亲和层析
5. 亲和层析
加入过量的小分子伯氨基试剂封闭多余的活化基团
封闭的试剂有乙醇胺、葡萄糖胺、甘氨酸、谷氨酸、甘露 糖等。
①配基偶联量 (μmol／g 或μmol／ml)。
②样品吸附量 (mg／s或mg／ml)。
③化学稳定性 ④耐酸碱 抗氧化物，配基不降解。
如pH3～10。
1. 亲和层析实验流程 2. 吸附条件的选择
①竞争性洗脱
②离子强度洗脱 ③pH+离子强度洗脱 ④变性剂洗脱 ⑤化学断裂
①一步洗脱：非选择性洗脱。 ②分步洗脱：选择性洗脱。 ③梯度洗脱：选择性洗脱， 洗脱液浓度梯度变化
①0.5-1.0 mol／L NaCl中性盐处理，除去离子性
较强的杂质。
②异丙醇处理，除去疏水性较强的杂质。 ③6 mol／L 脲处理，除去中性分子杂质。 ④6mol／L 盐酸胍处理，除去中性分子杂质。
3. 洗脱条件的选择
4. 洗脱方式 5. 亲和介质的处理
6. 亲和层析介质的保存
1. 亲和层析实验流程
装柱、平衡与上样品 亲和层析 介质
洗去 未吸附杂质
预处理
洗脱 收集洗脱峰
层析柱：吸附容量、待分离物质的总量 平衡缓冲液：pH和pI、上样体积、温度和流速等 因素
多次吸附，使纯化对象与配基充分作用
第5章 亲和层析
一、亲和层析的特点
第7章亲和层析
结合能力的测定
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用溴化氰活化载体
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四、特异性吸附
欲分离物质与亲和吸附剂结合，当结合力较强时， 配体与有效成分紧密结合，随着样品的加入，亲 和成分恒定增加并不断地吸附上柱，形成致密的 复合物带，使吸附容量增至最大，达到饱和。影 响吸附容量除亲和力外和还与pH、离子强度有关。
物大分子之间的亲和力。
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专一性结合的生物体系
常用配体
分离对象
酶蛋白
基质类似物、抑制剂、辅酶、底物、产物等
抗体
抗原、病毒、细胞
外源凝集素 核酸 激素及维生素
多糖、糖蛋白、细胞表面受体、结合蛋白
互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶、结合 蛋白 受体、载体蛋白
细胞
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利用生物大分 子和固定相表面 存在某种特异性 吸附而进行选择 性分离的一种生 物大分子分离的 层析方法。
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亲和层析法的实质
是在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一 般反应性能的间隔臂，随后再连接配体（酶、抗原、激 素等）组成固定相, 配体高选择地吸附与其有生物特性 的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析 柱，保留在柱上的分子将以纯品形态洗脱下来。
亲和层析应用
一、纯化特异性生物分子
1.纯化抗原、抗体及其结合物； 2.分离糖蛋白、各种凝集素； 3.含巯基蛋白质的分离； 4.用寡聚核苷酸分离核酸； 5.凝集素配体结合膜蛋白的分离技术。
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第七章 亲和层析
亲和作用与pH、盐浓度等有关，多数仅靠改变这 些条件即可取得理想的效果。 3. 亲和力较强时： ①竞争性洗脱剂（专一性洗脱剂）：用相同的配体或 配体的类似物，能有效地与固定到基质上的配体竞争 目标蛋白，得到尖锐的洗脱峰。 ②蛋白质变性剂：洗脱液中添加盐酸胍、尿素等变性 剂使蛋白质洗脱，但注意需适当处理才能恢复活性。
4.保持基质多孔结的稳定：
耦联配体后，多孔性降低。尤其是聚丙烯酰胺凝胶， 而琼脂糖凝胶的孔稳定性好，所以亲和层析多用琼 脂糖为基质。
5. 样品浓度、pH、离子强度及加样速度等。
五、用途
可用于提纯蛋白质、核酸、激素，分离微 量、不稳定物质最为 理想。 六、不足 配基不易得到，亲和吸附剂制备复杂。
（四）特异性吸附
要求一定的pH和离子强度，以使吸附量最大。
（五）洗脱
先用大量的平衡液洗去无亲和力的杂蛋白，让柱子 上留下专一性吸附的大分子物质，再进行洗脱专一性大 分子物质。 依情况不同，采用不同的洗脱方法： 1. 亲和力较小时，可连续用大体积平衡液洗脱，而后 得到的洗脱峰为大分子物质。
2. 亲和力一般时：需改变缓冲溶液的性质，使复合物 之间的亲和力下降，以便分离。
（二）配体的选择
配体——是具有特异性识别能力的物质。选择时应 根据所分离物质来选。优良的配体应具备的两个条件： ①有较强的亲和性和特异性；②有与载体共价结合的 基团和稳定性 （三）亲和吸附剂的制备： ①基质的活化：通过化学反应使基质上的化学基团处 于活化状态，称为活化。较多的使用CNBr法，能活化 羟基。 ②偶联 ：活化的基质与配体在一定条件下结合形成固 相载体的过程。
（六）层析柱的清洗和再生： 用大量的洗脱液或高浓度的盐彻底洗柱子，再 用平衡缓冲液平衡柱子，即可再使用。 四、提高吸附剂的操作容量的方法： 1. 在配体和基质之间引入“手臂”：对于小 分子的配体，为了减少空间位阻，在基质 与配体之间可插入若干碳原子链称为“手 臂”。 2. 增加配体量。
第7章 亲和层析
二、配体的选择
理想的配体应具有以下一些性质： 1) 配体与待分离的物质有适当的亲和力。亲和力太弱，待分 离物质不易与配体结合，造成亲和层析吸附效率很低。而且 吸附洗脱过程中易受非特异性吸附的影响，引起分辨率下降。 但如果亲和力太强，待分离物质很难与配体分离，这又会造 成洗脱的困难。总之，配体和待分离物质的亲和力过弱或过 强都不利于亲和层析的分离。应根据实验要求尽量选择与待 分离物质具有适当的亲和力的配体。
4) 配体自身应具有较好的稳定性，在实验中能够 耐受偶联以及洗脱时可能的的较剧烈的条件，可以 多次重复使用。
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将其分为 两类：特异性配体（specific ligand）和通用性配体 （general ligand）。 特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋白质等生 物大分子结合的配体。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶 和它的抑制剂、激素－受体等，它们结合都具有很高的特异 性，用这些物质作为配体都属于特异性配体。配体的特异性 是保证亲和层析高分辨率的重要因素，但寻找特异性配体一 般是比较困难的，尤其对于一些性质不很了解的生物大分子， 要找到合适的特异性配体通常需要大量的实验。
例如胰蛋白酶的天然蛋白质类抑制剂有胰脏蛋白酶 抑制剂（pancreatic trypsin inhibitor，PTI），卵粘蛋白 （ovomucoid）和大豆胰蛋白酶抑制剂（soybean trypsin inhibitor，STI）等，小分子抑制剂有苄脒 （benzamidine）、精氨酸和赖氨酸。这些抑制剂均可作 为亲和纯化胰蛋白酶的配基，但与酶的结合常数各不相同。 例如，STI与胰蛋白酶的结合常数达109L/mol以上，而对 氨基苄脒（p-aminobenzamidine）与胰蛋白酶的结合数约 为4×104L/mol（25℃）。
亲和层析
3、含有辅酶的酶类的亲和层析； 4、酶和蛋白类型抑制剂的亲和层析；
5、肝素为配体的亲和层析；
6、染料配体亲和层析； 7、金属螯合层析；
例如：凝集素和糖蛋白的亲和层析—凝集素是在自然界广泛存在的一大类糖结合
蛋白。它们具有不同的糖结合专一性。利用天然存在的一些多糖和被固定化的不
蛋白质亲和层析中的合适配体
配体 抗原 待纯化的蛋白质 特定单克隆抗体或多克 隆抗体 配体 肝素 待纯化的蛋白质 凝聚因子、脂酶、结缔组 织蛋白酶、DNA聚合酶
单克隆抗体 蛋白质A、 蛋白质G
蛋白酶抑制 剂 磷酸
特定抗原 免疫球蛋白
蛋白酶 磷酸酶
胆固醇 脂肪酸
核苷酸 苯基硼酸盐
胆固醇受体、胆固醇结合 蛋白 脂肪酸结合蛋白、白蛋白
五、亲和层析
（一）亲和层析的概念：
1、亲和力：根据生物体中高分子化合物能与之相对应的专一分子特异识别和
可逆结合的特征,将生物分子间的这种结合能力称为亲和力.
2、亲和层析法：利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性吸附而进行选 择性分离的一种生物大分子分离的层析方法。
（二）亲和层析法的原理：
在载体(无机或有机填料)的表面先键和一种具有一般反应性能的间隔臂,随后 再连接配体（酶、抗原、激素等）组成固定相,而固载的配体高选择地吸附与其 有生物特性的大分子而被保留,非特异的分子不被保留先流出层析柱,保留在柱上
方法 特异性配体亲 和层析法
通用性配体亲 和层析法
配体
性能
复杂的生命大分子物 具有较强的吸附选择性和 质（如抗体、受体和 较大的结合力 酶的类似底物等） 简单的小分子物质 成本低廉，具有较高的吸附 （如金属、染料、以 容量，通过改善吸附和脱附 及氨基酸等） 条件可提高层析的分辨率
亲和层析原理和步骤
亲和层析原理和步骤亲和层析（affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化靶标蛋白的方法。
它利用配体与目标蛋白的高亲和力来实现目标蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析的原理和步骤如下。
一、亲和层析的原理亲和层析的原理基于配体与目标蛋白之间的特异性结合。
配体是一种具有特异性反应性的化合物，可以和目标蛋白的结构域或位点发生特异性作用。
在亲和层析中，配体被固定在固定相上，也可以被连接到大分子载体上，形成亲和层析介质。
当样品通过亲和层析柱时，目标蛋白会与配体发生选择性结合，而其他非目标蛋白则不结合或弱结合，从而实现了目标蛋白的分离和纯化。
亲和层析的步骤通常包括以下几个方面：2.固定配体：将配体固定在固定相上是亲和层析的关键一步。
固定相可以是固定在柱子内壁的小分子配体，也可以是连接在大分子载体上的配体。
常用的固定剂包括琼脂糖、丙烯酰胺凝胶、硅胶等。
3.样品准备：在进行亲和层析之前，需要对样品进行准备。
通常包括细胞裂解、蛋白质提取、预处理等步骤。
样品中的废物和干扰物需要被去除，以便目标蛋白的有效分离和纯化。
4. 亲和层析操作：样品通过亲和层析柱时，目标蛋白与配体发生特异性结合。
通常需要选择适当的Buffer、pH值和盐浓度等条件来提高结合效率。
非目标蛋白会通过柱子流失，而目标蛋白则留在柱子中。
目标蛋白可以通过洗脱步骤从柱子中进行脱附。
5.洗脱与纯化：在洗脱过程中，目标蛋白从亲和层析柱中脱附。
洗脱条件需要根据结合强度和目标蛋白的特性来选择。
常用的洗脱方法包括pH值的调节、离子浓度的变化、配体浓度的变化等。
洗脱后的目标蛋白可以通过浓缩和纯化步骤得到纯品。
二、亲和层析的优缺点亲和层析作为一种分离和纯化方法，具有以下优点：1.特异性：亲和层析可以选择性地结合目标蛋白，从而实现与其他非目标蛋白的分离。
2.高纯度：亲和层析可以显著提高目标蛋白的纯度，使其达到实验或工业应用的要求。
3.选择性：亲和层析可以基于不同的配体，实现对不同蛋白的选择性结合和纯化。
亲和层析法
第三节 提高吸附剂的操作容量
亲和吸附剂的操作容量的影响因素： 配体性质 配体在吸附剂中的含量 配体与吸附物结合时的位阻效应大小、 基质的多孔性 操作条件 等因素
一、在配体和基质之间引入“手臂”
1．原理
在配体和基质之间，特 别是在小分子的配体 和基质之间，引入适 当长度的“手 臂 ” ( arm)， 使 配 体 离开基质的骨架，
• 将琼脂糖衍生物与溴乙酰衍生物或琥珀酸酐等化合物 反应(见图7-9)后，再与含氨基、酚羟基和咪唑基等基 团的化合物反应，
• 即可生成一系列具有长短不等“手臂”的亲和吸附剂，
二、增加配体取代的程度
对一些解离常数较大的配体而言，增加配体在基质上 的浓度也是增加吸附剂结合量的有效手段。
增加配体数的方法是： 在配体量一定时，随着基质活性基团的增加(通过活化 时pH值的提高和溴化氰量的增加)偶联配体的量也相
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。
• ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质(如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。
• ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。
A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。
• 2)间接测定法
①推算法
一般情况下，从加入配体的数量中减去配体与活化琼脂糖偶联后洗涤出 来的配体量，即可大致推算出配体的结合量。 ②根据亲和吸附剂对被吸附物质的操作容量可计算配体的结合量 其方法有： 一是把亲和吸附剂装入柱(0.5cm×10cm)内，加入过量的欲分离大分子 物质，使其结合量达到最大，用适当的洗涤剂彻底洗去非专一性的物质， 然后再用特异的洗脱剂洗出欲分离的大分子物质。根据分离出的大分子 物质的量，计算出配体的结合量。 二是把少量纯品大分子物质陆续加到亲和层析柱中，直到饱和平衡为止，
亲和层析
样品制备
样品浓度
尽量适度，即有利于充分交换，又节省操作时间
样品组成
离子组成尽量与上样缓冲液相同，如果不同，可以 通过过滤、脱盐或者透析更换。
层析柱的规格
装柱体积适于蛋白的样品量 5-40% 可用载样量 柱长 5-10 cm
Short, fat
洗涤
样品吸附上柱后，要用几倍起始缓冲液的体 积过柱洗去杂质，可以适当增加离子强度洗 去静电吸附的非特异性结合物。当OD280吸光 值回到基线时，停止洗涤。
洗脱液中含量较少
1、咪唑浓度低 2、降低pH洗脱（低于pH3.5以下，离子会有大量脱落） 3、+4 °C洗脱过夜
优化条件
1、起始缓冲液中加入咪唑，如20mM，以减少杂蛋白。 2、线性洗脱，探索纯度高的洗脱梯度。 3、使用其他离子，如Zn（吸附较弱）或Cu（吸附较强）等
亲和层析的应用? 亲和层析的应用
声前加融菌酶） 2、柱子平衡液以及样品缓冲液中没有EDTA、DTT等 使用过的柱，是否已经再生。 3、降低起始缓冲液中咪唑的浓度有利于融合蛋白的吸 附 4、是否过载，chelating sepharose 大约12mg/ml。 5、融合蛋白可能是包涵体表达，破菌上清不含融合蛋 白 6、Ni离子是否已经鳌和好了。
Protocols for cleaning-in-place (CIP), 清洁和灭菌
去除沉淀蛋白 4个柱体积的0.5-1.0 M NaOH ，线性流速40 cm/h ，然后使用水清洗2-3 个柱体积 。 去除强结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂类 4-10 个柱床体积的70% ethanol 或30% isopropanol ，然后使用3-4个柱 体积或1-2个柱体积的0.5% non-ionic detergent (e.g. in 1 M acetic acid) ， 然后使用5个柱体积的70% ethanol 去除去污剂，最后3-4个柱体积的水。 清洁 0.5-1.0 M NaOH 接触时间 30-60min. 灭菌 高压介质 121 °C 15 min.
亲和层析
Fig5 . Principle of preparing AC media来自 第三节：亲和层析的基本操作方法：
1.平衡（
Equilibration）
用平衡Buffer 冲洗柱体，至基线平稳.
2. 样品上柱和冲洗：
（Sample application and wash） 样品中的目的物与层析介质选择 性的吸附，杂质不被吸附。用上样 Buffer冲洗柱体，杂质被冲洗下来。 形成杂质峰（见下图）。
3： 基质（matrix):亦称为载体（vector):是
构成固定相的骨架 。
二：亲和层析有如下特点： (Characteristics of Affinity Chromatography)
1:纯化过程简单、迅速. 2:分离效率高。 3:产物纯度高。 4:必须针对某一分离对象制备专一的配基及 寻求稳定的层析条件。
( Fig1. Mechanism of AC)
( Fig2. Mechanism of AC)
具有特异性亲和作用的生物分子 四：配基的种类:(sorts of ligand)
1：抗原与抗体。 2：DNA与互补DNA或RNA（cDNA、 mRNA)。 3：酶与其底物。 4：激素与其受体。 5：维生素与结合蛋白。 6：糖蛋白与植物凝集素。
五：亲和层析载体的性质与选择
亲和层析载体的选择(selection of vectors)
1：多孔的立体网状结构，能使被亲和吸附的 大分子自由通过。 2：颗粒均匀，具有良好的流速。 3：具有惰性，尽量减少非专一性吸附。 4：在温和的条件下 能与配基共价偶联。
亲和层析载体的性质与选择 六：常用的亲和层析载体：
第一节： 亲和层析（Affinity Chromatography）的基本概念及特点： 一、 基本概念：(basic concept)： 1： 亲和层析是利用待分离物质与其特异性配基
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释
亲和层析是一种蛋白质分离技术，是将亲水性聚合物——聚丙烯酰胺按预先设计的程序加入到样品溶液中，以胶束为架桥剂。
当待测蛋白质在一定浓度梯度的聚合物溶液中通过胶束时，吸附在胶束上并随之进入疏水相中的待测蛋白质就会被高度保留在胶束周围，然后用洗脱缓冲液洗脱，最后将得到的疏水性高聚物的清液在超声波场作用下去除。
由于蛋白质和聚丙烯酰胺之间的特异性吸附，使蛋白质在层析液中移动形成特征的拖尾现象。
亲和层析是利用层析介质表面上所固有的吸附力，将物质分配到具有不同吸附能力的两相之间，形成彼此分离的各个分子层。
亲和层析的种类很多，常见的有：亲和柱层析、疏水膜层析、液膜层析等。
亲和层析技术由英国纽卡斯尔大学与美国加州大学伯克利分校
共同开发的一种新型的蛋白质分离技术，它可以直接分离纯化蛋白质。
亲和层析技术的原理基于吸附与解吸附的机理，当待分离物质从层析柱移动时，由于受到吸附介质的吸附，使得该物质的分子量下降，经分离后达到分子量高的蛋白质的峰展宽，而分子量低的蛋白质的峰缩窄甚至消失。
这样就把峰位展宽或展宽消失的蛋白质区分开来，分别采集收集它们的蛋白质样品。
这种方法对层析介质的选择十分重要。
常用的层析介质有以下几种。
1、固相支持物质； 2、疏水固体颗粒；
3、多孔介质。
亲和层析亲和层析技术是在疏水性载体上，借助于疏水性基团对蛋白质的选择性吸附而进行分离纯化的。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释亲和层析的基本原理是通过层析柱使吸附剂对某种物质的结合能力增强，或者改变其分子形状使它更易于与其他组分进行亲和层析。
简言之就是把组分放在亲和层析柱上，让吸附剂对某个组分的吸附作用增强，因此减弱或避免了它对其他组分的吸附作用。
亲和层析技术具有一些特殊性：①亲和层析反应体系属于多组分反应体系，具有相当大的范围可以选择；②利用亲和层析方法可以将含量低的同类型物质，甚至许多非亲和性组分结合在一起；③由于亲和层析不但具有显著的选择性，而且还能同时对两种或两种以上的不同物质进行层析，因此对这类化合物的分离和鉴定具有独特的优越性；④对混合物中不同类型的化合物都能进行层析，即使物质间的亲和性很差，如异构体之间也能被分离。
亲和层析技术已经广泛地用于天然产物化学成分的分离和鉴定、药物分子的筛选和结构改造、环境污染物的检测、生物活性物质的研究以及疾病的诊断等领域。
目前，该技术已经成功地应用于维生素A、维生素E、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素C、蛋氨酸、生物碱、三尖杉酯碱、芦荟大黄素、葛根素、万寿菊素、番茄红素、菠菜素、辣椒素、藏红花素、皂苷元、蛋白质、酶、雌性激素、黄酮类化合物、动物激素、血清和细胞培养液中多种微量元素等物质的分离和鉴定。
在植物化学、药学、分子生物学、生命科学等领域，亲和层析方法也得到了广泛应用。
自1960年第一次用亲和层析方法对一些水果蔬菜和草药中的几十种成分进行了分离后，亲和层析方法就受到各国科学家的重视，并获得了飞速发展。
亲和层析是基于极性分子吸附剂上的疏水部分和亲和性化合物中的亲水部分互相吸引而实现的。
不同的亲和层析方法常采用不同的吸附剂，如水合物(或疏水性吸附剂)和氧化物(或亲水性吸附剂)。
根据吸附剂与待分离化合物的亲和程度，常用四级亲和度(级别越高说明与化合物的亲和性越强)：(1)较弱亲和，用氧化物吸附剂；(2)中等亲和，用水合物吸附剂；(3)较强亲和，用亲水性吸附剂；(4)极强亲和，用强水合物吸附剂。
亲和层析名词解释
亲和层析名词解释亲和层析是研究样品中的各组分与某些对生物大分子有专一性吸附能力的特殊分子或离子相互作用，并利用这种相互作用选择和富集待测组分。
所谓亲和层析是根据生物大分子具有可解离或与配体结合成牢固的结合态，因而它们与蛋白质、核酸、糖类及脂质等生物大分子形成复杂的亲和力。
这些生物大分子不仅能与不同的蛋白质、核酸以及糖类等结合，而且还能与多种其他分子结合。
这种结合的专一性使它在吸附分离生物大分子时比一般选择性薄层色谱更加灵敏、迅速。
所以根据生物大分子的可解离性以及由此产生的不同的亲和力，在某些生物大分子上就能达到高度的分离，获得纯化的生物大分子。
这是亲和层析技术应用的理论基础。
8-nm亲和层析与氨基酸、核酸的亲和层析一样，属于离子交换层析法的一种。
它是用2。
5-5。
0尼龙的电极，以连续可变的电压通过被洗脱组分，从而将它带出来的。
亲和层析也可以用阴离子型缓冲溶液（如Ca(2+)， Mg(2+)等）进行，然后再用等电点沉淀或分子筛效应进行分离。
在亲和层析时，要使用电极活性较低的阴离子，并要用与样品等电点接近的缓冲溶液洗脱，避免电解质引起的组分沉淀。
9。
11。
12。
13。
16。
大多数氨基酸、核酸等生物大分子都有亲和性。
氨基酸中的甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸等的羧基部分都有强亲和性，例如氨基酸的D-COOH-COO NH2与亲和层析的AgNO3等阴离子或阳离子生成稳定的Ag，而氨基则保持游离状态。
相反，许多游离胺基酸如丙氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸等都具有亲和性。
氨基酸中的尿素、天冬酰胺、谷酰胺等碱性氨基酸都不具有亲和性，它们的亲和性与相应的羧酸有关。
游离的蛋白质多数也具有亲和性。
在亲和层析时，电极活性越低，对生物大分子的亲和性越小，则洗脱时的迁移率越快，即层析的分辨率越高。
蛋白质的氨基虽然能以N-NH2基形式存在，但多数只有N-NH2的形式才具有亲和性，所以通常称为弱亲和蛋白质。
通常用于分离蛋白质的有氨基苯甲酸盐、咪唑啉酮、大豆苷、天冬酰胺等。
亲和层析原理和方法
亲和层析原理和方法引言亲和层析是一种常用的分离纯化生物大分子的方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
本文将介绍亲和层析的基本原理和常用方法。
一、亲和层析的基本原理亲和层析是利用化学结合的特异性，将目标分子与固定在层析柱上的亲和配体结合，从而实现目标分子的分离纯化。
其基本原理如下：1. 亲和配体选择性结合目标分子：亲和配体是一种具有特异性结合目标分子的生物大分子或化学物质。
通过选择合适的亲和配体，可以实现对目标分子的选择性结合。
2. 层析柱固定亲和配体：亲和配体通常通过共价键或非共价键的方法固定在层析柱的填料上。
固定亲和配体后，层析柱具有了对目标分子的特异性结合能力。
3. 样品溶液通过层析柱：样品溶液中含有目标分子和其他杂质分子。
当样品溶液通过层析柱时，目标分子会与层析柱上的亲和配体结合，而杂质分子则流经层析柱。
4. 目标分子的洗脱和回收：通过改变洗脱缓冲液的条件，可以使目标分子与亲和配体解离，从而实现目标分子的洗脱和回收。
二、常用的亲和层析方法亲和层析方法根据亲和配体的性质和结合方式的不同，可以分为多种不同的方法。
以下是几种常用的亲和层析方法：1. 金属离子亲和层析：利用金属离子与亲和配体之间的配位作用，实现对目标分子的选择性结合。
常用的金属离子包括Ni2+、Cu2+和Zn2+等。
2. 免疫亲和层析：利用抗体与抗原之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
免疫亲和层析广泛应用于生物医学领域，用于分离纯化抗体和抗原。
3. 亲和色谱层析：利用染料、受体或配体等分子与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和色谱层析方法有离子交换层析、亲和柱层析等。
4. 亲和吸附层析：利用亲和吸附剂与目标分子之间的特异性结合，实现对目标分子的选择性结合。
常用的亲和吸附层析方法有亲和蛋白A/G层析、亲和葡萄糖层析等。
三、亲和层析的应用领域亲和层析作为一种常用的分离纯化方法，广泛应用于生物工程、生物医学和生物化学等领域。
亲和层析
葡聚糖凝胶 商品名:Sephadex 型号:G-100,150,200 型号含义:每克干凝胶吸水量X10 特点:理化性质稳定,耐热耐碱不耐酸,网孔小
四、配基的选择
应具备的特性： 1.对于欲纯化的生物物质应具有专一亲和性 2.必须具备能被修饰的功能基团
以酶和底物为例来讨论配基与欲纯化的生物 物质的亲和性:
2.豌豆素生物活性测定 取反应板一块，分别在各孔中加入对照 生理盐水、杂蛋白洗脱液、豌豆凝集素收 集液各二滴再加入兔红细胞悬液1滴，置 37℃保温10分钟，取出后用玻棒在反应孔 轻轻搅动，比较各孔凝集情况，并解释结 果。
亲 和 层 析 Affinity Chromatography
一、概述
亲和层析：是利用生物大分子之间有 专一的亲和力而达到分离纯化的层析 方法
优点：1.纯化过程简单、迅速 2.分离效率高 3.实验条件温和 缺点：1.针对某一分离对象就需要制备专一的 吸附剂和建立相应的实验条件 2.配基的选择及其与基质的共价结合需 要烦琐的操作步骤
二、基本原理 生物专一吸附
(bioselective adsorption )
1.具有专一性亲和力的生物分子对： 酶—底物（包括酶的竞争性抑制剂和辅 酶因子） 特异性抗原—抗体 激素—受体 DNA—互补的DNA或RNA 凝集素和糖蛋白
2.基本过程： 固相化 (Immobilise)
配基Ligand:亲和层析中能被某一生 物大分子识别和可逆结合的生物专一性物 质。 基质Matrix(载体):亲和层析中与配基 共价结合,使其固相化的物质。
五、配基的固相化
固相化技术：将配基以共价键连接于不溶于 水的固相基质上制成固相化吸附剂
过程：活化、接臂
"插入剂"或"手臂"使小分子配基适当的离开载 体骨架,克服载体空间位阻的影响
亲和层析
特点： • 亲和层析的分辨率比凝胶过滤层析高。 • 用亲和层析法纯化样品时，操作步骤少，活力不易丧 失。 • 该法的缺点是： 要分离一种物质必须找到适宜的配体，并将其制成固 相载体之后方可进行。
操作流程
一、基质的选择 理想的基质应满足下面的要求： 1．极低的非特异吸附性； 2．高度的亲水性。 亲和吸附剂要易与水溶液中的生命大分子物质接近。 3．较好的理化稳定性。 当配体固化和各种因素(如pH、离子强度、温度和变 性剂等)变化时，基质很少甚至不受影响； 4 ．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合； 5．适当的多孔性(即孔径大小和筛孔多少)。
即可把物质 S 从固相载体上解离下来，并形成了第二 个层析峰
如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时， 则采用选择性缓冲液进行洗脱，也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后，可以重复使用。
上面介绍的亲和层析法亦称： 特异性配体亲和层析法 • 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等)，它具有较强的吸附选择性和较大的结合力； 另有一种亲和层析法叫： 通用性配体亲和层析法 • 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等)， 它成本低廉，具有较高的吸附容量，通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。
• ①亲和力比较小时，可以连续用大体积平衡缓冲液洗 脱，得到迟缓的大分子物质峰。 • ②亲和力一般时，主要靠改变缓冲液的性质 ( 如改变 pH值或离子强度，或者同时改变pH值和离子强度)， 使复合物之间的亲和力下降到足以分离的程度。 • ③亲和力较强时，可用与配体竞争的溶液或者用蛋白 质变性剂洗脱。 A．竞争性洗脱剂 这类洗脱剂的优点是专一性强，并能洗脱出和配体特 异结合的大分子物质。 B．剧烈的洗脱条件(蛋白质变性剂) 如用盐酸胍、尿素等变性试剂配制的溶液洗脱下的蛋 白质等生命大分子物质；需要经过适当的处理方可恢 复活性。
现代分离技术-亲和层析
将具有特殊结构的亲和分子制成固相 吸附剂放置在层析柱中，当要被分离的蛋 白混合液通过层析柱时，与吸附剂具有亲 和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析 柱中。那些没有亲和力的蛋白质由于不被 吸附，直接流出，从而与被分离的蛋白质 分开，然后选用适当的洗脱液， 改变结合 条件将被结合的蛋白质洗脱下来。
酶与底物 (包括酶的竞争性抑制剂和辅助因 子)，抗原与抗体，激素与受体，核酸中的 互补链多糖与蛋白复合体。
第一步
载体和配体的结合 抗原或抗体结合到支持物上的方法目前
有20多种，但可归结为载体结合法、物理 吸附法、交联法和网络法4类。
第二步
与目标蛋白结合 配体与目标蛋白发生特异性结合。
第三步
目标蛋白的洗脱 非特异性洗脱:改变缓冲液的pH、离子强度、 介电常数或温度使物质构象改变，浓缩、 洗脱后立即中和稀释或透析，使蛋白质迅 速恢复到天然结构 特异性洗脱：再次利用生物学特异性只洗 脱和配基专一作用的酶，不洗脱由于非专 一吸附上去的杂蛋白
分类
生物亲和层析（BAFC） 免疫亲和层析（IAFC） 金属离子亲和层析（IMAC） 拟生物亲和层析（Biomimetic AFC）
生物亲和层析
生物亲和层析是利用自然界中存在的生物 特异性相互作用物质对的亲和层析通常具 有很高的选择性典型的物质对有酶底物酶 抑制剂激素受体等。
优缺点
亲和色谱法具有高度的专一性，而且色谱 过程简单、快速，是一种理想的有效分离 纯化生物大分子的手段。亲和层析具有高 选择性高活性回收率和高纯度等特点。
但是亲和层析技术也有一些缺点主要是载 体 (如琼脂糖Sepharose) 价格昂贵机械强 度低 (易压床)配基的制备困难偶联条件激 烈需要使用剧毒的活化剂 (如CNBr)等。
亲和层析
亲和层析技术 Affinity Chromatography
什么是亲和层析?
亲和层析是一种通过生物分子之间的特异性的 相互作用来分离物质的层析方法
基质/基架:可以耦联配基的惰性材料，如 Sepharose HP，Sepharose FF
间隔臂: 减少空间位阻效应， 大大增加配基对待分离的生物大分子的吸附效率。
竞争性洗脱—特异的配基竞争性洗脱或底物竞争性洗脱， 在洗脱液中加入与亲和吸附剂上相同或不同的配基。 选择与待分离物有高亲和力但其结构与载体上 固定化配基不同的配基洗脱，可以减少非特异性洗脱。
变性剂洗脱—有的蛋白在一定浓度的变性剂 中有较好的稳定性，但在亲和介质上结合得 比较牢固，在洗脱液中加入EDTA、盐酸胍、 尿素等有利于蛋白质解离。
配基:和目标物有特异性相互作用的物质
耦连:将配基与基架以共价键的方式连接
配基与目标蛋白的特异性
专一特异性配基：针对单一物质的特异性 如： 抗原 抗体 激素 受体
族特异性配基：针对一类结构或功能相似物 质的特异性 如： 凝集素 糖蛋白 Protein G IgG 抗体 Dye-stuffs（染料） 酶
低pH下洗脱
Protein G Sepharose分离IgG抗体
结合缓冲液:20 mM 磷酸钠, pH 7.0 洗脱缓冲液:0.1 M 甘氨酸- HCl, pH 2.7
注意: 为了保护抗体的活性，将洗脱组分收集于 1 M Tris-HCl, pH 7.5中
高盐洗脱
在Heparin Sepharose(肝素)上分离DNA结合蛋白 结合缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 0.5 M NaCl 洗脱缓冲液: 20 mM Tris-HCl, pH 8, 1-2 M NaCl 注意: 为了维持活性常添加5% (v/v)的甘油和蛋白酶抑制剂
第七章 层析分离技术(4)亲和层析
7.4 亲和层析
三、亲和层析的操作过程
洗脱(elution)
按洗脱机理可分为：
（1）竞争性洗脱：利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合作用的 小分子化合物为洗脱剂，通过与亲和配基或目标产物的竞争性结合，洗 脱目标物。
例1：t-PA亲和层析，赖氨酸和精氨酸均为其抑制剂； 例2：带有His标签的蛋白质的金属鳌和亲和层析，用咪唑溶液为洗脱剂）
样品需进行预处理：通过离心或超滤除去微小颗粒； 缓冲液离子强度： 载体活化时引入一些带基团，低离子强度下，树脂对杂质的静电作用较 强，因此，提高盐浓度可减少杂质的非特异性吸附； 在离子强度太高的情况下，由于间隔臂上的碳氢链疏水性增强，也可能 产生非特异性吸附 因此，缓冲液的离子强度应适中（100~500mmol/L）
第七章 层析分离技术（4）
本章内容
7.1 层析技术导论 7.2 凝胶过滤层析 7.3 离子交换层析 7.4 亲和层析 7.5 固定金属离子亲和层析 7.6 疏水作用层析 7.7 反相层析
7.4 亲和层析
一、基本原理及特点 二、亲和层析的基本组成 三、亲和层析的操作过程 四、亲和层析存在的问题 五、举例：利用谷胱甘肽-亲和层析树脂 纯化GST-融合蛋白
(1)溴化氰法
溴化氰在碱性条件下与多糖上的羟基反应导入氰酯键或亚氨碳酸酯 到基质上,进而与配基偶联。
优点: （1）适用于含羟基多糖及含羟基的合成基质 （2）用于含伯氨基小分子配基及伯氨基大分子配基的偶联 （3）操作步骤简单,重现性好。 （4）偶联条件温和,特别适用于偶联敏感性生物大分子。 缺点： （1）形成的异脲键易产生非特异性吸附, （2）共价键不稳定,配基容易脱落, （3）活化操作危险性大（CNBr为剧毒药品，操作需在通风橱中进 行），反应后的残余液需经处理再排放。
亲和层析分析
酶的名称
醇脱氢酶 3-磷酸甘油醛脱氢酶
己糖激酶 甘油激酶
来源
结合强度* 吸附剂1 吸附剂2
酵母
400
0
兔肌肉
0 >1 mol/L#
酵母
0
0
122
0
*以KCl浓度（mol/L）表示。 #需加5×10-3 mol/L还原辅酶I才能洗脱。
一种专一性的亲和吸附剂只能分离一种酶，虽然效 率高，但使用范围窄，如果能以一类酶的通用配基 制成亲和吸附剂，再仔细选择洗脱条件，将其逐个 分别洗脱下来，可以在短时间内分离纯化几个酶。
主要技术指标： ⑴．配基偶联量：0.5-1.0 (mmol/ml胶)； ⑵．蛋白吸附量：4-6(mg/ml胶)； ⑶．活性回收率：80%左右。
多孔玻璃载体亲和吸附剂的制备
载体先在5％硝酸溶液中煮沸45 min，用水洗涤，在 115℃下烘干，1g干的清洁载体加入75 mL 10%的γ丙氨基三乙氧硅烷，后者溶解在甲苯中，回流12-24 小时，用甲苯、丙酮清洗，空气干燥。
活化载体“接臂”
“接臂”的前提：小分子作为配基，被分离物质是大 分子，空间位阻影响亲和吸附。
具有专一亲和力的生物分子对主要有： 抗原与抗体 DNA与互补DNA或RNA 酶与它的底物或竞争性抑制剂 激素（或药物）与它们的受体 维生素和它的特异结合蛋白 糖蛋白与它相应的植物凝集素等
亲和层析的优点
♦ 待分离物质与配基专一性结合，分辨率 高，操作简单，一次操作即可得到较高 纯度的分离物质。
♦ 具有浓缩作用，纯化倍数高达几千倍。 ♦ 分离条件温和，有利于保持物质原有的
例如：SAH（S-腺苷酰-高半胱氨酸）可以作为 RNA、DNA和蛋白质转甲基化酶的通用配基。
转甲基化酶