滴度检测方法

慢病毒滴度检测方法

空斑测定法

空斑法测定滴度的主要原理是病毒感染QBI-293A细胞后，通过一个感染周期便可再感染邻近细胞，直至形成一个成熟的空斑。这是所有生物学方法测定病毒滴度中最具挑战性的方法。由于许多因素如单层细胞质量、操作和观察方法等都可影响到最后的结果，因此这一方法得到的结果往往最不稳定。

1．5×105细胞/60mm培养皿用5ml DMEM5%培养，3-4小时后等细胞贴壁即可进行病毒感染。或者在病毒感染前一天加入3×105细胞/60mm培养皿。

2．在12孔板中稀释病毒，储存于-20℃或-80℃备用。第1个稀释孔将病毒保存液稀释至1ml，其它孔稀释至3ml，大体积可提高可重复性。稀释浓度原则视病毒浓度而定（纯化还是未纯化的），调节稀释度至10-100个病毒/孔，一般为10-12，这样稀释比大约为10-7~10-12。

稀释：将100ul病毒保存液加入900ul DMEM5%。用移液器上下吸打5次，此时稀释度为10-1。换用新枪头将300ul 10-1稀释液加入2.7ml DMEM5%吸打5次，稀释度为10-2。然后分别取300ul前一稀释液加入2.7ml DMEM5%，形成一系列稀释度，最后4个稀释度用于感染细胞。

注意：每次稀释时都必须换用新枪头。

3．吸去细胞培养液，每个培养皿中加入1ml病毒稀释液和1ml DMEM5%，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养90分钟。

4．吸去培养液，按5.2.2中所述加入1.25%琼脂糖培养基。

5．37℃培养,经常注意是否有空斑形成和是否需要加入新鲜培养基。21天后应该可以看到空斑形成的白色小斑点。

结果:计数有多少个独立的空斑形成，将此数目乘以稀释度即可得到每毫升产生的空斑形成单位(PFU/ml)。

50%组织培养感染剂量法

此方法基于最高稀释度下在QBI-293A细胞中CPE的形成，它是昆腾公司用于测定滴度的标准方法。

细胞准备：

1．收集一瓶QBI-293A细胞，计数。

2．用DMEM 2%准备20ml 105/ml细胞。

3．用12道排枪在2块96孔板中每孔加入100ul细胞悬液。

5.8.3.2 准备稀释病毒液

1．第1管中加入0.9ml DMEM 2%，其余加入1.8ml。第1管中再加入0.1ml病毒保存液。

2．上下吸打5次混匀。

3．换用新枪头。

4．从第1管中吸取0.2ml加入第2管中。

5．反复稀释至最高稀释度。

6．用同一管病毒保存液进行第2轮稀释。

7．最后8个稀释液加入96孔板，每孔0.1ml，每个稀释度10孔，2孔为阴性对照。阴性对照孔中加入0.1ml DMEM 2%监测细胞存活情况。加样时从最高稀释度开始。

8．37℃培养10天。

9．10天后倒置显微镜下观察，计算每一排中出现CPE的孔数。只要有一小点或是一些细胞出现CPE即为阳性，如果无法确定，可与阴性对照比较。

10．计算每一排中出现阳性的孔数。

如果阴性对照中无任何CPE且细胞生长良好，最低稀释度100%阳性而最高稀释度100%阴性，则本测试即为有效。