HPLC柱前衍生和柱后衍生

HPLC柱前衍生和柱后衍生

1、为什么要衍生？

衍生化最为主要的目的就是提高目的物的可检测性。对于GC来讲，多数是为了增强目的物挥发性或者改善目的物极性；对于HPLC来讲多数是为了提高检测器对目的物的相应。

2、衍生化分类：柱前衍生和柱后衍生。柱前衍生是在经过分析柱前使分析物与衍生剂反应，反应产物在分析柱上实现分离，实际分离的是衍生产物，检测的也是衍生产物；柱后衍生是分离物在分析柱中实现分离后，在衍生池内与衍生剂反应，在柱子中分离的是目的物，在检测器处检测的衍生产物。

3、适用的化合物：生物酸/碱、胺类、抗生素（聚醚类抗生素多见）和氨基酸类。

4、衍生化要求？

1）衍生剂必须过量且稳定；不过量反应不完全，检测不充分。不稳定，重现性差。

2）衍生物、衍生产物和衍生副产物至少是好分离的。当然如果只能检测到衍生产物最好。3）衍生反快速完全。反应慢，柱前衍生还可以，但柱后不行。因为流速固定，衍生池管路长度一定，留给衍生化的时间是一定的。柱前衍生可以在系统外等衍生完毕后进样，但也是影响效率的。

5、两种衍生比较

柱前衍生优点是，对设备要求不高，可以手工衍生，而且对衍生时间要求相对宽泛。缺点是，引入了过多的物质，如：衍生剂、衍生产物（当然这个是检测需要的）和衍生副产物，对柱子有潜在的负面影响，另如采用手工衍生也会引入过多的认为因素。

柱后衍生优点是，重现性好，认为因素少，引入物质比较少。缺点是，可能有扩散问题，在柱子中分离结束后，就存在扩散，如果衍生慢（必然流速低）、管路长扩散问题就会比较严重，再有就是要求有一套外源的泵系统和一个检测池，对于设备要求较高。

仪器管路的清洗

Agilent的液相，反相柱，想用异丙醇清洗下系统.用纯异丙醇,流速一般在0.2~0.4ml/min

先用甲醇-水，甲醇洗，再用异丙醇洗，流速低一点，根据你的压力决定，不要超过平时使用压力就可以了,洗完了，再用甲醇洗

把流通池拿掉，看基线，基本可以确定，问题在哪个方向，如果基线稳定，那就是流通池或者流动相或者泵什么的问题了.再有，检测器光路透镜老化什么的也会有这个情况，光电倍增管是否老化等

基线走不平一般是1.流动相脏，2.灯能量不够（流通池），3.系统有气泡，4.泵压力不稳。5.系统有杂质等。

10%异丙醇作用

冲洗泵头的，防止含盐流动相中的盐分结晶损毁宝石杆

开机就要用，控制一定的流速，不能太快也不能太慢

带缓冲盐的流动相一定要用,每分钟2-3滴的速度，虹吸，保持泵的宝石杆湿润，起保护作用的

安捷伦1200，灯使用时间大概半年，今晚把紫外灯关闭后冲洗柱子，两小时候开灯老显示紫外灯打开失败。怎么回事啊？

1.如果只是关2小时的话实际上就是浪费灯能量了

关一次一般就是8小时的能量损失

灯点不亮的话可以等它冷了再试试

2.关机后重新打开电源，冬天来了，温度低氘灯容易点不着

6*SD下面的值就是噪声的峰高

基线不稳的原因分析

1.在梯度或等梯度洗脱过程，流动相混合不充分会导致基线的周期性波动。在梯度洗脱过程中，当改性剂只加入到水相，或者流动相组分的紫外吸收显著失衡时，混合不充分则更加重了基线的漂移。在第二流动相中添加足够的改性剂以消除吸收率的差别。请注意，同样用量的改性剂在水溶液中和有机相中的吸收率可能不同。一个很好的例子是三氟乙酸（TFA），其在水相中的紫外光谱与乙腈中的不同。乙腈中三氟乙酸（TFA）的用量是水相的85%

2.流动相被污染也可能导致基线的问题，所以应该使用新配制的流动相。如果您使用缓冲盐或添加剂，只能使用液相色谱级的，并经常更换的流动相。倒掉常温下存放超过2天的任何流动相，尤其是那些有利于微生物生长的近中性pH值的流动相。

3.导致基线噪音或漂移的另一个可能的原因是由于色谱柱和流通池之间温差导致折射率的变化。如果色谱柱温度高于环境20℃以上，可以考虑使用第二个热交换器，以降低色谱柱出口流动相与流通池之间温度差。请注意，全新的Agilent 1290 Infinity液相色谱系统的检测器采用的设计极大地减少了折射率的影响，因此将色谱柱和流通池温差对基线的影响降至最小

4.流通池的机械问题是基线异常的常见原因。要检查流通池，可从色谱仪中将其取出，并检查窗口表面是否有灰尘、裂缝或泄漏。用手电照窗口以协助观察。用水冲洗流通池的外部，然后用甲醇冲洗，去除可能存在的缓冲盐、灰尘或模糊沉积物。使用无绒的镜头纸将流通池擦干，或使用压缩空气将流通池吹干。如果流通池窗口出现破裂或泄漏，您可以使用厂商提供的备件重新组装紫外流通池。

清洗流通池内部，重新安装好后，以低流速启动液相泵，并从反方向给光，观察每一个窗口，检查是否有碎片或气泡。先用水冲洗流通池，其次是用甲醇，以消除这些干扰物。