
亚基（HMW-GS）方法；
②了解小麦高分子量谷蛋白亚基的命名方法；
③识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱。
2017/9/29
14
⑥ 卸胶、染色和脱色：卸下胶板，用手术剪撬开玻
璃板 ，将整块分离胶浸没在0.25%考马斯亮蓝溶液 中，放在摇床上缓缓摇动染色过夜；次日，取出凝 胶，蒸馏水漂洗直至呈现清晰可见的蛋白质色带。 ⑦ 拍照：利用凝胶成像仪或者普通像机拍照观察。
2017/9/29
15
● 结果分析
1 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率， 按Payne的数字命名法命名，见图1
确、微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤
其是可以分析半粒无胚籽粒的 HMW-GS 组成，所
剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方 法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选
的重要方法。
●实验原理：
小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE 系
统集电荷效应、分子筛效应和浓缩效应为一体，在
2017/9/29 2
小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）与小
麦的加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的
一项重要指标。HMW-GS作为一种分子标记，有
助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。十二烷基 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目
前分离小麦 HMW-GS 的主要方法，此方法具有准
的大小以及分子的形状等因素。
②分子筛效应
由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网 络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别 不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛 分能力即分子筛效应。
③浓缩效应
蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成
层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
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TEMED
2017/9/29
0.03 (0.02)
0.02Fra Baidu bibliotek
0.01
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④ 点样：将胶板放在电泳槽中加入电极缓冲液至高 出内侧 玻璃板上边约0.5cm，用微量进样器吸取蛋白 质10-20ul分别加在每个样品槽底部凝胶面上。
⑤ 电泳：下槽为正极，上槽为负极，每胶板30mA稳 流电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部，电泳完毕。
● 实验材料、药品和器材
实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照 实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像 仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移 液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。 实验药品：丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,,N,-四
甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、
④2%甲叉双丙烯酰胺：2 g + 蒸馏水定溶至 100ml。
⑤ 1 M Tris-HCI（ PH = 6.8）: 12.1g Tris + 蒸馏水定 溶至 100ml,用1 N HCI 调 PH = 6.8。 ⑥ 3 M Tris-HCI（ PH = 8.8）: 36.3g Tris + 蒸 馏水定 溶至 100ml,用1 M HCI 调 PH = 8.8。 ⑦ 10% SDS：SDS 10g + 蒸馏水定溶至100ml。 ⑧ 10% 过硫酸铵：1g过硫酸铵 + 蒸馏水定溶10ml。 ⑨ 染色液：100mg G-250 + 12 g三氯乙酸 + 蒸馏水定 溶至200ml。
这三种效应的共同作用下，把小麦谷蛋白亚基按分
子量大小分离开来。 以亚基组成已知的中国春小麦品种做对照，就 可以对待测小麦品种的 HMW-GS 组成进行鉴定。
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①电荷效应 各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在
电场向一定电极，以一定的速度泳动。
迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量
表1 分离胶与浓缩胶配方 成 分
H2O 30%Acr 1M Tris-HCl (pH8.8) 1M Tris-HCl (pH6.8) 10%SDS 10%AP
8%分离胶 15%分离胶 5%浓缩胶 50ml 50ml 10ml
23.2 13.3 12.5 -----0.5 0.5 (0.25) 11.5 25.0 12.5 -----0.5 0.5 (0.25) 6.8 1.7 -----1.25 0.1 0.1
图1小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，
②凝胶配制：见表 1。 ③ 制胶：按表1的配方分别配制 8% 和 15% 两种分离 胶，然后用两个取液器进行以下操作，先吸取1.0ml已经 混匀的 15% 分离胶，加到玻璃板之间，再向 15% 分离 胶中加入 8% 的分离胶0.5ml ，充分混匀后，从中吸取 1.0ml加到玻璃板之间，如此反复操作上述步骤，
甘油、十二烷基硫酸 钠、考马斯亮蓝等。
试剂配制：
①麦谷蛋白提取液：4g SDS + 1g DTT + 250 ml 0.5M Tris-HCl (PH = 6.8)+ 20 ml甘油 + 30 mg溴酚蓝 + 蒸馏水定溶至 100 ml。
②10×电极缓冲液：Tris-HCI 30.3 g + 甘氨酸 144 g + SDS 10 g + 蒸馏水定溶至 1000ml。 ③30%丙烯酰胺：30 g + 蒸馏水定溶至 100ml。
直至距玻璃板上缘约 3cm 处时，向胶面上加一
层正丁醇，静置，直至分离胶凝固。倒置胶板，
流出正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面，用滤纸吸尽
多余水。
按表1配制 5%浓缩胶，混匀后倒入玻璃板之
间，将梳子放置在玻璃板间，注意不要产生气
泡，静置至胶凝。待浓缩胶凝固后，垂直取出
梳子，加蒸馏水，甩出样品槽中的残胶。
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● 实验操作步骤
1、小麦谷蛋白提取程序
①取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中，
加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器
上混合均匀；
②将离心管放入65℃水浴锅中水浴45min后取
出离心管放，室温冷却；
③将冷却后的离心管12000转/min离心30min， 保存于 4℃ 冰箱备用。
2 电泳程序
①封板：利用1%琼脂封板，以防玻璃板漏胶；
小麦高分子量谷蛋白亚基测定
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● 实验内容：
测定小麦高分子量谷蛋白亚基
●实验目的:
①掌握利用不连续十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺
凝胶电泳(SDS-PAGE)分离小麦高分子量谷 蛋白
亚基（HMW-GS）方法；
②了解小麦高分子量谷蛋白亚基的命名方法；
③识别部分常见小麦高分子量谷蛋白亚基图谱。
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⑥ 卸胶、染色和脱色：卸下胶板，用手术剪撬开玻
璃板 ，将整块分离胶浸没在0.25%考马斯亮蓝溶液 中，放在摇床上缓缓摇动染色过夜；次日，取出凝 胶，蒸馏水漂洗直至呈现清晰可见的蛋白质色带。 ⑦ 拍照：利用凝胶成像仪或者普通像机拍照观察。
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● 结果分析
1 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名 小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率， 按Payne的数字命名法命名，见图1
确、微量、快速、操作简便、分辨率高等优点，尤
其是可以分析半粒无胚籽粒的 HMW-GS 组成，所
剩余的带胚半粒仍可以播种或组织培养，因此此方 法已经成为小麦品种鉴定、亲本选配及其后代筛选
的重要方法。
●实验原理：
小麦高分子量谷蛋白亚基不连续 SDS-PAGE 系
统集电荷效应、分子筛效应和浓缩效应为一体，在
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小麦高分子量谷蛋白亚基（HMW-GS）与小
麦的加工品质密切相关，其组成是小麦品质预测的
一项重要指标。HMW-GS作为一种分子标记，有
助于提高小麦品质性状遗传改良的效率。十二烷基 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术是目
前分离小麦 HMW-GS 的主要方法，此方法具有准
的大小以及分子的形状等因素。
②分子筛效应
由于凝胶具有黏度和较高摩擦阻力，以及其网 络结构直接参与了移动颗粒的分离过程，这种区别 不同大小分子种类的能力就是凝胶所具有的一种筛 分能力即分子筛效应。
③浓缩效应
蛋白质样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成
层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。
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TEMED
2017/9/29
0.03 (0.02)
0.02Fra Baidu bibliotek
0.01
13
④ 点样：将胶板放在电泳槽中加入电极缓冲液至高 出内侧 玻璃板上边约0.5cm，用微量进样器吸取蛋白 质10-20ul分别加在每个样品槽底部凝胶面上。
⑤ 电泳：下槽为正极，上槽为负极，每胶板30mA稳 流电泳，直至溴酚蓝接近分离胶底部，电泳完毕。
● 实验材料、药品和器材
实验材料：小麦籽粒，小麦普通中国春和马奎斯为对照 实验器材：离心机、电泳仪、电泳槽、梳子、制胶架、成像 仪、研钵、振荡器、微波炉、天平、pH计、移 液器、微量进样器、染色盘、摇床、量筒等。 实验药品：丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、N,N,N,,N,-四
甲基乙二胺、过硫酸铵、二硫苏糖醇、甘氨酸、
④2%甲叉双丙烯酰胺：2 g + 蒸馏水定溶至 100ml。
⑤ 1 M Tris-HCI（ PH = 6.8）: 12.1g Tris + 蒸馏水定 溶至 100ml,用1 N HCI 调 PH = 6.8。 ⑥ 3 M Tris-HCI（ PH = 8.8）: 36.3g Tris + 蒸 馏水定 溶至 100ml,用1 M HCI 调 PH = 8.8。 ⑦ 10% SDS：SDS 10g + 蒸馏水定溶至100ml。 ⑧ 10% 过硫酸铵：1g过硫酸铵 + 蒸馏水定溶10ml。 ⑨ 染色液：100mg G-250 + 12 g三氯乙酸 + 蒸馏水定 溶至200ml。
这三种效应的共同作用下，把小麦谷蛋白亚基按分
子量大小分离开来。 以亚基组成已知的中国春小麦品种做对照，就 可以对待测小麦品种的 HMW-GS 组成进行鉴定。
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①电荷效应 各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在
电场向一定电极，以一定的速度泳动。
迁移率主要取决于所带电荷的多少、分子量
表1 分离胶与浓缩胶配方 成 分
H2O 30%Acr 1M Tris-HCl (pH8.8) 1M Tris-HCl (pH6.8) 10%SDS 10%AP
8%分离胶 15%分离胶 5%浓缩胶 50ml 50ml 10ml
23.2 13.3 12.5 -----0.5 0.5 (0.25) 11.5 25.0 12.5 -----0.5 0.5 (0.25) 6.8 1.7 -----1.25 0.1 0.1
图1小麦高分子量谷蛋白亚基的命名是依其相对迁移率，
②凝胶配制：见表 1。 ③ 制胶：按表1的配方分别配制 8% 和 15% 两种分离 胶，然后用两个取液器进行以下操作，先吸取1.0ml已经 混匀的 15% 分离胶，加到玻璃板之间，再向 15% 分离 胶中加入 8% 的分离胶0.5ml ，充分混匀后，从中吸取 1.0ml加到玻璃板之间，如此反复操作上述步骤，
甘油、十二烷基硫酸 钠、考马斯亮蓝等。
试剂配制：
①麦谷蛋白提取液：4g SDS + 1g DTT + 250 ml 0.5M Tris-HCl (PH = 6.8)+ 20 ml甘油 + 30 mg溴酚蓝 + 蒸馏水定溶至 100 ml。
②10×电极缓冲液：Tris-HCI 30.3 g + 甘氨酸 144 g + SDS 10 g + 蒸馏水定溶至 1000ml。 ③30%丙烯酰胺：30 g + 蒸馏水定溶至 100ml。
直至距玻璃板上缘约 3cm 处时，向胶面上加一
层正丁醇，静置，直至分离胶凝固。倒置胶板，
流出正丁醇，用蒸馏水冲洗胶面，用滤纸吸尽
多余水。
按表1配制 5%浓缩胶，混匀后倒入玻璃板之
间，将梳子放置在玻璃板间，注意不要产生气
泡，静置至胶凝。待浓缩胶凝固后，垂直取出
梳子，加蒸馏水，甩出样品槽中的残胶。
2017/9/29 12
● 实验操作步骤
1、小麦谷蛋白提取程序
①取单粒小麦种子研磨成粉，转入离心管中，
加入适量的蛋白质提取液，在旋涡振荡器
上混合均匀；
②将离心管放入65℃水浴锅中水浴45min后取
出离心管放，室温冷却；
③将冷却后的离心管12000转/min离心30min， 保存于 4℃ 冰箱备用。
2 电泳程序
①封板：利用1%琼脂封板，以防玻璃板漏胶；