临床常见曲霉菌体外药物敏感性和分子生物学鉴定方法研究
利用BIOFOSUN系统鉴定常见曲霉
利用BIOFOSUN系统鉴定常见曲霉章强强;赵颖;李莉;朱均昊【摘要】目的评估BIOFOSUN系统鉴定临床常见曲霉的可靠性.方法采用常规形态学方法及分子生物学方法测定菌株rDNA保守区基因序列鉴定77株临床收集的曲霉,并与BIOFOSUN系统鉴定结果比较.结果 BIOFOSUN系统对构巢曲霉、杂色曲霉、寄生曲霉、棒曲霉、泡盛曲霉、焦曲霉、黄柄曲霉及日本曲霉种的鉴定符合率均为100%,对黄曲霉、烟曲霉、黑曲霉、土曲霉的鉴定符合率分别为92%、85%、75%及70%,对于土曲霉的鉴定符合率相对较差,利用BIOFOSUN系统提供的形态学图谱,观察其具有特征性的菌落外型及色素,可以帮助鉴定.使用BIOFOSUN系统可以将一些形态学特征接近,且又不能通过rDNA基因测序方法进行区分的曲霉作出鉴定.结论 BIOFOSUN系统可以利用计算机进行数据分析,自动化和标准化程度高,大大简化鉴定程序,为曲霉的标准化鉴定提供了一个有效的方法.【期刊名称】《检验医学》【年(卷),期】2010(025)007【总页数】4页(P515-518)【关键词】BIOFOSUN系统;真菌鉴定;曲霉;分子生物学鉴定;表型鉴定【作者】章强强;赵颖;李莉;朱均昊【作者单位】复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室,上海,200040;复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室,上海,200040;复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室,上海,200040;复旦大学附属华山医院皮肤科真菌室,上海,200040【正文语种】中文【中图分类】R446.5曲霉感染越来越威胁着危重患者的健康与生命,已成为仅次于酵母菌病的真菌感染性疾病[1],我国曲霉病病死率高达 50%～100%[2]。
随着抗真菌药物的不断涌现及广泛应用,不同种的真菌对不同药物的敏感性也有差别,耐药问题日益显现。
因此,对病原真菌鉴定到种的水平具有临床治疗和流行病学研究的双重意义,解决这一问题的关键在于提高实验室的真菌鉴定水平。
MRSA耐药机制与分子生物学检测方法研究新进展_杨长顺
·综 述·M RSA 耐药机制与分子生物学检测方法研究新进展杨长顺,审校刘文恩(中南大学湘雅医院,湖南长沙410008)关键词:M RSA ;耐药机制;分子生物学检测方法中图分类号:R378.1+1 文献标识码:A 文章编号:1005-4529(2007)03-0356-03收稿日期:2006-07-16; 修回日期:2006-10-20 随着抗菌药物的广泛使用,出现了越来越多的耐药性细菌。
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(M RSA )就是其中很重要的一种,由于其传播速度快,并且表现出多重耐药性,常引起感染的流行及暴发流行。
目前M RSA 感染已与H BV 、A IDS 并列世界范围内的3大难解决的感染性疾病。
笔者就其流行特点、耐药机制及分子生物学检测方法进行综述。
1 M RSA 的流行特点 1961年Jev ons 在英国首次发现M RSA ,20世纪60年代中期扩展至欧洲许多国家及加拿大。
70年代末M RSA 急剧增多遍及全球,耐药范围日益扩大,耐药程度也日益严重。
80年代后期已成为全球性的病原微生物,居医院感染病原菌的首位,占大型教学医院分离金黄色葡萄球菌的60%～80%。
特别是氟喹诺酮类药物应用于临床后,对其耐药的金黄色葡萄球菌迅速出现,而且>90%为M RSA 。
由于M RSA 对多种抗菌药物具有广泛耐药性,对其可用的仅为万古霉素等糖肽类抗菌药物。
但是在90年代后期又出现了耐万古霉素M RSA ,开始表现为中介度耐万古霉素金黄色葡萄球菌(V ISA ),美、英、德、意大利、韩国等相继报道检出了V ISA [1]。
2002年美国密执安州及宾夕法尼亚州先后报道了完全耐万古霉素M RSA (V RSA )[2,3],2004年美国报道了第3株V RS A[4],并为美国感染性疾病控制中心确证。
临床上对其治疗可选用的抗菌药物越来越少,使得M RSA 成为临床最关注的一类耐药菌。
细菌与病毒的研究与诊断方法
细菌与病毒的研究与诊断方法细菌和病毒是人类生活中常见的微生物，它们既可以有益于人类的生活，如在食品发酵和药物制造中的应用，也可以给人类带来危害，如引发各种传染病和感染性疾病。
因此，对细菌和病毒的研究和诊断方法是非常重要的。
一、细菌研究与诊断方法1. 常规的细菌培养和鉴定方法常规的细菌培养是指将临床样本（如尿、血、各种分泌物等）涂在不同的寒暖培养基上，通过寒暖条件、营养物质、PH值等不同的条件，让细菌在试管中生长繁殖，然后利用生长繁殖具有鲜明的形态、色彩、光学性质等特征，进行定种和鉴定。
2. 分子生物学方法分子生物学是近年来发展迅速的一门交叉学科，利用PCR、基因芯片等技术，能够快速、灵敏地检测到微生物。
例如，在肺炎支原体感染诊断中，可以利用PCR检测患者痰样中的肺炎支原体DNA，以便迅速诊断并给予治疗。
3. 聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种基于DNA复制过程的反应，可在很短的时间内制备出特定DNA 序列的无数复制品，从而快速检测出目标DNA分子。
利用PCR技术可快速进行基因序列分析、基因型鉴定和突变检测等。
在临床上，PCR已被广泛用于各种微生物的检测，如结核分枝杆菌、肺炎支原体、病毒性肝炎等。
二、病毒研究与诊断方法1. 细胞培养法在有些病毒感染中，病毒会侵入到人体细胞内进行繁殖，这就为病毒的诊断提供了紧凑而可靠的材料。
细胞培养法是通过将感染过病毒的细胞悬浮或培养液样本接种到携带某些特定的生物学特征的细胞系上，观察细胞所产生的病毒病变和症状，确定病毒属于哪种类型。
2. 血清学检测法血清学检测法是通过检测人体血液中的病毒特异性抗体，来判断是否有病毒感染。
典型的血清学检测法包括酶联免疫吸附法（ELISA）、放免检测法等。
这些方法简单，快速，灵敏，更加便于诊断，通常应用于对病毒的早期筛查和疫苗预防等方面。
3. 分子生物学方法分子生物学方法的快速发展为病毒的检测提供了更加准确、敏感、特异的手段。
例如，利用PCR技术可以扩增病毒基因组中的一部分特定序列，从而快速鉴定患者血样中是否出现病毒感染的迹象。
常用临床病原学检测
药物 AMP AMC TZP KZ COX CTX FEP ATM ETP FM
MIC(µg/ml) 敏感性
药物
MIC(µg/ml)
≥32
R
IPM
≤1
≥32
R
AK
16
≥128
R
GN
4
≥64
LOREM
R
IPSUM
DOTOLBOR
头孢泊肟≤17mm（或MIC≥8ug/ml)
确 头孢他啶≤22mm（或MIC≥2ug/ml) 证 头孢噻肟≤27mm（或MIC≥2ug/ml)
头孢曲松≤25mm（或MIC≥2ug/ml) 氨曲南≤27mm（或MIC≥2ug/ml)
头孢他啶/克拉 维酸-头孢他啶
和 头孢噻肟/克拉 维酸-头孢噻肟
初 头孢泊肟≤22mm（或MIC≥8ug/ml)
氨苄，美洛，替卡
• 头孢噻吩 肠杆菌科
拉定，氨苄，克罗
• 万古霉素s 所有
替考拉宁s
• 奈啶酸 肠杆菌科
所有FQs
报告结果方式
✓ 敏感（S）
▫ 用常规用量治疗有效 ▫ 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC
5倍以上。
✓ 耐药（R）
▫ 用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 ▫ MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
✓ MRSA对当前所有使用的b-内酰胺类药物均耐药（除具 有抗MRSA活性的新的头孢菌素外，如：头孢洛林）。
✓ 值得注意的是：由于罕见非mecA介导的苯唑西林耐药 机制，即mecA阴性但苯唑西林MIC是耐药（ mecA ≥4 µg/ml）的菌株，应报告苯唑西林耐药。
肺部感染病原菌的鉴定与药物敏感性
肺部感染病原菌的鉴定与药物敏感性检测肺部感染是一种常见的疾病，其病原菌的种类也非常多样，包括细菌、病毒和真菌等。
对于肺部感染的治疗和预防，正确鉴定病原菌的种类以及药物敏感性非常重要。
本文将介绍肺部感染病原菌的鉴定以及药物敏感性检测的方法。
一、病原菌鉴定的方法：1. 细菌培养和鉴定常见的肺部感染细菌包括肺炎链球菌、流感嗜血杆菌、铜绿假单胞菌和麻风球菌等。
在肺部病原菌的鉴定中，培养和鉴定细菌是最常用的方法。
培养细菌通常需要的样品包括痰液、胸腔积液和气管刷片等。
其中，痰液是最常见的样品，但是有些病原菌需要使用气管刷片等样品进行鉴定。
培养细菌通常需要将样品在培养基上进行多次传代，培养出单菌落之后，再使用各种特定的生化试剂、抗生素敏感试验和免疫学方法等进行鉴定。
鉴定过程需要使用一些特定仪器，如微生物自动分析仪、光谱方式鉴别仪和荧光原位杂交等。
2. 病毒鉴定肺部感染病毒的种类很多，包括甲型H1N1流感病毒、流行性感冒病毒和呼吸合胞病毒等。
病毒的鉴定较为复杂，需要使用一些分子生物学方法，如核酸扩增技术（PCR）等。
其中，PCR可以对各种需要进行病毒核酸鉴定的样品进行检测，如咽拭子样品、痰液样品和血液样品等。
此外，也可以使用克隆PCR和伸展PCR等技术进行病毒鉴定。
值得注意的是，使用PCR方法鉴定病毒需要进行负对照和阳对照的控制，确保检测结果准确无误。
二、药物敏感性检测的方法：药物敏感性检测是判断一个细菌或病毒对不同药物的敏感性的过程，也是治疗计划制订的重要依据。
药物敏感性检测方法包括以下几种：1. 过敏试验过敏试验通常用于检测与青霉素类药物相关的过敏反应。
过敏试验的原理是在人体的皮肤或头皮上注射一小量的特定药物，然后观察注射部位是否出现红斑、水疱等过敏症状。
如果出现过敏反应，则说明该药物不适合使用。
2. 碟扩散法碟扩散法是一种比较简单的药物敏感性检测方法。
这种方法需要将不同浓度的抗生素溶液抹在培养基的表面上，然后在每种药物的周围使用一种特定细菌进行培养。
应用反向线点杂交技术鉴定临床常见曲霉属和毛霉目真菌
Ａｐ ｒｉ ｕ ｅｒ ｓ ｎ ｓｅ ｉｕ ｎｄ ｌｎ ｓｅ ｌ ｓ ｒ ｕ ａ ｄ Ａｐ ｒ ｌ ｓ ｉｕａ ｓ） ａ ｄ ｅｅ Ｍ ｃｒ ｅ ｓｅｉ （ ｃｒ ｅ ｌ ， ｃｒ ａｅ ｏｕ， ｃｒ ｇ ｌ ｔ ｅ ｇｌ ｎ ｓｖｎ ｕｏａ ｓ ｐｃｅ ｌ ｓ Ｍｕｏ ｈ ｉ ｉ Ｍｕｏ ｒｃｍ ｓｓＭｕｏ ｍａ ｓ
【 中图分类号 】 Ｒ３９６ Ｒ３９９ ． ７ ． ７
【 文献标识码 】 Ａ
【 文章编 号】 １７ — ２ （０ １０－ ６ － ６３ ８７ ２１ ）５ ２１ ６ ３ ０ ０
Ｓｍｕｔｎ ｏ ｓｉｅ ｔＲ ｉ ｌ ｅ ｕ ｎｉ ａｉ ｆ ｐ ｒ ｌ ｓａ ｄＭｕ ｏａｅ ｃ ｅｅ ｓ ｎ ｌｔ（ ＬＢ） ａ ｄ ｆ ｏ ｉ Ａ ｇｌ ｐ ｅｂ ｉ
收集我 院真 菌和真菌病研究 中心保存 的 ５种 曲霉 菌 （ 烟曲霉 、 黄曲霉 、 曲霉 、 黑 土曲霉 、 构巢 曲霉） ７种毛霉 目真菌 和
（ 冻土毛霉菌 、 总状毛霉菌 、 卷枝毛霉菌 、 少根根霉 、 小孢根 霉 、 微小根 毛霉 、 伞状犁 头霉 ） 共计 ９ ， ８株菌株 。利用真菌通 用引
中国 真 菌 学 杂 志 ２ １ ０ １年 １ ０月 第 ６卷 第 ５期
Ｃ ｉ ｃｌＯ ｔ ｅ ２ １ ， ｏ ６，ｏ ５ ｈｎＪＭｙｏ， ｃ ｂ ｒ ０ １ Ｖ ｌ Ｎ ． ｏ
・
２ ６１ ・
・
论 著 ・
应 用 反 向线 点 杂 交 技 术 鉴 定 临床 常见 曲霉 属 和 毛 霉 目真 菌
ｃｒｉｅ ｏｄａ Ｒ ｉ ｐ ｓ ｒ ｉ ｓＲ ｉ ｐ ｓ ｃｏ ｏｕ ，ｈｚｍｕｏ ｕｉｕ ｎ ｂｉｉ ｒｍ ｍ ）ｗ ｒ ｂａ ｅ ｏ ｅｅｒｈ ｅｃ ｌ ｉｅ ， ｈ ｏｕ ｒ ｚ ，ｈｚ ｕ ｒｓ ｒｓＲ ｉ ｎｌ ｚ ａｈｕ ｏ ｍｉ ｐ ｏ ｃｒ ｓ ｌｓ ｄ ｓ ａｃ ｙ ｂ ｐ ｌ ａ Ａ ｄ ｏ ｅ ｏｔｉ ｄｆ ｍ Ｒ ｓａｃ ｅ ｎ ｒ
临床微生物学检验
临床微生物学检验引言临床微生物学检验是一种通过检测和分析患者体内微生物的存在和活动水平来帮助诊断和治疗感染性疾病的方法。
微生物学检验可以确定感染的原因和类型，并确定适当的抗生素治疗方案。
本文将介绍临床微生物学检验的概念、常见的检验方法和其在临床实践中的应用。
临床微生物学检验的概念临床微生物学检验是通过收集患者样本（如血液、尿液、血液培养物等）并对其中的微生物进行培养、分离和鉴定来确定感染病原体的方法。
它涉及一系列实验室操作和技术，包括细菌培养、抗生素敏感性测试、鉴定和分子生物学方法等。
这些方法可以帮助确认感染病原体的存在、确定其感染类型（细菌、真菌、病毒等）以及选择适宜的治疗药物。
临床微生物学检验的常见方法细菌培养细菌培养是一种常见的微生物学检验方法，它涉及将患者样本置于培养基中以促进微生物的生长。
不同类型的培养基可以支持不同类型的微生物生长，如常见的血液琼脂培养基可用于细菌培养。
细菌培养的时间可以从几小时到几天不等，具体取决于患者样本中微生物的增殖速度和种类。
抗生素敏感性测试抗生素敏感性测试是一种用于确定感染病原体对不同抗生素的敏感性和抵抗性的方法。
常见的抗生素敏感性测试方法包括纸片扩散法和微量稀释法。
这些测试可以帮助医生选择最适合的抗生素治疗方案，以避免抗生素的滥用和抵抗性的产生。
分子生物学方法分子生物学方法在临床微生物学检验中也扮演着重要的角色。
这些方法可以通过检测微生物的核酸（如DNA或RNA）来快速鉴定微生物的存在和类型。
其中常用的方法包括PCR （聚合酶链反应）和实时荧光定量PCR。
分子生物学方法具有高度的特异性和敏感性，可以快速准确地检测微生物。
临床微生物学检验的应用临床微生物学检验在临床实践中具有广泛的应用。
它可以帮助确定感染的病原体，指导治疗方案的制定和调整，并监测治疗的疗效。
以下是临床微生物学检验在不同感染疾病中的应用示例：细菌感染在细菌感染的诊断和治疗中，临床微生物学检验可以帮助确定感染的菌种、菌株的数量和敏感性，从而选择适当的抗生素治疗方案。
第十三章临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展(1)方案
6.便 正常人体的肠道中栖居大量的微生物，组成人体健康 极为重要的体内微生态环境，参与营养、消化、吸收等 作用。腹泻是因病原菌在肠道内大量繁殖的结果。
培养方法：粪便中最常见的病原菌是沙门氏菌与志贺氏菌， 因此通常临床标本可接种SS平板即可，如疑为特殊菌种 感染要选择相应的选择性培养基，如霍乱弧菌选用TCBS ，小肠结肠炎耶尔森氏菌选用NYE琼脂平板或CIN琼脂平 板，难辨梭状芽孢杆菌选用CCFA琼脂平板，念珠菌选用 TTC沙保罗等。
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（三）病原菌抗体的检测 1. 病原菌侵入机体后，其抗原性物质能刺激机体产生特异
性抗体。存在于血液或其他体液中的特异性抗体，常随 病程的进展发生变化。用已知细菌或其抗原检测病人体 内是否产生了相应的特异性抗体及其量的多少，可作为 某些病原菌感染的辅助诊断。 2. 常用的血清学试验包括：玻片或试管凝集试验、沉淀试 验、补体结合试验和冷凝集试验等，可根据病原菌的种 类加以选择。血清学诊断一般适用于病程较长和抗原性 较强的病原菌引起的感染。 3. 若以血清学试验结果作为诊断依据时，应在急性期和恢 复期各取一份血清同时检测，恢复期血清效价明显升高4 倍或以上时方有诊断价值。 4. 用血清学试验检测特异性抗体对感染性疾病的诊断有两 方面的局限：在疾病的早期，抗体难以检测出来，因此 难以作为早期诊断的依椐;当抗体水平升高时，很难找出 抗体效价与病情之间的关系。
3).培养方法：将脑脊液1500转离心15分钟，取沉渣进行培 养，5%CO2环境、35C培养3天。
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4.痰 正常人体的下呼吸道是无菌的，留取痰标本时由于经 常混入上呼吸道的分泌物，通常痰培养时总是可以见到 上呼吸道的正常菌群。因此判断下呼吸道中是否有致病 菌，必须了解上呼吸道的正常菌群。留取的痰标本的质 量也直接影响培养的结果。根据痰涂片革兰氏染色的结 果可以判断痰标本的质量。
烟曲霉再鉴定、标准化CSP分型及体外药物敏感性
烟曲霉再鉴定、标准化CSP分型及体外药物敏感性高露娟;余进;李若瑜【摘要】Objective To investigate the strain distribution of Aspergillus fumigatus complex, the CSP genotypes and in vitro susceptibility of classic A. fumigatus strains. Methods One hundred and sixty-two strains of A. fumigatus complex isolated from 12S patients were re-identified as Aspergillus section Fumigati via macro- and micro-morphological characteristics, and classical A. fumigatus via maximum grow temperature. Atypical strains were identified based on internal transcribed spacer of the rDNA gene (rDNA ITS) sequencing. Classic A. fumigatus was typed by CSP gene sequencing and subsequently analyzed with the international nomenclature. In vitro antifungal susceptibility to itraconazole (ITC), amphotericin B (AMB), voriconazole (VRC) and caspofun-gin (CAS) were determined by broth microdilution susceptibility test. Results All strains were identified as classic A. fumigatus complex with 16 genotypes. Type t04A, t03 and t01 were most common in our study. MICs of ITC w ere ≥4 μg/mL in 13 strains I-solated from 4 patients (3.2% ), two strains of which have MICs against AMB and VRC at 4 μg/mL and 16 (xg/mL, respectively. The highest MEC against CAS was 4 μg/mL in 1 strain. Conclusions No newly proposed A. fumigatus associated specie was found. All clinical isolates of classic A. fumigatus in clinical were divided into 16 CSP genotypes, five of which had not been reported previously. Genotype distribution was similar with literature. ITC resistance rate was 3. 2% inclassical A. fumigatus in China. Resistances to AMB, VRC and CAS exist in some isolates.%目的了解烟曲霉复合体临床株菌种分布,经典烟曲霉临床株CSP 基因型及对常见抗真菌药物敏感性状况.方法菌株来源:北京大学真菌和真菌病研究中心保存分离自125名患者的162株烟曲霉复合体菌株.通过形态学,最高生长温度及分子生物学测序分步鉴定；对CSP基因进行扩增、测序,采用国际化命名体系进行CSP分型；采用微量液基稀释法测定经典烟曲霉对伊曲康唑(ITC)、两性霉素B(AMB)、伏立康唑(VRC)及卡泊芬净(CAS)的敏感性.结果所有烟曲霉复合体菌株均为经典烟曲霉；共分为16个CSP基因型,最常见为t04A、t03和t01；分离自4名患者的13株菌对ITC的MICs≥4 μg/mL,其中2株菌AMB和VRC的MICa 分别为4μg/mL和16 μg/mL.CAS的MECs最高为4μg/mL,仅1株.结论未检出烟曲霉相关新种；经典烟曲霉临床株共16个CSP基因型,分布与国际研究结果基本一致,其中5个为新型.我国经典烟曲霉临床株ITC耐药率为3.2％,个别菌株AMB,VRC和CAS耐药.【期刊名称】《中国真菌学杂志》【年(卷),期】2011(006)006【总页数】5页(P328-331,336)【关键词】烟曲霉复合体;经典烟曲霉;鉴定;CSP分型;体外药敏试验【作者】高露娟;余进;李若瑜【作者单位】北京大学第一医院皮肤性病科真菌和真菌病研究中心,北京100034;北京大学第一医院皮肤性病科真菌和真菌病研究中心,北京100034;北京大学第一医院皮肤性病科真菌和真菌病研究中心,北京100034【正文语种】中文【中图分类】R379.6烟曲霉(Aspergillus fumigatus)是侵袭性曲霉病(IA)最主要的致病菌种，约占80%［1］。
真菌药敏试验简介
真菌体外药物敏感试验简介刘根焰，赵旺胜南京医科大学第一附属医院医学检验科/南京医科大学检验系, 南京 210029 随着移植、肿瘤和免疫缺陷患者的增多，侵袭性真菌感染（Invasive fungal infections ，IFI）病例也明显增加；随着临床真菌耐药性的出现，经验性抗真菌治疗越来越困难；随着新的抗真菌药物不断投入临床，传统的抗真菌药物敏感试验标准已难以覆盖。
诸多因素都要求临床微生物室真菌药物敏感试验能够与时俱进。
然而，当前国内临床微生物室真菌药物敏感试验开展的情况却不容乐观，首先表现在开展这项临床服务的实验室少，多局限于少数教学医院；其次，各个实验室采用的方法参差不齐，相互之间的结果可比性差。
为此，本文将介绍临床真菌药物敏感试验的标准参考方法和市场上关于真菌药物敏感试验的仪器和试剂，希望有助于各级医院临床真菌药物敏感试验的规范化开展。
1.真菌体外药物敏感试验的基本概念1.1 常见抗真菌药物介绍开展真菌药物敏感试验前提是了解抗真菌药物的基本知识，包括分类、作用机制及抗真菌特性，见表1[1]。
对于不能从上述特性中推断出药物敏感性结果的部分进行体外药物敏感试验。
表1 常见抗真菌药物简介分类代表药物作用机制抗真菌作用多烯类两性霉素B 直接和细胞膜上的麦角固醇结合，导致细胞膜对单价和二价阳离子的通透性增加而导致细胞死亡。
对念珠菌、隐球菌、球孢子菌、孢子丝菌、芽生菌、毛霉菌和大部分曲霉敏感，对土曲霉、构巢曲霉、Aspergillus fumigateaffinis 和Aspergillus lentulus天然耐药。
三唑类酮康唑氟康唑伊曲康唑伏立康唑通过抑制真菌细胞色素P450 依赖的-羊毛甾醇14α-去甲基化酶作用，导致麦角固醇合成受阻氟康唑抗菌谱窄,对大多数念珠菌、隐球菌有效，对曲霉无抑制活性,对克柔念珠菌天然耐药；伊曲康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲1泊沙康唑舍他康唑霉有抑制作用；伏立康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲霉、镰刀菌和其它透明丝孢霉有抑制作用；泊沙康唑抗菌谱最宽,对念珠菌,曲霉、镰刀菌、接合菌和其它透明丝孢有效；舍他康唑主要对皮肤癣菌和念珠菌抗菌活性较强烯丙胺类特比萘芬萘替芬抑制角鲨烯环氧化酶而干扰麦角固醇的生物合成。
曲霉菌药敏标准
曲霉菌药敏标准
曲霉菌药敏标准是指曲霉菌对不同药物的敏感程度，通过药敏试验得出曲霉菌对各种药物的敏感性和耐药性，从而指导临床医生选择合适的药物进行治疗。
曲霉菌对不同的药物敏感性不同，对于同一种药物，不同的曲霉菌株也可能存在差异。
药敏试验的方法有多种，其中纸片扩散法是最常用的方法。
在曲霉菌药敏标准中，一般将敏感程度分为三类：敏感（S）、中介（I）和耐药（R）。
对于敏感的药物，曲霉菌对其较为敏感，治疗时可以选择这类药物。
对于耐药的曲霉菌，选择的药物可能较少，需要结合患者的具体情况制定治疗方案。
由于曲霉菌的耐药性不断增加，对于某些曲霉菌株，可能已经出现了几乎全部耐药的情况。
因此，临床医生需要不断关注最新的药敏标准，以便及时调整治疗方案。
总之，曲霉菌药敏标准是指导临床治疗的重要依据，通过了解曲霉菌对不同药物的敏感性和耐药性，可以更好地选择治疗药物，提高治疗效果。
烟曲霉再鉴定、标准化CSP分型及体外药物敏感性
３ ８・ ２
中国真菌学杂志 ２ １ ０ １年 １ ２月 第 ６卷 第 ６期
Ｃ ｉ ｅｌＤ ｃｍ ｅ ０ １ Ｖ ｌ ， ｏ６ ｈｎＪＭｙｏ， ｅｅ ｂｒ １ ， ｏ ６ Ｎ ． ２
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论 著 ・
பைடு நூலகம்
烟 曲霉 再 鉴 定 、 准 化 Ｃ Ｐ分 型及 体 外 药 物 敏 感 性 标 Ｓ
高 露娟 余 进 李若 瑜 （ 京 大学 第一 医院皮 肤性 病科 真 菌和 真 菌病研 究 中心 ， 京 １０３ ） 北 北 ００４
，
ｆ ｍｇ ｔｓ ｉ ｍ ｍ ｇｏ ｍｐｒｔ ｅ ｔｐｃ ｓａｎ ｅｅｉｅｔｉ ａｅ ｎｉｔ ｎｌ ｒｎｃ ｂｄｓａｅ ｆ ｈ Ｄ Ａ ｇｎ ｕ ｉａｕ Ｖ ｍ￣ｉ ｕ ｒｗ ｔ ｅａ ｒ．Ａｙｉ￣ ｔ ｉｓｗ ｒ ｄｎｉｅ ｂｓｄｏ ｅ ａ ｔ ｓｒ ｅ ｐｃｒ ｅｒ Ｎ ｅ ｅ ａ ｅ ｕ ｒ ｆｄ ｎ ｒ ａ ｉ ｏｔ （Ｄ Ａ ＩＳ ｅｕｎ ｉ ．Ｃａｓ ．ｕ ｇ ｔｓ ａ ｐｄｂ Ｓ ｅｅｓｑ ｅｃ ｇａ ｄｓｂｅｕｎｌ ａａ ｚｄｗｔ ｅｉｔｒａ ｏａ ｒ Ｎ ）ｓｑｅ ｃ ｇ ｌｓ ｃ ｆ ｍｉａｕ ｓｔ ｅ ｙＣ Ｐｇｎ ｅｕ ｎｉ ｎ ｕｓｑ ｅｔ ｎｌ ｅ ｉ ｔ ｅｎｔ ｎｌ Ｔ ｎ ｉＡ ｗ ｙ ｎ ｙ ｙ ｈｈ ｎ ｉ ｎ ｍ ｎｌｔ ｅ Ｉ ｉｏ ｎｉ ｎａ ｓｓｅｔ ｉｔ ｔ ｉａｏａｏ ＩＣ） ａ ｈｔｒ ｉ （ ＭＢ ， ｏ ｃｎｚｌ Ｖ Ｃ ｎ ａｐｆｎ ｏ ｅｃａ ｒ． ｎｖ ｒ ａｔｕｇｌ ｕｃｐｉ ｌｙ ｏ ｔ ｃｎｚｌ Ｔ ， ｍｐ ｏ ｉ ｎＢ Ａ ） ｖｒ ｏａｏ ｕ ｔ ｆ ｂｉ ｒ ｅ（ ｅｃ ｉ ｅ（ Ｒ ）ａｄｅｓｏ — ｕ
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临床微生物学检验之药敏
页眉内容临床微生物学检验一、纸片扩散法又称Kirby-Bauer(K-B)法，由于其在抗菌药物的选择上具有灵活性，且花费低廉，被WHO 推荐为定性药敏试验的基本方法，已在临床广泛使用。
（一）实验原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中的水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
（二）培养基和抗菌药物纸片1、抗菌药物纸片选择直径为6.35mm，吸水量为20µl的专用药敏纸片，用逐片加样或侵泡方法使每片含药量达规定所示。
含药纸片密封贮存2~8℃或-20℃无霜冷冻箱内保存，β-内酰胺类药敏纸片应冷冻贮存，且不超过一周。
使用前将贮存容器移至室温平衡1~2小时，避免开启贮存容器时产生冷凝水。
2、培养基水解酪蛋白（Mueller-Hinton,M-H）培养基是CLSI采用的兼性厌氧菌和需氧菌药敏试验标准培养基，pH为7.2~7.4，对那些营养要求高的细菌如流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、链球菌等需加入补充物质。
琼脂厚度为4mm。
配置琼脂平板当天使用或置塑料密封袋中4℃保存，使用前应将平板置35℃温箱孵育15分钟，使其表面干燥。
（三）实验方法实验菌株和标准菌株接种采用直接菌落法或细菌液体生长法、用0.5麦氏比浊管标准的菌液浓度，校正浓度后的菌液应在15分钟内接种完毕。
操作步骤如下：1、接种用无菌棉拭子蘸取菌液，在管内壁将多余菌液旋转挤去后，在琼脂表面均匀涂抹接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板內缘涂抹一周。
2、贴抗菌药物纸片平板置室温下干燥3~5分钟，用纸片分配器或无菌镊子将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心相距》24mm，纸片距平板內缘》15mm，纸片贴上后不可再移动，因为抗菌药物会自动扩散到培养基内。
检验科微生物学常见病原体鉴定与检测方法
检验科微生物学常见病原体鉴定与检测方法微生物学是生物学的一个重要分支，研究微生物及其活动的一切规律，包括形态、结构、生理代谢、生殖方式以及微生物与环境相互作用等。
微生物学在医学检验科中起着重要的作用，可应用于疾病的诊断、病原体的鉴定与检测。
本文将介绍检验科微生物学常见病原体的鉴定与检测方法。
一、细菌的鉴定与检测方法细菌是常见的病原体之一，其鉴定与检测方法主要包括传统培养法、生物化学测试、抗生素敏感性试验、血清学检测以及分子生物学方法。
1. 传统培养法传统培养法是最常用的一种方法，其通过将样品在不同培养基上进行培养，观察细菌的生长形态、菌落特征以及生理代谢等，进而进行鉴定。
2. 生物化学测试生物化学测试是通过检测细菌在特定条件下的生化反应，从而进行鉴定的方法。
常用的生物化学测试包括氧需求量试验、酶活性测试、碳源利用能力测试等。
3. 抗生素敏感性试验抗生素敏感性试验用于确定细菌对不同抗生素的敏感性，常见的试验方法有纸片法、稀释法和电化学法等。
通过这些试验可以了解细菌的耐药性情况，为临床治疗提供指导。
4. 血清学检测血清学检测是通过检测患者体内产生的抗体来确定细菌感染的方法。
包括血清凝集试验、酶联免疫吸附法等，可以快速、准确地检测细菌感染。
5. 分子生物学方法分子生物学方法是近年来发展起来的一种快速、高效的细菌鉴定与检测方法。
包括PCR技术、实时荧光定量PCR技术、DNA测序等。
这些方法通过检测细菌的特异性基因序列，可以准确鉴定细菌种类及其数量。
二、病毒的鉴定与检测方法病毒是一类微生物，其鉴定与检测方法相对复杂，常见的方法包括免疫学检测、核酸检测、电镜观察等。
1. 免疫学检测免疫学检测是通过检测患者体内产生的抗体或抗原来确定病毒感染的方法。
包括酶联免疫吸附试验、免疫荧光试验等。
这些方法能够对病毒进行快速检测，但对检测样本的要求较高。
2. 核酸检测核酸检测是一种常用的病毒鉴定与检测方法，通过提取病毒核酸，利用PCR技术或实时荧光定量PCR技术等方法进行扩增和检测。
抗药敏实验报告结论(3篇)
第1篇本次实验旨在探究不同抗真菌药物对致病性外瓶霉的敏感性，为临床正确用药提供理论依据。
实验采用微量稀释法，对13株皮炎外瓶霉、17株甄氏外瓶霉、13株丛梗孢外瓶霉、10株棘状外瓶霉及4株威尼克外瓶霉进行药物敏感性测试，所研究的药物包括伊曲康唑、氟康唑、酮康唑、二性霉素B及5-氟胞嘧啶。
一、实验结果1. 致病性外瓶霉对不同抗真菌药物的敏感性存在差异。
2. 二性霉素B对各类外瓶霉的抑菌效果均较好，最小抑菌浓度（MIC）较低。
3. 伊曲康唑对各类外瓶霉的抑菌效果次之，MIC较二性霉素B略高。
4. 氟康唑对各类外瓶霉的抑菌效果较差，MIC较高。
5. 酮康唑对各类外瓶霉的抑菌效果最差，MIC最高。
6. 5-氟胞嘧啶对各类外瓶霉的抑菌效果与氟康唑相似，MIC较高。
二、结论1. 二性霉素B是治疗致病性外瓶霉感染的首选药物，具有较高的疗效和安全性。
2. 伊曲康唑可作为二性霉素B的替代药物，但在治疗过程中需密切监测病情变化。
3. 氟康唑和酮康唑对致病性外瓶霉的抑菌效果较差，不推荐作为首选药物。
4. 5-氟胞嘧啶可作为氟康唑和酮康唑的替代药物，但在治疗过程中需密切监测病情变化。
5. 在临床用药过程中，应根据患者的具体情况和病原菌的药物敏感性，合理选择抗真菌药物。
6. 本实验结果为临床抗真菌药物的应用提供了理论依据，有助于提高治疗效果，降低耐药性。
7. 在今后的研究中，可进一步探讨不同药物联合应用对致病性外瓶霉的抑制作用，以期为临床治疗提供更多选择。
8. 同时，应加强对病原菌耐药性的监测，及时发现并应对耐药性问题的出现。
总之，本次实验结果为临床抗真菌药物的应用提供了有益参考，有助于提高治疗效果，降低耐药性，为患者提供更好的医疗服务。
第2篇一、实验背景随着抗生素的广泛应用，细菌耐药性问题日益严重。
为了解我国致病菌的耐药情况，本研究采用微量稀释法，对某医院临床分离的13株皮炎外瓶霉、17株甄氏外瓶霉、13株丛梗孢外瓶霉、10株棘状外瓶霉及4株威尼克外瓶霉进行了抗真菌药物敏感性试验，旨在为临床合理用药提供依据。
传染病防治：肺曲霉病
传染病防治：肺曲霉病肺曲霉病(aspergillosis)是由各种曲霉所引起的肺部病变。
好发于免疫功能低下者，以侵袭性病变为主，可出现侵袭性肺曲霉病(急性或亚急性)、慢性肺曲霉病。
重度免疫功能低下如骨髓或器官移植、高强度化疗等患者，常引起严重的侵袭性肺曲霉病，病死率高达63%〜92%,但该病的早期诊断和积极治疗可明显提高患者的生存率。
(一)病原学曲霉属是一种腐生丝状真菌，广泛存在于自然环境中，易在土壤、水、食物、植物和空气中生存。
仅有无性期的曲霉属半知菌亚门、丝抱菌纲、丝匏菌目、丛梗抱科。
存在有性期的曲霉属子囊菌亚门，不整子囊菌纲、散囊菌目、散囊菌科。
目前已知曲霉属有300余种，其中致病性曲霉至少有20余种，临床菌株主要为烟曲霉(Afumigatus)、土曲霉(A.terreus)、黄曲霉(A.fIavus)、构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉(A.niger)等。
曲霉特征性结构为分生抱子头和足细胞，前者包括分生抱梗茎、顶囊、瓶梗、梗基和分生抱子,后者为转化的厚壁、膨化菌丝细胞。
分生抱子可大量释放到空气中，抱子直径为2〜10μm,容易悬浮在空气中并存活很长时间。
曲霉最适生长温度为25。
C〜3（TC,而致病性曲霉能在35。
C〜37。
C生长，烟曲霉耐热性更高，在40。
C〜50。
C也能生长，多数致病性曲霉繁殖力强，培养仅需36〜48小时，少数菌种则需数日或数周。
在培养基中均形成丝状菌落，菌落和分生抱子的形态、颜色，以及有性抱子的形态各不相同，常以此进行菌种的鉴定。
曲霉在组织内常见为无色分隔的菌丝，典型者呈45。
分枝，菌丝分隔有助于与接合菌相鉴别。
曲霉感染以烟曲霉最为常见，可引起各种类型的曲霉病。
通常，侵袭性肺曲霉病主要为烟曲霉、黄曲霉等。
曲霉球常由烟曲霉、黑曲霉等所致。
土曲霉偶可引起脑曲霉病。
变应性曲霉病的病原菌包括烟曲霉、黄曲霉、赭曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、土曲霉和棒状曲霉等。
黑曲霉以定植方式更为多见。
药物分析中的药物敏感性研究
药物分析中的药物敏感性研究随着科技的不断进步和医药领域的发展，药物研发和药物分析成为现代医药研究领域的重要组成部分。
在药物研发的过程中，药物敏感性研究是一个关键环节。
本文将从何为药物敏感性、药物敏感性研究的重要性以及常用的研究方法等方面展开讨论。
一、药物敏感性的定义与意义药物敏感性是指药物对于特定靶标或细胞系的作用效果。
在药物研发的早期阶段，通过评估药物的敏感性可以帮助研究人员筛选出有效的药物候选物，减少研发成本和时间。
药物敏感性研究通常包括对药物的体外和体内评价。
药物敏感性研究的意义在于：1. 指导药物研发：药物敏感性研究可以帮助研究人员筛选有效的药物候选物，提高药物研发成功的概率。
2. 个体化治疗：通过药物敏感性研究，可以确定患者对某种药物的敏感性，从而进行个体化治疗，提高治疗效果。
3. 防止耐药性发展：药物敏感性研究可以帮助研究人员了解药物对于细胞或靶标的作用效果，从而提高药物的选择性，减少耐药性的发展。
二、药物敏感性研究的常用方法1. 细胞实验：细胞实验是目前药物敏感性研究中最常用的方法之一。
通过将药物作用于特定细胞系，观察细胞的存活率或其他指标的变化，评估药物对细胞的作用效果。
2. 动物实验：动物实验是药物敏感性研究中的重要环节。
通过将药物给予实验动物，观察动物的生理指标、症状等变化，评估药物的疗效和毒性。
3. 体外实验：体外实验是指在离体条件下进行的实验，常用于药物的相互作用研究。
通过体外实验，可以了解药物与其他物质的相互作用情况，预测其在人体内的作用效果。
4. 分子生物学方法：分子生物学方法可以用于研究药物对细胞内分子的影响。
例如，通过PCR、Western blot等技术，可以观察药物对基因表达和蛋白质水平的调控作用。
5. 组织切片实验：组织切片实验是一种直接观察药物对组织的作用效果的方法。
通过将药物作用于组织切片，观察组织的形态学和生理学变化，评估药物的疗效和毒性。
三、药物敏感性研究的挑战与展望在药物敏感性研究中，存在许多挑战和困难。
EUCAST和CLSI微量稀释法检测曲霉体外药物敏感试验差异比较
EUCAST和CLSI微量稀释法检测曲霉体外药物敏感试验差异比较张明;陈菲;孙文逵;吴婷;颜文杰;苏欣;施毅【摘要】目的：比较欧洲抗菌药物敏感试验委员会（European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST）和美国临床实验室标准化协会（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）微量稀释法检测曲霉体外药物敏感性的差异。
方法分别用EUCAST方法和CLSI方法检测116株曲霉对两性霉素B、伏立康唑、伊曲康唑、卡泊芬净和米卡芬净的敏感性，比较两种方法的基本符合率、药敏符合率、极重大误差率和重大误差率。
结果 EUCAST方法和CLSI方法对116株曲霉药敏检测的基本符合率为96．3％～100％。
两方法检测烟曲霉对伏立康唑的药敏符合率98．8％，重大误差为1．2％，极重大误差率为0。
烟曲霉和黑曲霉对两性霉素B以及烟曲霉和黄曲霉对伊曲康唑的药敏符合率均为100％，重大误差率和极重大误差率均为0。
结论 EUCAST方法和CLSI方法对检测曲霉体外药物敏感性具有良好的一致性。
%Objective To compare the results of susceptibility testing by European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)and Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI)broth microdilution methods against Aspergillus isolates.Methods The susceptibilities of 116 Aspergillus isolates were determined for amphotericin B, voriconazole, itraconazole,caspofungin and micafungin according to EUCAST (E.DEF 9.1 )and CLSI (M38-A2)methods.The essential agreement (EA),categorical agreement (CA),very major errors (VME)and major errors (ME)of the two methods were compared.Results The EA was 96.3%-100% between the two methods.TheCA ,ME,and VME were 98.8%,0-1.2% and 0 respectively for the susceptibility of Aspergillus fumigatus to voriconazole.The CA,ME and VME was 1 00%,0 and 0 respectively for the susceptibility of Aspergillus fumigatus and Aspergillus niger to amphotericin B,or the susceptibility of Aspergillus fumigatus and Aspergillus flavus to itraconazole.Conclusions The results of susceptibility testing by EUCAST and CLSI broth microdilution methods are well consistent against Aspergillus isolates.【期刊名称】《中国感染与化疗杂志》【年(卷),期】2014(000)004【总页数】6页(P338-343)【关键词】曲霉;EUCAST;CLSI;最低抑菌浓度;最低有效浓度【作者】张明;陈菲;孙文逵;吴婷;颜文杰;苏欣;施毅【作者单位】南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院呼吸与危重症医学科，南京210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院呼吸与危重症医学科，南京210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院呼吸与危重症医学科，南京210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院呼吸与危重症医学科，南京210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院呼吸与危重症医学科，南京210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院呼吸与危重症医学科，南京210002;南京大学医学院临床学院南京军区南京总医院呼吸与危重症医学科，南京 210002【正文语种】中文【中图分类】R378近年来，随着免疫抑制治疗、化疗、骨髓移植及实体器官移植等增加，侵袭性曲霉病的发病率也随之上升。
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第三部分曲霉菌ＤＮＡ提取方法和真菌菌种保藏方法的初步探索………２３
第四部分实时荧光ＰＣＲ鉴定曲霉菌方法的建立及评价……………．．３４ 全文结论………………………………………………．．６８ 文献综述………………………………………………．．７０ 参考文献………………………………………………．．７７ 缩略词表………………………………………………．．８５ 论文列表………………………………………………．．８６ 个人简历………………………………………………．．８７
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曲霉、黄曲霉、黑曲霉、构巢曲霉种特异性探针Ｔｍ值分别为６１．４℃、５７．４℃、６７．７℃、 ６５．８℃，土曲霉特异性探针的Ｔｍ值为６４．５℃和５５．２℃。实时荧光ＰＣＲ方法对烟曲 霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉的检测下限分别为５６．８龟、１１１０龟、１３．７龟、 １２３龟、７８０龟。疣状瓶霉和小孢根霉能与烟曲霉特异性探针发生交叉反应。该方法 在每次重复实验中Ｔｍ值的波动在Ｏ．５℃以内。
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ＦｉｎａｌｌｙΒιβλιοθήκη 吐１ｅｔ０ ｓｐｅｃｉｅｓ ｌｅｖｅｌ ｂｙ廿ｌｅ ｐｒｏｂｅｓ’ｓｐｅｃｉ丘ｃ ｎｌｅｌｔｉｎｇ
【结果】形态学观察基本上能将临床常见的５种曲霉菌鉴定到种，对于其他种属形 态学可以将其鉴定到属的水平，但是较难鉴定到种。卡泊芬净对烟曲霉、黄曲霉、
构巢曲霉的ＭＩＣ９０均为Ｏ．０９４“ｇ枷，对黑曲霉的ＭＩＣ９０为Ｏ．１９ｐｇ／ｍｌ，在５种药物中最
低；泊沙康唑对土曲霉的ＭＩＣ９０最低，为０．０９４“咖ｌ；对于烟曲霉和黄曲霉，ＭＩＣ９０
【方法】对所收集的真菌通过形态学和／或分子生物学鉴定，采用浓度梯度法（Ｅ．ｔｅｓｔ） 测定伏立康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、两性霉素Ｂ及卡泊芬净对５种曲霉菌的最低 抑菌浓度（ＭＩＣ）；采用液氮研磨、试剂盒纯化方法提取曲霉菌细胞核ＤＮＡ，普通 ＰＣＲ方法扩增５种（４７株）曲霉菌的内转录间隔区（ＩＴＳ），测序获得ＩＴＳ区序列， 基于不同种曲霉菌的ＩＴＳ区序列对种特异性探针进行验证和改进，建立实时荧光 ＰＣＲ方法将常见曲霉菌通过特异性探针解链温度（Ｔｍ）的差异进行区分并对该方 法的灵敏度、特异性及重复性进行评价。
北京协和医学院硕士研究生学位论文
【结论】形态学结合ｒＤＮＡＩＴＳ区测序对真菌种的鉴定很有帮助。Ｅｔｅｓｔ法体外药敏 结果显示，新的棘白素类抗真菌药物卡泊芬净对五种曲霉具有很好的体外抗菌活 性，唑类药物对于曲霉菌的体外抗茵活性优于两性霉素Ｂ。采用固体培养＋液氮研 磨法＋试剂盒纯化法能获得高纯度的曲霉菌ＤＮＡ。实时荧光ＰＣＲ方法具有很好的灵 敏度、特异性和重复性，能将临床常见的５种曲霉鉴定到种的水平。
致 声
谢………………………………………………．．８９ 明………………………………………………．．９０
北京协和医学院硕士研究生学位论文
中文摘要
【目的】探讨临床常见曲霉菌（烟曲霉、黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、构巢曲霉） 对经典的抗真菌药物伏立康唑、伊曲康唑、两性霉素Ｂ和新的抗真菌药物泊沙康唑、 卡泊芬净的体外敏感性：建立应用实时荧光ＰＣＲ技术将临床常见曲霉菌鉴定至种 的水平。
【关键词】曲霉菌；鉴定：实时荧光ＰＣＲ；种特异性探针；解链曲线分析
２
北京协和医学院硕士研究生学位论文
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目录
中文摘要…………………………………………………１ 英文摘要…………………………………………………３
前 刖
言…………………………………………………５ 青…………………………………………………ｂ
第一部分菌株收集及鉴定……………………………………７ 第二部分抗真菌药物体外敏感性研究…………………………．１５
【Ｍｅｔｈｏｄｓ】ＦｕＩｌｇｉ
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