发酵大实验实验报告

2010级发酵大实验（1）

实验报告

任课老师：

姓名：

专业：生物技术

班级：

学号：

日期：2013年6月

实验报告

一、目的要求：

了解筛菌的基本操作，包括：培养基配制，灭菌，接种，涂板，摇菌，紫外分光光度计的使用等。

二、实验材料

1、菌种来源：英语公园葡萄树下土壤和生物学院院楼门口土样。

2、培养基：

（1）淀粉液体培养基：可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、牛肉膏0. 5%

（2）淀粉固体培养基: 可溶性淀粉1%、蛋白胨1% 、葡萄糖0. 5%、NaCl 0. 5%、牛肉膏0. 5%、琼脂粉1.5% 。

3、器皿：试管，量筒，烧杯，移液管，培养皿，洗耳球，玻璃棒，酒精灯，接菌环，三角瓶，玻璃棒等。

4、仪器：高压蒸汽灭菌锅，水浴锅，恒温培养箱，摇床，天平、紫外可见分光光度计等。

5、试剂：1%碘液、1M NaOH、DNS、pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液、1%淀粉溶液、1mg/mL的麦芽糖，结晶紫溶液。

6、其他：封口膜、纱布，棉花，试管架等。

三、实验步骤：

1、初筛：

（1）配制培养基：按照上述培养基成分及数量称取各物质，放入三角瓶中，加水到100ml，包扎。和包扎好的试管、移液管、涂布器、培养皿等一起放入灭菌锅中121℃高压灭菌20min。然后干燥后使用。

（2）倒平板：把培养基置于无菌工作台上，待冷却到55℃左右后，倒入灭菌后的平板中，每个平板中约15-20ml，之后待冷却凝固。

（3）菌悬液制备：我们组分别从英语公园的葡萄树下和生物学院院楼门口采集土样，各称取10g，放入装有90mL无菌水的三角瓶中，震荡20min后静置5min。（4）浓度稀释：在无菌试验台上进行浓度梯度稀释,把土样摇匀，从中吸取1ml 置于事先灭好菌的试管中，再加入9 ml无菌水，再从该试管中吸取1ml土样置

于另一只无菌试管中，加入9ml无菌水，依次稀释到10^-5、10^-6、10^-7、10^-8待用。

（5）涂布平板：在超净工作台中，分别在10^-5、10^-6、10^-7、10^-8浓度下各取1 ml两种土壤稀释液倒入已冷却的平板中（因有一根试管破裂所以第二组土壤缺少10^-7浓度的稀释液，不过不影响之后的实验）。用涂布器涂布均匀，在平板上标注土样的浓度。把标注好的培养皿放入37 ℃培养箱中培养16-18h 。

（6）加碘筛选：取出培养好的平皿，放入冰箱中培养24h，取出后在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。

2、复筛：

平板划线：用上述配制培养基和到平板的方法再制得培养基，用灭过菌的接菌环从上述培养皿中挑去菌落周围透明圈和菌落直径比值较大的菌落在新配置的培养基上进行划线分离，之后进行浓度标注。将标注好的培养皿放入37 ℃培养箱中培养16-18h。

3、检测菌种淀粉酶酶活：

（1）配培养基：配置上述液体培养基，分装到多个100ml锥形瓶中，灭菌。（2）接种：再次滴加碘液，挑选得到的周围透明圈较大的菌落，刮取1环接种至灭菌的含30/25mL液体培养基的三角瓶中。并做好标记，方便后续菌种的保存接种后的培养基至于摇床中培养，培养条件为：30℃，180r/min、6小时后即可。

（3）测麦芽糖标准曲线：

1）浓度为1mg/mL的麦芽糖标准液的配制：

准确称取50mg麦芽糖于50mL小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，移入50mL容量瓶中用蒸馏水定容至50mL，充分混匀。待用。

2）取8支洗净烘干的10mL具塞刻度试管，编号后按表2加入标准麦芽糖（G）溶液和蒸馏水，配制成一系列不同浓度的麦芽糖溶液。充分摇匀后，向各试管中加入2.0 mL DNS溶液，摇匀后沸水浴5min，取出冷却后用蒸馏水定容至10mL，充分混匀。在540nm波长下，以1号试管溶液作为空白对照，调零点，测定其

它各管溶液的光密度值并记录结果。以麦芽糖含量（mg）为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标，绘制出麦芽糖标准曲线。

表1 麦芽糖标准曲线制作

（4）测菌液浓度（比浊法）：

以参比液为空白对照，测定待测液OD590nm处的吸光值，以OD值标示枯草芽孢杆菌的生物量。OD值最好等于1.

（5）稀释菌液：通常用去灭菌去离子水稀释稀释到50-200倍，但因为我们组的菌液测浓度较低，故并没有进行稀释直接用的原液。

（6）、淀粉酶活力的测定：

1）取10mL刻度试管2支（标记为A、B），分别加入0.5mL已稀释的待测酶液。2）在B管中加入0.5mL 1M NaOH灭酶活，A管中加入0.5 mL pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液。然后在两管同时加入0.5 mL 1％淀粉溶液作为反应底物。3）40℃恒温水浴锅准确反应5 min

4）A管加入0.5 mL 1M NaOH灭酶活，B管中加0.5 mL pH 5.6 0.05M 乙酸/乙酸钠缓冲液。两管加显色剂DNS试剂2.0 mL，沸水反应5 min，反应后迅速冷却定容至10mL。

5）用分光光度计再540nm处比色，用B管作为对照，测定OD540nm值。

6）根据麦芽糖标准曲线计算麦芽糖含量（G）和发酵液中酶活力。

酶活力定义：40℃，每分钟催化可溶性淀粉水解生成1 mg麦芽糖所需要的酶量为一个活力单位（U）

计算公式：

酶活力＝y/生物量OD值/5×20×菌液稀释倍数可得

（7）结果分析:

若发酵液酶活性＜0.1U，基本可视为杂菌污染。

四、实验结果：

1、初筛结果：

图1.梯度10-5的土壤菌种初筛结果图2.梯度10-6的土壤菌种初筛结果

图3.梯度10-7的土壤菌种初筛结果图3.梯度10-8的土壤菌种初筛结果2、初筛加碘液结果：

图1.梯度10-8的土壤菌种结果图2.梯度10-8的土壤菌种结果注：因为其他梯度出现的透明圈几乎可以忽略，只有10-8出现了很明显很大的透