凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量
根据分子大小分离蛋白质的方法
根据分子大小分离蛋白质的方法蛋白质是生命体中非常重要的分子，它们在细胞的结构和功能中起着关键作用。
为了研究蛋白质的特性和功能，科学家们经常需要对蛋白质进行分离和纯化。
分离蛋白质的一个重要方法是根据蛋白质的分子大小进行分离。
本文将介绍几种常用的根据分子大小分离蛋白质的方法。
一、凝胶过滤层析法凝胶过滤层析法是一种基于分子大小的常用分离技术。
其原理是利用孔径大小不同的凝胶材料，将大分子蛋白质滞留在凝胶中，而小分子溶质可以顺利通过凝胶。
常用的凝胶材料有琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶等。
根据需要选择不同的凝胶孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术。
它利用电场作用将蛋白质分子按照大小进行分离。
在聚丙烯酰胺凝胶中，较大的蛋白质分子迁移速度较慢，而较小的蛋白质分子迁移速度较快。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
三、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的变性凝胶电泳方法。
尿素是一种强变性剂，可以使蛋白质分子解离成单体，并且具有较好的可溶性。
在尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白质分子的迁移速度主要取决于它们的电荷和分子大小。
通过调整电场强度和时间，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
四、尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱是一种利用固定相孔径大小进行分离的色谱技术。
在尺寸排阻色谱中，较大的蛋白质分子无法进入固定相孔径，因此会以较快的速度从色谱柱中洗脱，而较小的蛋白质分子则会在固定相中发生多次扩散，从而保留更长的时间。
通过调整固定相的孔径，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
五、离心过滤法离心过滤法是一种简便快速的蛋白质分离方法。
它利用离心力将大分子蛋白质沉淀在滤膜上，而小分子蛋白质则通过滤膜被洗脱出来。
通过选择不同孔径的滤膜，可以实现对不同分子大小的蛋白质进行分离。
根据分子大小分离蛋白质的方法有凝胶过滤层析法、聚丙烯酰胺凝胶电泳、尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳、尺寸排阻色谱和离心过滤法等。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量
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5.“SDS — 聚丙稀酰胺凝胶电 泳法测定蛋白质分子量”一实验的开 设达到了与国内同类院校相当的较高 水平。
对本科生的实验教学、本科生的 论文设计、研究生的高级生化实验等 方面都充实了内容。
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（二）特点：
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在 聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二 烷基磺酸钠）。
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蛋白质在一定浓度的含有强还原剂 的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物。
蛋白质丧失了原有的电荷状态形成 仅保持原有分子大小为特征的负离子团 块，降低或消除了各种蛋白质分子之间 天然的电荷差异，因此在进行电泳时，
电泳分类：移动界面电泳、区带电泳等。
区带电泳 是在半固相或胶状介质上加一个点或一薄 层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支 持介质中迁移。
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区带电泳使用不同的支持介质，有
滤纸、纤维素粉、聚氯乙烯树脂、淀 粉凝胶、琼脂凝胶、醋酸纤维素膜， 现在则多用聚丙烯酰胺（PAGE）和 琼脂糖凝胶。
球蛋白（去年完成的基金项目）
（三）纯化免疫球蛋白G DEAE-离子交换纤维素法纯化免疫球蛋白G子量（ 连续四个单项实验）。
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（1）制胶（简单叙述）（双层胶，摸索胶浓度）
A.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干, 准备2个干 净的锥形瓶。把玻璃板在灌胶支架上固定好。
开封后溶于200µl蒸馏水，置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。
。 样品1：称3mg样品1，加2 ml蒸馏水溶解
凝胶过滤法分离蛋白质
装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的界面时，需要重新装柱。
交联葡聚糖凝胶 (Sephadex G-25 )
血红蛋白+高铁氰化钾
高铁血红蛋白
样品处理 (3滴+8滴+2滴，已完成)
黄色(过量)
红褐色
交联葡聚糖凝胶 (Sephadex G-25 )
样品处理 (3滴+8滴+2滴已完成)
测定A425(+2ml蒸馏水，空白管)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
测定A425(+2ml蒸馏水，空白管)
凝胶——多孔凝胶颗粒(分子筛)：
上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱表面(1cm)、沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。
洗脱过程中要防止凝胶柱洗脱液流干(3cm)。
黄色(过量)
红褐色
凝胶过滤法的分子筛效应
样品处理 (3滴+8滴+2滴，已完成) 上样(开 关，加样，开) 洗脱完成后凝胶要回收，勿丢弃。
PBS (3cm)
柱床
PBS (1mm)
1.装柱后 及洗脱时
2.上样时
A425
MetHb K3Fe(CN)6
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管编号
洗脱图谱
注意事项
1. 装柱后要检查柱床是否均匀，若有气泡或分层的 界面时，需要重新装柱。
2. 上样时滴管末端一定要靠近凝胶柱表面(1cm)、 沿柱内壁缓缓滴加，不能冲击凝胶柱表面。样 品上柱后应在凝胶柱表面形成一层薄液层。
凝胶过滤法(分子筛层析/凝胶层析):
凝胶过滤法的分子筛效应
黄色(过量)
红褐色
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凝胶颗粒
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告引言：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，广泛应用于蛋白质纯化、分析和富集等领域。
本实验旨在通过凝胶过滤层析的方法，对混合蛋白样品进行分离和纯化，探究其原理和应用。
材料与方法：1. 凝胶过滤层析柱：选择合适的分子量截留范围，如10 kDa。
2. 混合蛋白样品：包含多种蛋白质，分子量范围从10 kDa到100 kDa。
3. 缓冲液：选择适当的缓冲液，如PBS。
4. 装载样品：将混合蛋白样品与缓冲液按比例混合，使其浓度适当。
实验步骤：1. 准备凝胶过滤层析柱：将柱子连接到系统中，并进行预洗，以去除残留物和杂质。
2. 样品装载：将装载样品注入凝胶过滤层析柱中，注意不要过载。
3. 层析过程：使用缓冲液进行层析，使样品在柱子中通过，并收集出流液。
4. 收集样品：根据需要，可以分别收集不同分子量范围的样品。
结果与讨论：通过凝胶过滤层析实验，我们成功分离并纯化了混合蛋白样品。
在层析过程中，不同分子量的蛋白质通过凝胶过滤层析柱时，会受到凝胶孔径的限制，从而分离出不同大小的蛋白质。
较大分子量的蛋白质无法通过凝胶孔径，会在柱中滞留，而较小分子量的蛋白质则能够通过凝胶孔径，从柱中流出。
通过收集不同分子量范围的样品，我们可以得到纯化后的蛋白质。
这些蛋白质可以进一步进行质谱分析、酶活性检测等实验，以获取更多关于蛋白质的信息。
凝胶过滤层析方法具有许多优点。
首先，它是一种快速、简单且高效的分离技术。
其次，凝胶过滤层析柱具有较高的容量和稳定性，可以处理大量样品。
此外，凝胶过滤层析适用于多种样品类型，包括细胞裂解液、培养基和体液等。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
首先，凝胶孔径的选择需要根据样品的分子量范围来确定，如果样品中存在分子量相近的蛋白质，则可能无法完全分离。
其次，凝胶过滤层析无法去除溶液中的小分子物质，如盐离子和小分子有机物，这些物质可能对后续实验产生影响。
结论：凝胶过滤层析是一种常用的生化分离技术，通过分子量选择性分离和纯化蛋白质。
实验十四 凝胶层析
4、上样与洗脱
(1）上样前先检查凝胶床面是否平整，如果倾斜不平整， 可用玻棒将床面轻轻搅动，让凝胶自然下降，形成水平状 态的胶面。用细长吸管小心吸去胶面上大部分溶液，然后 让液面自然下降，直至几乎露出床面。
(2）用移液管吸取蓝色葡聚糖溶液0.15ml,细胞色素C 0.4ml置1ml的小离心管中，混匀后，用长吸管将样品沿柱 子壁、非常小心地滴加到凝胶床面上，注意不要将床面凝 胶冲起。加完后，再打开底端出口，使样品流至床表面。 用少量洗脱液同样小心清洗表面1 次，然后将洗脱液在柱 内约加至5㎝高。实验十Biblioteka 凝胶层析法测定细胞色素 C的分子量
一、目的
1、了解凝胶过滤法测定蛋白质分子量的原理； 2、掌握运用该法测定生物大分子量的步骤； 3、懂得层析过程中的操作对分配系数确定的影
响。
二、原理
凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶， 对混合物中各组分按分子大小进行分离的层析技 术。把含有不同分子量的混合液，加在胶面上， 让它流过凝胶柱。当混合液通过凝胶颗粒缝隙中 时，溶液中的溶质凡是比筛孔小的分子，都能自 由进入颗粒内部，而比网孔大的分子则不能进入， 介于二者之间的分子量则部分地进入筛孔。因此， 在洗脱过程中，大分子物质在凝胶中的移动速度 快，先从层析柱中流出，小分子物质后流出（见 图十五 ），从而达到分离的目的。测定生物大分 子的分子量是凝胶层析法的重要用途之一。用于 分子量测定的凝胶有交联葡萄糖、琼脂糖和聚丙 烯酰胺凝胶等。
(3）连接储液瓶、层析柱、部分收集器，让洗脱液恒压 （30-50㎝水柱）洗脱，用部分收集器按每管3ml/7min收 集洗脱液，各管于650nm(蓝色色溶液)、410nm（红色溶 液）检测消光值（A）。
五、结果与分析
1、以管号（或洗脱液体积）为横坐标、相 应分子量的对数为纵坐标，绘制洗脱曲线。
sephadexg-75凝胶层析法分离蛋白质
Sephadex G-75 凝胶层析法分离蛋白质一.实验原理凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。
凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。
当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。
比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。
这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
二.试剂器材Sephadex G-75粉末洗脱液(10mmol/L Tris，10mmol/L NaCl，：取Tris 1.2114g和NaCl5.844g分别溶于适量的蒸馏水中，将两种溶液合并，用4mol/L的盐酸溶液调节pH值至，再用蒸馏水定容至1000mL；其他器材：18mm试管、层析柱、紫外分光光度计、分部收集器等三.操作步骤凝胶的制备：称取Sephadex G-75粉末20g，加双蒸水400ml浸泡，置于水浴锅中加热至100℃，保持温度3hr，冷却至室温抽真空30min以排除气泡，待其沉降后以倾泻法除去上层悬浮微粒；装柱：取洗净的内径18mm，长为490mm的层析柱，管底内部放置一层丝网，将层析柱垂直，关闭出水口，加入1/2柱体积的双蒸水，然后将己溶胀好的凝胶连续缓慢地从上口加入层析柱中，同时打开出水口，使凝胶自然沉降；平衡：凝胶床用洗脱液平衡过夜，约2个柱体积；加样：称取样品溶解于5mL的洗脱液中。
蛋白质分子量测定方法的比较
蛋白质分子量测定方法的比较梁永达（复旦大学药学院，上海）摘要：分子量是蛋白质主要的特征参数之一，近年来其测试方法发展十分迅速。
该文概述了目前蛋白质分子量测定中最常用的几种方法，包括粘度法、凝胶过滤层析法、凝胶渗透色谱法、SDS-凝胶电泳法、渗透压法、电喷雾离子化质谱技术、基质辅助激光解吸电离质谱技术、光散射法、超速离心沉降法，并比较了这几种方法的优缺点。
关键词：蛋白质分子量粘度法凝胶过滤层析法凝胶渗透色谱法SDS-凝胶电泳法渗透压法电喷雾离子化质谱技术基质辅助激光解吸电离质谱技术光散射法超速离心沉降法Comparison of the methods of molecular weightdetermination of proteinsLiangYongda(School of Pharmacy in Fudan University, Shanghai)Abstract: Molecular weight is one of the most important characteristic parameters of proteins，which leads the methods to determine protein molecular weight to develope rapidly in recent years. In this paper，the mechanism and application are briefly overviewed for the most widely used technologies including viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation. Plus, we compare these methods’advantages and disadvantages.Key words:molecular weight determination of proteins, viscosity method, gel filtration chromatography, gel permeation chromatography, SDS-gel electrophoresis, osmotic pressure method, electrospray ionization mass spectrometry, matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry, light scattering, ultracentrifugation sedimentation分子量是蛋白质的主要特征参数之一，当发现一种新的蛋白质时，首先应准确测定其分子量。
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量【实验原理】凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。
凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。
但这种“过筛”与普通的过筛不一样。
将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。
在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。
凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。
在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。
相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。
利用这种性质可分离不同M r的物质。
为了说明凝胶层析的原理，将凝胶装柱后，柱床体积称为“总体积”，以V t(total volume)表示。
实际上V t是由V O，V t与V g三部分组成，：V t=V O+V t+V gV o称为“孔隙体积”或“外体积”（outer volume）又称“外水体积”，即存在于柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相当于一般层析法中柱内流动相的体积；V i为内体积（inner volume），又称“内水体积”，即凝胶颗粒内部所含水相的体积，相当于一般层析法中的固定相的体积，它可从干凝胶颗粒重量和吸水后的重量求得；V g为凝胶本身的体积，因此V t-V o.等于V i+V g。
测定蛋白质分子量的常用方法
测定蛋白质分子量的常用方法测定蛋白质分子质量常用的方法有三种：沉降分析法、凝胶过滤法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
其基本原理如下：(1)沉降分析法：又叫超速离心法。
蛋白质溶液经高速离心分离时，在离心场的作用下蛋白质分子下沉，沉降速度与蛋白质颗粒大小成正比，应用光学方法观察离心过程中蛋白质颗粒的沉降行为，可判断出蛋白质的沉降速度。
根据沉降速度求出沉降系数(以s表示)，即单位离心场的沉降速度。
将沉降系数代入公式，即可计算出蛋白质的相对分子质量。
M=RTs/D(1-Vρ)式中：R——气体常数(8.314×107)；T——绝对温度；D——扩散系数；V——蛋白质分子的偏微比容(即无限大体积的溶液中加入1g蛋白质时溶液所增加的体积)；ρ——溶剂密度[20℃时每毫升的质量(g)]；s——沉降系数；M——蛋白质的相对分子质量。
(2)凝胶过滤法：又称分子筛层析法。
此法是在层析柱中装入葡聚糖(如Sephadex)凝胶，这种凝胶颗粒具有大量微孔，这些微孔只允许较小的分子进入，而大于胶粒微孔的分子则不能进入胶粒而被排阻。
当用洗脱液洗脱时，被排阻的分子量大的蛋白质先被洗脱下来，分子量小的后下来。
将已知分子量的标准蛋白质混合物上柱，洗脱，根据洗脱峰位置量出各种蛋白质的洗脱体积，然后用分子量的对数为横坐标，以洗脱体积为纵坐标，制作标准曲线。
测定时，根据紫外检测洗脱峰位置，量出待测样品的洗脱体积，由标准曲线可查出其分子质量。
(3)SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法：蛋白质在普通聚丙烯酰胺凝胶中的电泳速度取决于蛋白质分子大小、形状和所带的电荷。
而SDS(十二烷基硫酸钠)聚丙烯酰胺凝胶电泳与此不同。
SDS是一种阴离子去污剂，可使蛋白质变性并解离成亚基。
当蛋白质样品中加入SDS后，SDS与蛋白质分子结合，使蛋白质分子带上大量的负电荷，并且使蛋白质分子形状都变成长椭圆棒状，从而消除了蛋白质分子之间原有电荷和形状的差异。
这样电泳的速度只取决于蛋白质分子质量的大小。
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法
不同分子量蛋白质的分离—凝胶过滤层析法一、实验目的1. 了解凝胶柱层析的原理及应用。
2. 掌握凝胶柱层析的基本操作技术。
二、实验原理凝胶层析又称凝胶过滤，是一种按分子量大小分离物质的层析方法。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子不能进入凝胶颗粒中的静止相中，只留在凝胶颗粒之间的流动相中，因此以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶过滤柱层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav 值增大。
通常选用蓝色葡聚糖2000作为测定外水体积的物质。
该物质分子量大（为200万），呈蓝色，它在各种型号的葡聚糖凝胶中都被完全排阻，并可借助其本身颜色，采用肉眼或分光光度仪检测（210nm或260nm或620nm）洗脱体积（即Vo）。
但是，在测定激酶等蛋白质的分子量时，宜用蓝色葡聚糖2000测定外水体积，因为它对激酶有吸附作用，所以有时用巨球蛋白代替。
测定内水体积（Vi）的物质，可选用硫酸铵、N-乙酰酪氨酸乙酯，或者其它与凝胶无吸附力的小分子物质。
本实验使用血红蛋白（分子量64,500左右）和二硝基氟苯－鱼精蛋白（DNP－鱼精蛋白分子量12,000左右）的混合物，通过Sephadex G－25层析后达到分离。
Rubisco的层析分离和电泳离心
一、实验目的：了解凝胶过滤层析法和SDS-PAGE垂直板型电泳法的基本原理及操作技术。
学习并掌握SDS－PAGE法测定蛋白质相对分子量的技术。
二、实验原理：凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。
层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析。
一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。
小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
SDS-PAGE电泳法，即十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳法，。
1．在蛋白质混合样品中各蛋白质组分的迁移率主要取决于分子大小和形状以及所带电荷多少。
2．在聚丙烯酰胺凝胶系统中，加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），SDS是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，使各种蛋白质—SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
此时，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而其它因素对电泳迁移率的影响几乎可以忽略不计。
3. 当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bmR 式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。
在条件一定时，b 和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。
未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
三、实验步骤：总体流程：小麦幼苗叶片PBS提取离心粗酶液35%-55%（NH4）2SO4PBS溶解1ml (NH4)2SO4样品（每组1个）Sephadex G-25 脱盐脱盐样品 SDS-PAGE染色脱色计算Rubisco的大亚基、小亚基分子量详细流程：1）平衡：20ml: 10*洗脱液. 清洗胶柱。
凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理
凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理以《凝胶过滤层析方法检测蛋白质分子量的原理》为标题，写一篇3000字的中文文章凝胶过滤层析是一种常见的分子分析方法，用于测量物质分子量。
常用于检测蛋白质分子量。
凝胶过滤层析方法有助于化学和生物分子之间的相互作用以及研究分子大小的变化。
本文将阐述凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理。
凝胶过滤层析是一种基于密度的分子分析方法。
该方法将样品加入非常浓缩的凝胶层，并在低压下过滤。
较小的分子可以通过凝胶而更大的分子则被滤波。
根据滤失的部分，可以推测出样品中分子的大小。
该方法最重要的特点是它可以检测出均一分子的情况，而其他分子的尺寸分析方法则无法实现此目的。
凝胶过滤层析可以用来测量蛋白质分子量。
在该实验中，研究者使用难溶性的聚苯乙烯凝胶，在某种pH和温度的环境中，将蛋白质进行溶解和混合，然后将它们加入凝胶层，并且在低压下进行过滤。
从最终收集的滤失液中检测到溶解物的体积，然后根据滤失液的量来推算出蛋白质分子量。
凝胶过滤层析可以制备多种蛋白质，包括低分子量的蛋白质和高分子量的蛋白质。
在此方法中，凝胶的分子比例（DC）可以用来确定受试蛋白质的种类，例如低DC的混合物可能包含低分子量的蛋白质。
此外，还可以利用凝胶过滤层析方法找出蛋白质的变性情况，从而识别蛋白质间的结构变化。
凝胶过滤层析方法有许多优点。
它可以检测出多种蛋白质，是一种高灵敏度的技术。
此外，它不依赖于某个特定的化学反应，可以快速，灵敏地检测各种蛋白质的分子量。
另外，凝胶过滤层析方法也可以用来检测各种其他复杂的分子，包括糖，多肽，抗体和小分子化合物，以及多种大分子组装体。
凝胶过滤层析是一种实用的研究和应用分子大小的方法，它可以用来快速检测出蛋白质和其他分子的分子量。
该方法为研究蛋白质的种类和变性提供了一种有效手段。
本文详细论述了凝胶过滤层析检测蛋白质分子量的原理，以及这种方法的优点和缺点。
凝胶过滤层析是一项日益重要的分析方法，可以帮助研究者更好地了解蛋白质的构造和作用，以及蛋白质分子量的变化。
凝胶过滤层析实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。
2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。
3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。
该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。
2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。
4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。
5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。
2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。
- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。
蛋白质分子量测定
蛋白质分子量测定方法目前，蛋白质分子量测定的常用方法主要有四种：年度法、凝胶过滤层析法、凝胶电泳法和凝胶渗透色谱(GPC)法。
一、粘度法一定温度条件下，高聚物稀溶液的粘度与其分子量之间呈正相关性，随着分子量的增大，聚合物溶液的粘度增大。
通过测定高聚物稀溶液粘度随浓度的变化，即可计算出其平均分子量(粘均分子量)。
该方法操作简单、设备价格较低，通常不需要标准样品，但无法测定聚合物的分子量分布。
粘度法所需设备：恒温槽、乌倍路德粘度计。
二、凝胶过滤层析法在凝胶色谱柱中，分子量不同的聚合物分子，由于其渗入凝胶微孔的能力不同而在柱中得以分离。
分子量较大的分子，渗入凝胶微孔较浅，随洗脱液流动速度较快，因而先流出色谱柱；相反，分子量较小的聚合物分子后流出。
通过测定从进样到聚合物分子流出色谱柱期间流过凝胶柱的洗脱液的体积，并与标准样品比较，即可计算聚合物的分子量，并估算其分子量分布。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可，目前已得到相当广泛的应用。
凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6—8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。
糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要大，铁蛋白则与此相反，测得的分子量比真实的要小。
凝胶过滤层析法所需设备：层析柱、紫外分光光度计。
三、SDS-凝胶电泳法SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1.4gSDS/1g蛋白质），使各种蛋白质-SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而使其电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。
SDS-凝胶电泳法是目前蛋白质分子量测定中使用最广泛的方法，实验成本较低，仪器设备也相对很简单，一套电泳装置即可。
凝胶过滤法分离蛋白质实验报告
凝胶过滤法分离蛋白质一、实验目的了解凝胶层析的基本原理，并学会用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二、实验原理凝胶过滤其基本原理是利用被分离的分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点：本实验使用交联葡聚凝胶，其具有一定孔径的网络结构。
高亲水，在水溶液里吸水可膨胀。
当其填充完成后，加入混合分子大小不同的分离液。
由于大分子物质只能沿着胶粒之间的间隙向下流动，所经路短，最先流出；而涌入胶粒内部的小分子物质，受迷宫效应的影响，要经过层层扩散向下流动，所经路程长，最后流出，通透性居中的分子则后于大分子而先于小分子流出。
从而按大到小的顺序流出实现分离的目的。
三、试剂与仪器0.1mol/L磷酸缓冲液（PH7.0），0.4%K3Fe(CN)6,交联葡聚凝胶，鸡的抗凝全血1.5*20cm的层析柱，试管，量筒，大烧杯，玻璃棒四、实验步骤1.凝胶溶胀2.装柱：从层析柱加入缓冲液，打开出口，将气泡赶走，关闭下端开口，然后加入约6cm的缓冲液，灌注凝胶，打开下端开口。
使其自然沉降高度约17cm，并使其床面覆盖缓冲液，关闭出口盖上小形圆形滤纸。
待凝胶形成后，再用缓冲液洗脱2~3次。
3.样品处理4.上样和过滤：吸取约0.5ml混合液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻加入样品。
打开出口，让样品溶液慢慢浸入凝胶内。
凝胶柱面加上一层磷酸盐缓冲液，并用1~2倍体积的此缓冲洗脱。
5.部分收集：控制速度为0.5ml/min左右，用试管收集洗脱液。
并观察柱上的色带，待黄色的0.4%完全脱下来后，再继续收集两管透明洗脱液作对照，关闭出口。
6.凝胶回收：收集样品后，凝胶柱用3~5倍体积洗脱液继续洗脱，从回收凝胶留给下一组。
五、实验现象结果及其讨论颜色：开始时为无色透明，但时间过去，试管中收集的红褐色开始变深，到最后，试管的颜色为深褐色，接着溶液的颜色开始变浅，红褐色几乎要消失。
接着又开始出现浅黄色，再到黄色，再黄色开始慢慢变浅，最后又变成无色透明。
原因：1.开始时，由于先加进缓冲液，而加入的全血扩散没有那么快，所以白色透明液体为缓冲液。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作①凝胶介质的选择根据待分离蛋白质的分子量，选择具有相应分离范围的凝胶。
对于未知蛋白质，应选择更宽的凝胶，如sephacryls-300。
对于分子量为3~5kda的蛋白质，应选择SephadexG50或G25进行脱盐；对于低分子量多肽物质（1~5kda），应选择Sephadex G10或Sephadex G15进行脱盐。
②凝胶介质的处理和装柱商业明胶通常是干粉，在使用前用水膨胀。
一般来说，1份明胶加10份水会自然膨胀至少24小时。
膨胀后，从上清液中取出小凝胶，丢弃并再次搅拌。
凝胶沉淀后，再次丢弃凝胶碎片，重复几次，直到液相被清除。
为了加速膨胀，可以将凝胶煮沸一小时，这种方法同时具有杀菌效果。
凝胶过滤层析柱的长与直径的比例应为50~100:1。
装柱时柱体要垂直，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液，然后沿柱一侧将缓冲液中的凝胶（凝胶：缓冲液=3：1）搅拌均匀，缓慢并连续地一次性注入柱内。
装柱过程中，要避免柱内缓冲液流干，注意保持柱体凝胶均匀无气泡和裂缝。
装完后，可用2ml蓝色葡聚糖溶液检查柱体的均匀性。
如柱体均匀，可见蓝色区带均匀平稳地通过凝胶，不留任何条纹。
要保持凝胶和缓冲液温度一致，以减少气泡的产生。
③上样凝胶过滤柱色谱法对样品的体积有严格的要求。
样品体积不得超过柱床体积的1~5%。
如果超过5%，分离效率将降低。
如果低于1%，则分离效率不会提高。
因此，蛋白质样品应尽可能浓缩至10~20mg/ml。
样品本身与洗脱液的相对粘度不得超过2。
如果样品粘度过高，色谱区会不稳定，或流速不规则，色谱区会变宽或扭曲。
加载前样品应通过0.2μm？用孔径滤膜过滤或用10000g离心机离心5min，以去除残留物。
添加样品时，避免损坏色谱柱表面，并保持其表面均匀平整。
④ 洗脱洗脱液应保持一定的离子强度以消除凝胶中含有的游离羧基和硫酸根等与蛋白质的结合作用。
sephadex和sepharosecl凝胶层析所用的洗脱液的离子强度至少应为0.02mol/l；sephacryl凝胶应为0.05mol/l。
凝胶过滤层析实验报告
凝胶过滤层析实验报告凝胶过滤层析实验报告一、引言凝胶过滤层析是一种常用的生物分离和纯化技术，广泛应用于生物医学研究、生物制药等领域。
本实验旨在通过对凝胶过滤层析的研究，探讨其原理、方法和应用。
二、凝胶过滤层析原理凝胶过滤层析是利用凝胶材料的孔隙结构，通过分子的大小和形状选择性地分离混合物中的组分。
凝胶材料通常是多孔的，具有不同大小的孔隙，通过调整凝胶材料的孔隙大小，可以选择性地分离分子。
三、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶材料装入柱中，并将柱与收集容器连接。
2. 样品处理：将待分离的混合物样品处理，去除杂质和大分子。
3. 样品加载：将处理后的样品加载到凝胶柱上。
4. 洗脱：用缓冲液洗脱凝胶柱上的目标分子。
5. 收集：将洗脱液收集于容器中，得到纯化后的目标分子。
四、实验结果与讨论本实验使用了凝胶过滤层析技术对蛋白质混合物进行分离和纯化。
实验结果显示，凝胶过滤层析能够有效地分离目标蛋白质，并具有较高的纯度。
在实验过程中，我们发现凝胶材料的孔隙大小对分离效果有重要影响。
较大的孔隙可以让较大分子通过，而较小的孔隙则只允许较小分子通过。
因此，在选择凝胶材料时，需要根据目标分子的大小来选择合适的凝胶。
此外，凝胶过滤层析还可以用于去除杂质和浓缩目标分子。
在洗脱过程中，通过调整洗脱缓冲液的成分和pH值，可以更好地控制目标分子的洗脱效果。
凝胶过滤层析技术的应用非常广泛。
在生物医学研究中，它常用于蛋白质纯化和分析，可以帮助研究人员获取纯度较高的蛋白质样品，从而进行后续的功能研究。
在生物制药领域，凝胶过滤层析可以用于制备药物和疫苗，提高产品纯度和质量。
然而，凝胶过滤层析也存在一些局限性。
例如，对于较大的分子，凝胶材料的孔隙可能不够大，导致无法通过。
此外，凝胶过滤层析的操作相对较慢，需要较长的时间来完成分离和纯化过程。
综上所述，凝胶过滤层析是一种有效的生物分离和纯化技术，具有广泛的应用前景。
通过对凝胶过滤层析的实验研究，我们深入了解了其原理、方法和应用，并对其优缺点有了更清晰的认识。
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【目的要求】
掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 的实验技能
【原理】
凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具 有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离的技术。
相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。
Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积
（Vo）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关。
Vo 和Vt可以通过测定得到，测定了某个组分的Ve 就可以 得到这个组分的分配系数。在一定的条件下，Vt和Vo都是恒
定值。
大分子先从柱中流出→Ve值小→Kav值小 小分子后从柱中流出→Ve值大→Kav值大
2）凝胶柱床总体积（Vt）的测定：在距柱上端约5
㎝处作一记号，关闭柱出水口，加入蒸馏水，打开出水 口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收
柱中蒸馏水，读出的体积即为柱床总体积Vt 。
3）向柱内加入约1/4柱体积的洗脱液，将浓浆状 的凝胶缓慢地倾入柱中，使之自然沉降，凝胶沉降 约2～3㎝高度后打开出水口，待胶面上升到柱记 号处时则装柱完毕。然后关闭出水口，静置片刻， 等完全沉降，将接接口的乳胶管与盛有洗脱液的储 液瓶连接，调流速3～6mL/10min，用 2～3倍柱 床体积的洗脱液平衡。
六、实验结果与分析
实验结果填入表中
样品
Mr 1gMr Ｖe Ｖ０ Vt Kav
牛血清蛋白 67，000 4.8261
鸡卵清蛋白 45，000 4.6532
溶菌酶
14，300 4.146
待测鸡卵粘 蛋白样品
结果分析
绘制蓝色葡聚糖洗脱曲线 绘制标准蛋白质洗脱曲线 绘制鸡卵粘蛋白样品洗脱曲线
绘制lgMr-Kav标准曲线,确定待测样品鸡卵粘蛋白
4）以Kav值为横坐标，标准蛋白质lgMr为纵坐标，绘出
标准曲线。
五、未知样品蛋白质分子量的测定
将待测待测鸡卵粘蛋白样品配制成5mg/mL溶 液,以下步骤完全按照标准曲线的条件操作。根据
紫外检测的洗脱峰位置，量出洗脱体积Ve ，代入 公式计算待测蛋白的Kav值，然后在标准曲线上查 得lgMr，其反对数便是未知样品的相对分子质量。
脱峰，测出洗脱体积Ve ，得出Vo值。
四、标准曲线的制作
1）用洗脱液配制标准蛋白质溶液（牛血清蛋白、鸡卵清蛋 白、溶菌酶）。
2）按上述方法加入1mL标准蛋白质混合液，以 3mL/10min 的速度洗脱并收集洗脱液体积。
3）分别收集各标准蛋白质的洗脱峰（灵敏度0.2A），测
量它们的洗脱体积Ve。代入公式计算出各标准蛋白质 的Kav值。
由于Ve 和Kav也成线性关系所以同样有： Ve ＝ －b’lgMr+c’
通过将一些已知分子质量的标准蛋白质在同一
凝胶柱上以相同条件进行洗脱，分别测定Ve 或 Kav，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然 后在相同条件下测定未知样品的Ve 或Kav，通过
标准曲线即可求出其分子质量。
吸水率和床体积
【应用】
生物大分子的纯化 分子量测定 脱盐及去除小分子杂质 去热源物质 溶液的浓缩
【操作方法】
一、凝胶的选择和处理
量取110mL Sephadex G-75于250 mL烧杯中， 加入洗脱液100mL，在沸水浴中煮沸1h，冷却至室温 后抽真空脱去颗粒空隙中的空气。
二、装柱
1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。
吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量，但它不包 括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 Sephadex G-25～200 数字是吸水率×10 例如Sephadex G-75 吸水率 7.5±ml/g 床体积指1g干的凝胶吸收水后的最终体积 例如Sephadex G-75 床体积 12～15 ml/g 干胶用量(g) = 柱(ml)床体积/凝胶床体积(ml/g)
相对分子质量.
谢谢同学们
即 Ve＝Vo＋Vi
推出 Vi＝ Ve －Vo
柱床体积（Vt）：
1)可用下式计算： Vt＝π×（D/2）2×h
2）根据 Vt＝Vo＋Vi 可以得到
3）加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的 体积。
分配系数 表示某个组分在内水体积和在外水体积中的浓度
分配关系。
Kav
＝
Ve －
VVot －Vo
的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现时
所流出的体积。 Ve一般是介于Vo 和Vt之间的。
对于完全排阻的大分子由于其不
对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，
故其洗脱体积 Ve ＝ Vt
分子量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之 间。
相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。
中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二 者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。 这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
◎
图3 -1 凝胶层析分离原理示意图
【基本概念】
外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积
外水体积（Vo）是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积内 水体积（Vi）是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是 （Vt）凝胶柱所能容纳的总体积。
【基本概念】
洗脱体积（Ve）是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液
对于完全排阻的大分子 Ve ＝ Vo 故 Kav ＝ 0
对于完全渗透的小分子 Ve ＝ Vt 故 Kav ＝ 1
Kav是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋
白质分子质量的一个依据。 对于某一型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，各个
组分的Kav与其分子质量的对数成线性关系：
Kav ＝ －blgMr+c
图3 -3 凝胶层析柱洗脱曲线示意图
Ⅰ 完全排阻的大分子 Ⅱ 中等分子
Ⅲ 完全渗透的小分子
洗脱体积的测定
外水体积（Vo）：可以通过测定完全排阻的大分子物质
的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定
外水体积的物质。
内水体积（Vi）：可以通过测定完全渗透的小分子溶质
（如重铬酸钾）的洗脱体积来测定
三、Vo 的测定
打开柱上端的塞子，待柱内洗脱液下降至与凝
胶胶面相切时，关闭出水口。用细滴管吸取1 mL 蓝色葡聚糖-2000液，小心地绕柱壁一圈（距胶面 2mm）缓慢加入，打开出水口（开始收集），待 溶液完全渗入柱床后，关闭出水口，取1mL洗脱 液沿管壁洗柱一次，等溶液完全渗入柱床，柱上端 再加入几毫升洗脱液，将柱上端接口与储液瓶连接， 打开出水口，开始洗脱。收集蓝色葡聚糖-2000洗