骨髓间充质干细胞治疗肠道疾病的研究进展

合集下载

CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响

■背景资料研究显示骨髓间充质干细胞(bone marrow- m e s e n c h y m a l stem cells, BM-MSCs)具有促进小肠缺血再灌注损伤的修复和增生作用, 但单纯输注BM-MSCs 存在到达受损部位数量及活性偏低等问题. 为提高受损组织内定向迁移BM-MSCs 的数量、增强其对受损组织的保护作用, 本研究目的是探讨趋化因子C X 3C 亚族是否在BM-MSCs 修复受损组织中发挥作用.曹毅, 尹明丽, 张博雅, 天津医科大学一中心临床学院天津市 300070刘涛, 宋红丽, 天津市第一中心医院器官移植科天津市器官移植重点实验室天津市 300192曹毅, 在读硕士, 主要从事消化系统疾病的研究.国家自然基金面上基金资助项目, Nos. 81270528, 81441022天津市应用基础及前沿技术研究计划(重点)基金资助项目, Nos. 11JCZDJC27800, 12JCZDJC25200天津市卫生局科技基金(攻关)资助项目, No. 2011KY11作者贡献分布: 此课题由宋红丽设计; 实验由曹毅完成, 刘涛、尹明丽及张博雅协助完成; 统计分析由曹毅完成; 论文撰写由曹毅完成; 论文审校由宋红丽完成.通讯作者: 宋红丽, 教授, 主任医师, 300192, 天津市南开区复康路24号, 天津市第一中心医院器官移植科, 天津市器官移植重点实验室*****************电话*************收稿日期: 2015-05-04 修回日期: 2015-07-02接受日期: 2015-07-13 在线出版日期: 2015-08-18Role of CX3CR1 in repair of injured intestinal epithelial cells by bone marrow mesenchymal stem cellsYi Cao, Tao Liu, Ming-Li Yin, Bo-Ya Zhang, Hong-Li SongYi Cao, Ming-Li Yin, Bo-Ya Zhang, the First Central Clinical College, Tianjin Medical University, Tianjin 300070, ChinaTao Liu, Hong-Li Song, Department of Organ Transplantation, Tianjin the First Central Hospital; Tianjin Key Laboratory of Organ Transplantation, Tianjin 300192, ChinaSupported by: National Natural Science Foundation of China, Nos. 81270528, 81441022; Tianjin Application and Advanced Technology Research Program, Nos. 11JCZDJC27800, 12JCZDJC25200; Science and Technology Foundation of Tianjin Municipal Health Bureau, No. 2011KY11Correspondence to: Hong-Li Song, Professor, Chief Physician, Department of Organ Transplantation, Tianjinthe First Central Hospital; Tianjin Key Laboratory of Organ Transplantation, 24 Fukang Road, Nankai District, Tianjin300192,**********************Received: 2015-05-04 Revised: 2015-07-02Accepted: 2015-07-13 Published online: 2015-08-18AbstractAIM: To investigate the role of chemokine receptor CX3CR1 in the repair of injured intestinal epithelial cells by bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs).METHODS: BM-MSCs were cultured and identified in vitro . Caco-2 cells were exposed to tumor necrosis factor alpha (TNF-α) to establish a cell model of injured intestinal epithelium. Cells were divided into six groups: BM-MSCs, Caco-2 cells, Caco-2 cells treated with TNF-α, co-cultured BM-MSCs and Caco-2 cells, co-cultured BM-MSCs and Caco-2 cells treated with TNF-α, and co-cultured BM-MSCs and Caco-2 cells treated with anti-CX3CR1 and TNF-α. The expression of tight junction proteins and mRNAs in Caco-2 cells, and CX3CR1 protein and mRNA in BM-MSCs was detected by immunofluorescence, Western blot and RT-PCR.RESULTS: We selected 100 ng/mL TNF-α for 48 h to establish the injured model, because the expression of zonula occluden 1(ZO-1) and Occludin was reduced significantly at this time point (P < 0.05). The protein and mRNA levels of ZO-1, Occludin and CX3CR1 had no significant changes when BM-MSCs were co-cultured with untreated Caco-2 cells, but increased when BM-MSCs were co-cultured with injured Caco-2CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响曹毅, 刘涛, 尹明丽, 张博雅, 宋红丽在线投稿: /wcjd/ch/index.aspx 帮助平台: /esps/helpdesk.aspx DOI: 10.11569/wcjd.v23.i23.3670世界华人消化杂志 2015年8月18日; 23(23): 3670-3682ISSN 1009-3079 (print) ISSN 2219-2859 (online)© 2015年版权归百世登出版集团有限公司所有.基础研究 BASIC RESEARCH®■同行评议者王阁, 教授, 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■研发前沿BM-MSCs 具有多向分化、免疫原性弱等优势, 已被广泛应用在组织修复、重建中, 但单纯输注BM-MSCs 存在数量和活性偏低问题, 如何提高BM-MSCs 修复受损组织的作用仍是目前研究的重点. 因此, 希望寻找特定基因能够增加受损组织内BM-MSCs 的定向迁移能力.cells (P < 0.05). Whe n CX3CR1 was blocked, the protein and mRNA levels of ZO-1 and Occludin decreased significantly.CONCLUSION: CX3CR1 participates in the repair of injured intestinal epithelial cells by BM-MSCs.© 2015 Baishideng Publishing Group Inc. All rights reserved.Key Words: Bone marrow mesenchymal stem cells; CX3CR1; Caco-2; Tight junction protein; Chemokine receptorCao Y, Liu T, Yin ML, Zhang BY, Song HL. Role of CX3CR1 in repair of injured intestinal epithelial cells by bone marrow mesenchymal stem cells. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2015; 23(23): 3670-3682 URL: /1009-3079/23/3670.asp DOI: /10.11569/wcjd.v23.i23.3670摘要目的: 探讨趋化因子受体C X3C R1对骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSCs)修复受损肠上皮细胞的影响.方法: 体外分离培养、鉴定BM-MSCs. 采用肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)处理结肠癌上皮细胞(colon adenocarcinoma epithelial cell line, Caco-2)建立肠上皮损伤模型. 实验分为6组: (1)单纯BM-MSCs 组; (2)单纯Caco-2组; (3)Caco-2+TNF-α组; (4)BM-MSCs+Caco-2组; (5)BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组; (6)anti-CX3CR1-BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组, 利用Transwell 培养板将各组共培养, 通过免疫荧光、Western blot 及荧光定量RT-PCR 方法检测Caco-2上ZO-1(zonula occluden 1)、Occludin 和BM-MSCs 上CX3CR1蛋白及mRNA 表达水平. 结果: 选择100 ng/mL TNF-α处理Caco-2细胞48 h 建立损伤模型后, 检测ZO-1和Occludin 表达水平明显降低(P <0.05). 在BM-MSCs 与未受损的Caco-2共培养时ZO-1、Occludin 和CX3CR1蛋白及mRNA 的表达不受影响, 而在BM-MSCs 与受损Caco-2共培养时, 其表达增加(P <0.05). 阻断CX3CR1后, ZO-1、Occludin 蛋白及mRNA 的表达与未阻断前相比明显减少(P <0.05).结论: CX3CR1参与BM-MSCs 对受损肠上皮的修复.© 2015年版权归百世登出版集团有限公司所有.关键词: 骨髓间充质干细胞; CX3CR1; Caco-2; 紧密连接蛋白; 趋化因子受体核心提示: 本文应用肿瘤坏死因子-α(t u m o r necrosis factor alpha)处理结肠腺癌Caco-2细胞, 成功建立肠黏膜上皮细胞损伤模型, ZO-1(zonula occluden 1)和Occludin 表达水平明显降低, 将BM-MSCs 和受损Caco-2共培养, ZO-1、Occludin 和CX3CR1蛋白及mRNA 的表达水平增加, 阻断CX3CR1后, ZO-1、Occludin 蛋白及mRNA 的表达与未阻断前相比明显减少, 揭示了CX3CR1能够参与骨髓间充质干细胞对受损肠上皮的修复作用.曹毅, 刘涛, 尹明丽, 张博雅, 宋红丽. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响. 世界华人消化杂志 2015; 23(23): 3670-3682 URL: http://www.wjgnet.com/1009-3079/23/3670.asp DOI: /10.11569/wcjd.v23.i23.3670 0 引言炎症性肠病、肝硬化、严重烧伤、缺血休克等疾病状态都会使肠道结构和功能遭到严重损害, 引发肠黏膜屏障功能障碍, 甚至全身炎症反应综合征和多器官功能障碍综合征等严重并发症[1-4]. 而在这些疾病的治疗中, 对于肠道的保护尤为重要. 研究[5,6]表明, 骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells, BM-MSCs)对受损肠上皮组织有修复、支持作用. 但其定向分化修复作用主要是在其到达受损位点的前提下发挥的. 由于受损部位释放细胞信号, 如趋化因子、选择素、整合蛋白和其他黏附分子可与间充质干细胞上的细胞信号受体结合, 促使其到达受损部位发挥治疗作用[7-12]. 其中趋化因子发挥重要作用. 趋化因子被分为C 、CC 、CXC 、CX3C 4个亚家族, 其受体对应为CR 、CCR 、CXCR 、CX3CR. 对于哪种趋化因子及其受体相互作用调控BM-MSCs 迁移到受损肠道组织发挥作用目前尚不清楚. 大量研究[13-15]指出, 当肠道组织受到炎性刺激时, CC 、CXC 亚族趋化因子及其配体会参与其中. 但关于CX3C 亚族及其配体是否发挥作用尚无报道. CX3C 类目前只发现CX3CRl-CX3CLl 存在, 而CX3CRl 表达■相关报道炎性介质导致肠黏膜间紧密连接处通透性增加的报道很多, 如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)能够通过激活核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)通路抑制ZO-1(zonula occluden 1)和Occludin的表达等, BM-MSCs 能够对异位肠道移植和肠道缺血灌注时造成的肠黏膜屏障损伤产生修复作用的研究也有报道, 但研究趋化因子在其中的作用较少.在BM-MSCs表面, 故本实验旨在探讨CX3CRl在BM-MSCs修复受损肠上皮细胞过程中是否发挥作用.1 材料和方法:1.1 材料实验动物选用SPF(Specific PathogenFree)级健康、♂Wistar大鼠, 体质量60-80 g, 购自军事医学科学院实验动物中心. Caco-2细胞株购自美国模式生物典藏中心(AmericanType Culture Collection, ATCC). DMEM/F12培养基、L-DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、胰蛋白酶/E D T A细胞消化液(Gibco, 美国)、胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(PAA, 奥地利); DMSO(Sigma-Aldrich,美国)、抗大鼠C D34-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)、CD29-PE、CD45-PE、CD90-FITC、RT1A-PE、RT1B-FITC(Biolegend, 美国)、Transwell小室(CORNING, 美国)、FACSCalibur流式细胞仪(BD, 美国)、重组人类肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor alpha, TNF-α)(PeProTech, 美国)、兔抗O c c l u d i n抗体、兔抗C X3C R l抗体、兔抗GAPDH抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(Abcam, 美国)、兔抗ZO-1(zonula occluden1)抗体(Invitrogen, 美国)、Western blot相关试剂购自武汉博士德; 山羊血清(索莱宝, 中国), RNAiso Plus RNA等提取相关试剂、PrimeScriPt Ⅱ第一链cDNA合成试剂盒及SYBR Premix Ex Taq Ⅱ荧光定量PCR试剂盒(TaKaRa, 日本), 荧光定量PCR仪(APPliedBiosystems 7300, 美国).1.2 方法1.2.1 BM-MSCs体外分离、培养及流式鉴定:Wistar大鼠处死, 取股骨和胫骨、减去骨骺,用含10%血清的DMEM/F12完全培养液反复冲洗骨髓腔, 制成单细胞悬液, 接种培养瓶中,37 ℃、50 mL/L CO2培养. 48 h换液, 去掉未贴壁细胞, 待细胞密度达到80%-90%融合时, 1∶2传代培养. 使用生长状况良好的第三代BM-MSCs进行后续实验.取生长良好的第三代BM-MSCs, 消化成单细胞悬液, 调整细胞浓度为106/m L, 加入荧光标记CD29-PE、CD45-PE、RT1A-PE、CD34-FITC、CD90-FITC、RT1B-FITC, 避光孵育30 min, 洗涤, 流式细胞仪检测这些表面标记的表达.1.2.2 BM-MSCs向脂肪细胞的诱导分化: 在100mL含10%血清的L-DMEM/F12培养液中, 加入200 mmol/L吲哚美辛50 μL, 0.5 mol/L 1-甲基-3-异丁基黄嘌呤100 μL, 40 U/mL胰岛素550 μL, 1mmol/L地塞米松100 μL, 配制成成脂诱导培养液. 将BM-MSCs接种在6孔板中培养. 待细胞生长稳定后, 更换为成脂诱导培养液培养, 每3 d换液. 8-12 d时, 用油红O染液染色, 显微镜下观察细胞浆内橘红脂滴着色.1.2.3 BM-MSCs向成骨细胞的诱导分化: 在100mL含10%血清的L-DMEM/F12培养液中, 加入1 mmol/L地塞米松10 μL, 1 mol/L甘油磷酸钠 1mL, 100 mg/mL维生素C 50 μL混匀, 调整pH值在7.3-7.4, 配制成成骨诱导培养液. 将BM-MSCs接种在6孔板中培养. 待细胞生长稳定后, 更换为成骨诱导培养液培养, 每3 d换液. 14 d左右,用Von Kossa染色试剂盒染色. 显微镜下观察黑色钙盐颗粒沉积.1.2.4 肠黏膜上皮损伤模型的建立: 用含10%血清的RPMI-1640完全培养液, 37 ℃、50 mL/LCO2培养Caco-2细胞. 隔天换液, 待细胞铺满80%以上瓶底时, 按1∶2传为二代细胞. 取状态良好的Caco-2细胞, 按5×105/孔接种于六孔板中, 培养24 h左右, 待细胞贴壁均匀、单层融合后, 分别加入终浓度为0、50、100和200 ng/mL的重组人TNF-α培养48 h, 以及使用100 ng/mL的重组人TNF-α分别培养0、12、24和48 h[16,17].利用免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1形态及表达, RT-PCR及Western blot技术检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的含量来判定肠黏膜上皮细胞的损伤程度. 探讨TNF-α的最佳处理浓度和处理时间. 不同批次细胞重复实验3次以上,验证肠黏膜上皮损伤模型的建立.1.2.5 Transwell小室BM-MSCs与Caco-2共培养:上面实验证实100 ng/mL TNF-α处理48 h为最佳处理条件. 实验分为6组: (1)单纯BM-MSCs组; (2)单纯Caco-2组; (3)Caco-2+TNF-α组(损伤组); (4)BM-MSCs+Caco-2组(共培养组);(5)BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组(损伤修复组);(6)anti-CX3CR1-BM-MSCs+Caco-2+TNF-α组(阻断组). 将Caco-2、TNF-α刺激后Caco-2以1×106个/孔分别置于六孔Transwell小室下层, BM-MSCs及预先以5 μg/mL anti-CX3CR1抗体室温孵育1 h的anti-CX3CR1-BM-MSCs 4×105曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■创新盘点本文发现体外BM-MSCs对受损肠黏膜屏障具有修复作用, 其中趋化因子受体CX3CRl参与此作用.个/孔分别置于Transwell小室上层, 培养24 h收集细胞, 提取蛋白和R N A, 实验方法参照文献[18].1.2.6 免疫荧光检测紧密连接蛋白ZO-1: 取接种了Caco-2细胞的玻片, PBS漂洗5 min×4次, 37 g/L甲醛固定15 min, PBS漂洗5 min×4次, 山羊血清封闭1 h, ZO-1(1∶50), 4 ℃湿盒过夜, PBS漂洗后加入FITC标记羊抗兔免疫荧光抗体, 37 ℃ 1 h, PBS漂洗, 甘油封片.1.2.7 荧光定量RT-PCR检测紧密连接ZO-1、Occludin mRNA和趋化因子受体CX3CR1 mRNA的表达: 收集细胞, 按照试剂盒说明书提取总RNA, 逆转录试剂盒反转录得到cDNA. 取1 μL cDNA加入20 μL的实时定量PCR反应体系, 反应条件: 95 ℃预变性30 s; PCR扩增(重复40个循环): 95 ℃ 5 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s; ZO-1和Occludin使用Human-β-actin, CX3CR1使用Rat-β-actin作为内参. 结果用2-△Ct值比较. 每组实验取不同批次细胞重复3次. PCR引物序列如表1.1.2.8 Western blot技术检测紧密连接ZO-1、Occludin和趋化因子受体CX3CR1的蛋白含量: 收集共培养细胞, 提取蛋白, BCA法测定蛋白浓度. ZO-1采用8%SDS-PAGE, Occludin、CX3CR1和内参GAPDH采用10%SDS-PAGE 电泳分离后湿转至NC膜, 5%脱脂奶粉封闭2 h, 一抗ZO-1(1∶400)、Occludin(1∶1500)、CX3CR1(1∶500)和GAPDH(1∶1000), 4 ℃孵育过夜, TBST洗膜, 二抗(1∶2000)室温孵育2 h, 洗膜, ECL曝光显色, 图像经AlPhaView分析软件进行灰度值测定. 通过计算每组样品的(目的蛋白条带亮度值-背景值)与对应(内参蛋白GAPDH条带亮度值-背景值)的比值, 得到校正后的目的蛋白的相对表达量. 以对照组的目的蛋白相对表达量为1, 比较各组间校正后的目的蛋白相对表达量的关系. 每组实验取不同批次细胞重复3次.统计学处理采用SPSS21.0统计软件分析, 数据以mean±SD的形式表示, 多组比较采用单因素方差分析, 而各组间的进一步两两比较采用t检验. P<0.05为差异具有统计学意义.2 结果2.1 BM-MSCs的提取、培养及流式鉴定提取的原代BM-MSCs细胞12 h后开始逐步贴壁, 随着换液和传代, 造血细胞等杂质细胞越来越少, 15 d左右传至第三代, 以均匀长梭形生长, 呈漩涡状或平行排列, 具有典型的MSCs形态特征(图1A, B).流式结果表明: 95.5%的细胞表达CD90而不表达CD45, 99.4%的细胞表达CD29而不表达CD34, 95.0%的细胞表达RT1A而不表达RT1B, 这说明我们提取的原代细胞培养至三代获得纯的BM-MSCs(图2).2.2 BM-MSCs向脂肪细胞和成骨细胞的诱导分化作为一种多能干细胞, BM-MSCs具有向多种组织细胞分化的能力, 我们分离得到的BM-MSCs在成脂或成骨诱导培养液中能分化为脂肪细胞或成骨细胞, 脂肪细胞油红O染液染色, 显微镜下观察到细胞浆内出现橘红脂滴(图1C); 成骨细胞Von Kossa染色试剂盒染色, 显微镜下观察到黑色钙盐颗粒沉积(图1D).1F: 上游引物, R: 下游引物.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■应用要点目前研究表明BM-MSCs虽然对损伤组织有修复作用, 但大多为其旁分泌发挥作用, 而其组织分化定向修复作用由于其只有少数到达受损部位而难以发挥, 本研究通过揭示趋化因子受体提高BM-MSCs对受损组织的保护作用, 为其应用临床治疗提供实验依据.2.3 采用TNF-α成功建立肠黏膜上皮损伤模型2.3.1 不同浓度(0、50、100及200 ng/mL)TNF-α处理Caco-2细胞: 免疫荧光检测ZO-1蛋白表达, 显微镜下ZO-1蛋白定位在细胞膜上, 0 ng/ mL TNF-α组ZO-1的绿色荧光比较明亮, 且连续完整, 细胞间构成蜘蛛网状形态. 随着50、100及200 ng/mL TNF-α浓度的增加, ZO-1荧光的亮度逐渐减弱, 且100和200 ng/mL TNF-α组出现细胞膜上ZO-1荧光的断裂及其完整性的破坏(图3). Western blot结果显示, 在225、59和37 kDa位置处依次出现ZO-1、Occludin 和GAPDH条带. 50、100及200 ng/mL组与0 ng/mL组相比, ZO-1蛋白的表达量逐渐减少(F= 293.36, P<0.05)、Occludin 蛋白的表达量亦逐渐减低(F= 216.73, P<0.05), 呈浓度依赖. PCR结果显示, 50、100及200 ng/mL组较0 ng/mL组, ZO-1 mRNA的表达量逐渐减少(F =ABCD图 1 BM-MSCs形态及诱导分化. A: BM-MSCs形态(×100); B: 未诱导分化(×200); C: 成脂诱导(×200), 油红O染色示细胞浆内出现橘红脂滴(箭头所示); D: 成骨诱导(×200), Von Kossa染色见黑色钙盐颗粒沉积(箭头所示). BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.CD9-FITC-ACD45-PE-A107106105104103102101101102103104 105 106 107Q1-UL95.5%Q1-LL1.0%Q1-UR3.5%Q1-LR0.0%RT1B-FITC-ART1A-PE-A107106105104103102101101102103104 105 106 107Q1-UL0.0%Q1-LL4.5%Q1-UR0.5%Q1-LR95.0%CD34-FITC-ACD29-PE-A107106105104103102101101102103104 105 106 107Q1-UL0.1%Q1-LL0.0%Q1-UR0.5%Q1-LR99.4%ABC图 2 BM-MSCs表面标记检测. A: CD45-PE, CD90-FITC; B: CD29-PE, CD34-FITC; C: RT1A-PE, RT1B-FITC. BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■名词解释紧密连接蛋白ZO-1: 为第一个紧密连接相关蛋白, 属于跨膜蛋白, 可以连接咬合蛋白Occludin 和肌动蛋白骨架的作用, 是构成肠黏膜上皮紧密连接的重要成分之一.140.00, P <0.05)、Occludin mRNA 的表达量也随之减少(F = 1196.65, P <0.05)(图4). mRNA 与蛋白水平结果一致, 而100 ng/mL 组与200 ng/mL 组对紧密连接蛋白的影响两者间差异无统计学意义, 所以我们选用100 ng/mL 为最终处理浓度.2.3.2 不同时间(0、12、24和48 h)100 ng/mL TNF-α处理Caco-2细胞: 使用TNF-α 100 ng/mL 处理Caco-2细胞12、24和48 h 后, 随着处理时间的延长, ZO-1免疫荧光亮度依次减弱, 蜘蛛网状形态破坏逐渐严重, 细胞间紧密连接蛋白排列不规则甚至断裂(图5). Western blot 证实, 100 ng/mL TNF-α处理12、24和48 h 组与0 h 组相比, ZO-1(F = 115.49, P <0.05)和Occludin 蛋白(F = 86.12, P <0.05)的表达受抑制, 呈时间依赖. PCR 检测结果提示, ZO-1(F = 35.73, P <0.05)和Occludin mRNA(F = 17050.91, P <0.05)的表达量均减少, 且处理时间越长减少越明显, 差异有统计学意义(图6). 这些结果表明肠黏膜上皮损伤模型建立成功, 而TNF-α 100 ng/mL 处理48 h 为我们选用的最佳处理条件.2.4 观察BM-MSCs 对受损Caco-2的影响 BM-MSCs 与Caco-2共培养对ZO-1、Occludin 的表达无影响. 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, ZO-1、Occludin 蛋白的表达量较受损Caco-2组均增加(t = 12.77, P <0.05; t = 14.71,P <0.05); ZO-1、Occludin mRNA 的表达量也均增加(t = 7.40, P <0.05; t = 13.02, P <0.05). 该结果提示BM-MSCs 对受损Caco-2有修复作用(图7).2.5 观察趋化因子受体CX3CR1对BM-MSCs 修复受损Caco-2的作用与单纯BM-MSCs 组比较, BM-MSCs 与Caco-2共培养时, CX3CR1蛋白和mRNA 的表达水平轻微增加, 但差异无统计学意义; 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, CX3CR1蛋白表达增加(t = 19.81, P <0.05), CX3CR1 mRNA 的表达水平也明显增加(t = 12.27, P <0.05). 结果提示CX3CR1参与BM-MSCs 修复受损Caco-2的过程.观察阻断CX3CR1的结果: Anti-CX3CR1-BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, ZO-1、Occludin 蛋白的表达量较阻断前相比减少(t = 4.98, P <0.05; t = 3.02, P <0.05), 但高于受损Caco-2组的表达量(t = 11.81, P <0.05; t = 14.92,P <0.05). 而ZO-1、Occludin mRNA 的表达量较阻断前相比减少(t = 4.37, P <0.05; t = 10.55, P <0.05), 但高于受损Caco-2组的表达量(t = 4.89, P <0.05; t = 4.66, P <0.05). 这个结果说明阻断CX3CR1影响BM-MSCs 对受损Caco-2的修复(图8).图 3 不同浓度TNF-α作用48 h时Caco-2细胞的ZO-1蛋白免疫荧光表达情况(×200). A: 0 ng/mL; B: 50 ng/mL; C: 100 ng/mL; D: 200 ng/mL. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α. 箭头示ZO-1蛋白.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响■同行评价本文探讨趋化因子受体CX3CR1对BM-MSCs 修复受损肠上皮细胞的影响, 整个课题工作量大, 具有一定创新性结果.m R N A 相对表达量TNF-α浓度(ng/mL)0 50 100 200 kDa蛋白相对表达量1.00.80.60.40.20.0TNF-α浓度(ng/mL)ZO-1OccludinGAPDH2255937TNF-α浓度(ng/mL)R n 6.0225.0224.0223.0222.0221.0220.022TNF-α浓度0 ng/mL50 ng/mL 100 ng/mL200 ng/mL Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberD e r i v a t i v e0.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃R n6.9295.9294.9293.9292.9291.9290.929-0.071TNF-α浓度0 ng/mL50 ng/mL100 ng/mL200 ng/mLRn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberD e r i v a t i v e1.0000.8000.6000.4000.2000.000-0.200溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃1.21.00.80.60.40.20.0A B CDEFG 图 4 不同浓度TNF-α作用48 h下ZO-1和Occludin蛋白及mRNA的表达水平. A: ZO-1和Occludin的Western blot条带; B: ZO-1和Occludin蛋白的相对表达量; C: ZO-1 PCR扩增曲线; D: ZO-1 PCR溶解曲线; E: Occludin PCR扩增曲线; F: Occludin PCR溶解曲线; G: ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量. a P <0.05 vs 0 ng/mL组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响3 讨论各种炎症、应激、缺血缺氧、肠道肿瘤放化疗处理都会导致肠上皮损伤, 肠上皮的损伤主要表现在肠黏膜屏障受损. 肠黏膜屏障由机械屏障、免疫屏障、化学屏障及生物屏障四部分构成. 其中机械屏障在维护肠道功能上起着至关重要的作用. 紧密连接是机械屏障的重要组成部分, 主要有ZO-1、Occludin 、肌动蛋白β、咬合蛋白、钙黏蛋白等[17]. Caco-2细胞具有微绒毛和紧密连接结构, 类似于分化的人小肠黏膜上皮细胞, 被广泛用于肠道的功能研究[19].研究[16,20]显示, 炎性介质TNF-α能够通过激活核因子-κB(nuclear factor-κB, NF-κB)引起MLCK 肌球蛋白酶表达增加及其轻链磷酸化; 抑制ZO-1和Occludin mRNA 表达, 导致肠黏膜间紧密连接处通透性增加. 本研究利用50、100及200 ng/mL TNF-α作用Caco-2细胞48 h 以及100 ng/mL TNF-α作用Caco-2细胞0、12、24和48 h 构建肠上皮损伤模型. 将紧密连接蛋白作为观察对象, 探讨TNF-α的最佳处理浓度和时间. 我们的结果提示随着TNF-α刺激时间的延长以及刺激浓度的增高, 紧密连接蛋白ZO-1和Occludin mRNA 和蛋白表达降低, 荧光显示出明显断裂. 当100 ng/mL TNF-α刺激48 h 时,紧密连接蛋白的损伤已十分明显、且稳定, 并与200 ng/mL TNF-α刺激效果无明显差异, 所以我们选用100 ng/mL TNF-α处理48 h 构建稳定的肠上皮细胞炎性损伤模型.间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是属于中胚层的一类具有高度自我更新和多向分化潜能的干细胞, 广泛分布于全身多种组织, 以骨髓中含量最高. BM-MSCs 在病灶部位能定向分化为软骨细胞[21]、骨骼肌和心肌细胞[22]、神经细胞[23]、肝细胞[24,25]等, 在肝纤维化[26]、急性胰腺炎[27]等多系统疾病治疗中发挥作用. 有研究[6]表明, BM-MSCs 可以对异位肠道移植和肠道缺血灌注时造成的肠黏膜屏障损伤产生修复作用. 但是BM-MSCs 的定向分化修复作用是在其到达受损部位的前提下发挥的. 其中趋化因子及其受体的作用对于BM-MSCs 的迁移至关重要[28-31]. 趋化因子是一类由蛋白质组成的小分子多肽, 目前已发现50余种趋化因子以及20种趋化因子受体[32]. CX3CRl 作为一种趋化因子受体, 表达在BM-MSCs 表面, 能够促使间充质干细胞迁移到受损脑组织、胰腺组织发挥作用[33,34]. 我们为研究CX3CRl 在BM-MSCs 修复受损肠上皮中所发挥的作用, 采用Transwell 小室建立体外趋化迁移模型, 发现BM-MSCs 与Caco-2共培图 5 100 ng/mL TNF-α作用下不同时间点Caco-2细胞的ZO-1蛋白表达情况(×200). A: 0 h; B: 12 h; C: 24 h; D: 48 h. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α. 箭头所示为细胞ZO-1蛋白表达情况.曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响养, 不会对Caco-2上ZO-1和Occludin 的表达造成影响. 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后,R n 6.1945.1944.1943.1942.1941.1940.194TNF-α处理时间0 h12 h24 h48 h Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberR n6.9295.929 4.9293.9292.9291.9290.929-0.071TNF-α处理时间0 h12 h24 h48 hRn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberD e r i v a t i v e1.0000.8000.6000.4000.2000.000-0.200溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃D e r i v a t i v e 0.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃m R N A 相对表达量t /h1.21.00.80.60.40.20.0蛋白相对表达量t /h1.00.80.60.40.20.0图 6 100 ng/mL TNF-α处理不同时间下的ZO-1和Occludin蛋白及mRNA的表达水平. A: ZO-1和Occludin的Western blot 表达; B: ZO-1和Occludin蛋白的相对表达量; C: ZO-1 PCR扩增曲线; D: ZO-1 PCR溶解曲线; E: Occludin PCR扩增曲线; F: Occludin PCR溶解曲线; G: ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量. a P <0.05 vs 0 h组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α.0 12 24 48 k DaTNF-α处理时间(h)ZO-1Occludin GAPDH 2255937AB CD EFG 曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响分组 1组 2组 3组 4组 5组R n6.1855.1854.1853.1852.1851.1850.185Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle Number分组1组 2组 3组 4组 5组R n6.9295.9294.9293.9292.9291.9290.929-0.071Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle NumberDe r i v a t i v e0.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃D e r i v a t i v e1.0000.8000.6000.4000.2000.000-0.200溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃蛋白相对表达量分组1.21.00.80.60.40.20.0m R N A 相对表达量分组1.21.00.80.60.40.20.0图 7 各个实验组中Caco-2细胞的ZO-1、Occludin蛋白和mRNA的表达. A: ZO-1和Occludin的Western blot条带; B: ZO-1和Occludin蛋白的相对表达量; C: ZO-1 PCR扩增曲线; D: ZO-1 PCR溶解曲线; E: Occludin PCR扩增曲线; F: Occludin PCR溶解曲线; G: ZO-1和Occludin mRNA的相对表达量. 1: Caco-2对照组; 2: Caco-2+BM-MSCs共培养组;1 2 3 4 5 kDaZO-1GAPDH Occludin GAPDH 225375937AB CD EFG 曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响ZO-1和Occludin 的表达增加, 提示BM-MSCs 对受损Caco-2有修复作用. 对于CX3CRl, BM-MSCs 与Caco-2共培养对其表达无影响. 而BM-MSCs 与受损Caco-2共培养后, CX3CRl 表达增加. 该结果提示CX3CRl 参与BM-MSCs 趋化迁移到受损肠上皮模型处发挥修复作用. 为进一步验证CX3CRl 的作用, 我们使用anti-CX3CRl 抗体预处理BM-MSCs 后再与受损Caco-2共培养, 此时ZO-1和Occludin 的表达较未封闭CX3CRl 前减低, 进一步验证CX3CRl 参与BM-MSCs 趋化迁移修复受损肠道组织的过程. 但是本实验尚存在不足. CX3CRl 被封闭后, ZO-1和Occludin 的表达量仍比受损Caco-2组表达增加. 这个结果提示: (1)我们没有完全封闭BM-MSCs 上CX3CRl 的表达. 接下来我们将继续探讨CX3CRl 的封闭浓度和时间; (2)由于封闭CX3CRl 不能完全阻断BM-MSCs 对受损肠上皮的修复, 提示尚存在其他细胞信号参与BM-MSCs 对受损肠上皮的修复.本研究发现CX3CRl 在BM-MSCs 体外修图 8 BM-MSCs表面趋化因子受体CX3CR1的表达水平. A: CX3CR1的Western blot条带; B: CX3CR1蛋白的相对表达量; C: CX3CR1 PCR扩增曲线; D: CX3CR1 PCR溶解曲线; E: CX3CR1 mRNA的相对表达量. 1: BM-MSCs对照组; 2: BM-MSCs+Caco-2共培养组; 3: BM-MSCs+Caco-2+TNF-α损伤修复组. a P <0.05 vs 对照组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.A B E R n 6.9135.9134.9133.9132.9131.9130.913-0.087Rn vs Cycle5 10 15 20 25 30 35 40Cycle Number分组1组2组3组D e r i v a t i v e0.8000.7000.6000.5000.4000.3000.2000.1000.000-0.100溶解曲线60 65 70 75 80 85 90 95温度/℃C X 3C R 1蛋白表达量43210分组C X 3C R 1 m R N A 表达量1284分组3: Caco-2+TNF-α损伤组; 4: Caco-2+TNF-α+BM-MSCs损伤修复组; 5: Caco-2+TNF-α+anti-CX3CR1-BM-MSCs 阻断组. a P <0.05 vs 损伤组; c P <0.05 vs 损伤修复组. TNF-α: 肿瘤坏死因子-α; BM-MSCs: 骨髓间充质干细胞.1 2 3 kDaCX3CR1GAPDH 5037CD曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响复受损肠上皮模型中的作用, 为我们临床上促进移植BM-MSCs到达受损肠道组织从而提高治疗效果提供线索. 但在体内是否存在类似作用, 还有哪些细胞信号参与肠黏膜损伤下间充质的修复, 这将是我们接下来研究的方向.志谢: 感谢天津市器官移植重点实验室为我提供科学研究的平台.4 参考文献1 Lee SH. Intestinal permeability regulation bytight junction: implication on inflammatorybowel diseases. Intest Res2015; 13: 11-18 [PMID:25691839 DOI: 10.5217/ir.2015.13.1.11]2 Kalaitzakis E. Gastrointestinal dysfunction inliver cirrhosis.World J Gastroenterol2014; 20:14686-14695 [PMID: 25356031 DOI: 10.3748/wjg.v20.i40.14686]3 Hu S, Lin ZL, Zhao ZK, Liu R, Ma L, Luo HM,Zhou FQ, Bai XD. Pyruvate Is Superior to Citratein Oral Rehydration Solution in the Protectionof Intestine via Hypoxia-Inducible Factor-1Activation in Rats With Burn Injury.JPEN JParenter Enteral Nutr2015 Mar 23.[Epub ahead ofprint] [PMID: 25802304 DOI: 10.1177/0148607115577817]4 Yadav VR, Hussain A, Sahoo K, Awasthi V.Remediation of hemorrhagic shock-inducedintestinal barrier dysfunction by treatment withdiphenyldihaloketones EF24 and CLEFMA. JPharmacol Exp Ther2014; 351: 413-422 [PMID:25204337 DOI: 10.1124/jpet.114.217331]5 Shen ZY, Zhang J, Song HL, Zheng WP. Bone-marrow mesenchymal stem cells reduce ratintestinal ischemia-reperfusion injury, ZO-1downregulation and tight junction disruptionvia a TNF-α-regulated mechanism. World JGastroenterol 2013; 19: 3583-3595 [PMID: 23801859DOI: 10.3748/wjg.v19.i23.3583]6 Zhang W, Shen ZY, Song HL, Yang Y, WuBJ, Fu NN, Liu T. Protective effect of bonemarrow mesenchymal stem cells in intestinalbarrier permeability after heterotopic intestinaltransplantation. World J Gastroenterol 2014; 20:7442-7451 [PMID: 24966614 DOI: 10.3748/wjg.v20.i23.7442]7 Chen J, Li Y, Wang L, Zhang Z, Lu D, Lu M,Chopp M. Therapeutic benefit of intravenousadministration of bone marrow stromal cells aftercerebral ischemia in rats. Stroke 2001; 32: 1005-1011[PMID: 11283404]8 Horwitz EM, Gordon PL, Koo WK, Marx JC, NeelMD, McNall RY, Muul L, Hofmann T. Isolatedallogeneic bone marrow-derived mesenchymalcells engraft and stimulate growth in childrenwith osteogenesis imperfecta: Implications for celltherapy of bone. Proc Natl Acad Sci U S A 2002; 99:8932-8937 [PMID: 12084934 DOI: 10.1073/pnas.132252399]9 Wu GD, Nolta JA, Jin YS, Barr ML, Yu H, StarnesVA, Cramer DV. Migration of mesenchymal stemcells to heart allografts during chronic rejection.Transplantation 2003; 75: 679-685 [PMID: 12640309DOI: 10.1097/01.TP.0000048488.35010.95]10 Lawton B, Boyette JR, Hu M, Lian TS. Selectinblockade decreases postischemic recruitment ofbone marrow stromal cells. Laryngoscope2013;123: 2993-2995 [PMID: 23712829 DOI: 10.1002/lary.24217]11 王艳国, 赵岳, 李喜梅, 唐博, 褚亚男, 刘元林, 朱恒,张毅. 细胞间粘附分子-1在小鼠间充质干细胞体外迁移中的作用及其机制. 中国实验血液学杂志 2014;22: 479-48412 Ji JF, He BP, Dheen ST, Tay SS. Interactions ofchemokines and chemokine receptors mediatethe migration of mesenchymal stem cells tothe impaired site in the brain after hypoglossalnerve injury. Stem Cells 2004; 22: 415-427 [PMID:15153618 DOI: 10.1634/stemcells.22-3-415]13 Papadakis KA, Targan SR. The role of chemokinesand chemokine receptors in mucosal inflammation.Inflamm Bowel Dis 2000; 6: 303-313 [PMID: 11149563]14 Yang SK, Eckmann L, Panja A, Kagnoff MF.Differential and regulated expression of C-X-C,C-C, and C-chemokines by human colon epithelialcells. Gastroenterology 1997; 113: 1214-1223 [PMID:9322516]15 Kim JM, Kim JS, Jun HC, Oh YK, Song IS, KimCY. Differential expression and polarizedsecretion of CXC and CC chemokines by humanintestinal epithelial cancer cell lines in responseto Clostridium difficile toxin A. Microbiol Immunol2002; 46: 333-342 [PMID: 12139393]16 宋红丽, 吕飒, 马力, 李颖, 刘沛. TNF-α影响肠黏膜上皮细胞间紧密连接蛋白的表达. 世界华人消化杂志 2004; 12: 1303-130617 He F, Peng J, Deng XL, Yang LF, Camara AD,Omran A, Wang GL, Wu LW, Zhang CL, YinF. Mechanisms of tumor necrosis factor-alpha-induced leaks in intestine epithelial barrier.Cytokine2012; 59: 264-272 [PMID: 22583690 DOI:10.1016/j.cyto.2012.04.008]18 朱洁, 周华东. Fractalkine/CX3CR1参与骨髓间充质干细胞向缺血脑组织定向迁移的实验研究. 解放军医药杂志 2014; 26: 38-4219 Lodemann U, Strahlendorf J, Schierack P,Klingspor S, Aschenbach JR, Martens H. Effectsof the Probiotic Enterococcus faecium andPathogenic Escherichia coli Strains in a Pig andHuman Epithelial Intestinal Cell Model. Scientifica(Cairo) 2015; 2015: 235184 [PMID: 25883829 DOI:10.1155/2015/235184]20 Song HL, Lv S, Liu P. The roles of tumor necrosisfactor-alpha in colon tight junction proteinexpression and intestinal mucosa structure in amouse model of acute liver failure. BMC Gastroenterol2009; 9: 70 [PMID: 19772664 DOI: 10.1186/1471-230X-9-70]21 Snyder TN, Madhavan K, Intrator M, Dregalla RC,Park D. A fibrin/hyaluronic acid hydrogel for thedelivery of mesenchymal stem cells and potential forarticular cartilage repair. J Biol Eng 2014; 8: 10 [PMID:25061479 DOI: 10.1186/1754-1611-8-10]22 Galli D, Vitale M, Vaccarezza M. Bone marrow-derived mesenchymal cell differentiation toward曹毅, 等. CX3CR1对骨髓间充质干细胞修复受损肠上皮细胞的影响。

间充质干细胞治疗放射性肠损伤研究进展

间充质干细胞治疗放射性肠损伤研究进展放射性肠损伤属于急性放射病的一种，也是腹部肿瘤采用放射治疗后导致的严重并发症之一，当前临床上对于放射性肠损伤尚无有效措施进行治疗。

因此，研究出全新的防治策略，可使患者的预后得以有效改善，生活质量得以有效提高。

间充质干细胞属成体多能干细胞，试验药理学研究结果显示，间充质干细胞能够对放射性肠损伤进行有效治疗。

本文就对放射性肠损伤采用间充质干细胞进行治疗的效果及间充质干细胞发挥疗效的机制的研究进展进行综述。

标签：间充质干细胞；放射性肠损伤；生物疗法随着科技水平的不断提高，当前核能技术不只应用于军事上，在其他很多生活领域，比如科研、医疗、工农业生产等都得到了有效应用[1]。

当人体受到核辐射时，会导致机体出现放射性损伤。

尤其是恶性肿瘤患者，进行放射治疗，效果较好且花费较低，临床应用率高。

有关研究表明，患有癌症的患者在其疾病治疗过程中，需要采取放射治疗的患者比例超过70%[2]。

在采用放射治疗的过程中，由于受到射线的照射，机体必定会受到损害，形成放射性损伤[3]。

由放射性损伤导致的并发症中，放射性胃肠病十分常见，占所有并发症发生数量的80%左右[4]。

由于人体肠黏膜上皮生长代谢十分活跃，因此对于受到的电离辐射，所表现出的敏感性也最高，这也导致放射性损伤中最为主要的受损部位就是肠道。

1 间充质干细胞的特点间充质干细胞属于成体多能干细胞，其来源十分广泛，同时很容易在体外对其进行分离、培养、扩增，增殖潜能十分巨大，间充质干细胞能够分化为多种类型的细胞；能够对多种细胞因子进行分泌，从而对多种免疫细胞进行调节；并且间充质干细胞还能向损伤组织迁移归巢[5]。

国际细胞移植学会对间充质干细胞的定义为：可黏附于塑料培养皿上贴壁生长，具备分化为软骨细胞、成骨细胞，以及脂肪细胞的能力，细胞表面抗原表型CD14或CD11b，CD19或CD79α、CD34、CD45和HLA-DR为阴性，CD73、CD90和CD105为阳性[6]。

溃疡性结肠炎现代医学研究进展

溃疡性结肠炎现代医学研究进展陈文华;黄国栋;方承康【摘要】3ZA WHO溃疡性结肠炎直结肠慢性非特异性炎症性疾病,多呈反复发作的慢性病程.现代难治病之一.本病治疗难度大,与结肠癌的发病有关,被WHO列为现代难治病之一.目前溃疡性结肠炎的治疗手段多样,出现了许多新技术如生物靶向治疗、干细胞移植等,现将近年溃疡性结肠炎现代医学研究进展进行综述.【期刊名称】《中国医药科学》【年(卷),期】2011(001)007【总页数】3页(P51-53)【关键词】溃疡性结肠炎;现代医学;研究进展;综述【作者】陈文华;黄国栋;方承康【作者单位】南昌大学第一附属医院,江西,南昌,330006;南昌大学第一附属医院,江西,南昌,330006;南昌大学第一附属医院,江西,南昌,330006【正文语种】中文【中图分类】R574.6溃疡性结肠炎（UC）是一种直肠和结肠慢性非特异性炎症性疾病，病因尚不十分清楚，临床表现为腹泻、黏液脓血便、腹痛等。

病情轻重不等，多呈反复发作的慢性病程。

本病治疗难度大，与结肠癌的发病有一定关系。

目前UC的治疗主要以中西医结合为主，手段多样，内治外治相结合。

现代医学以氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制剂三大类药物治疗为主，重视新技术的开发研究，出现了新技术如生物靶向治疗、干细胞移植等。

1 药物治疗1.1 氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制剂传统治疗以氨基水杨酸、类固醇激素、免疫抑制剂三大类药物为主。

其中水杨酸类药物中5-氨基水杨酸（5-ASA）副作用小，逐渐取代水杨酸偶氮磺胺吡啶（SASP）成为治疗轻中度UC的首选；免疫抑制剂主要用于前二者治疗无效的重症病例，可缓解病情，但易发生严重不良反应，使用时需掌握剂量。

我国国产5-氨基水杨酸肠溶片治疗研究协作组采用5-ASA肠溶片治疗UC65例与SASP组64例对照，结果两组总有效率相仿，分别为70.05%、67.79%；5-ASA 肠溶片的完全缓解率较SASP高，分别为29.51%、13.31%；不良反应发生率较低，分别为11.48%、23.33%[1]。

人羊膜间充质干细胞的研究进展

种因素的影响产生不了这么多的细胞。
原代ｈＡＭＳＣｓ呈梭形、星形或多角形，进行传代培养后，细胞表现为成纤维细胞样克隆，呈细长的梭
形，排列紧密，多呈放射状或漩涡状贴壁生长。电镜
观察发现，ｈＡＭＳＣｓ平均大小许多和肠道上皮细胞不一样的微绒毛，胞浆
内含有丰富的中间丝，脂质小滴和空泡也比较常见，
含有中等量的高尔基复合体、粗面内质网、线粒体和致密体，胞浆周围有自噬空泡和胞饮小泡，细胞或突
细胞表面标记物ＳＳＥＡ－４、ＯＣＴ－４，而ＯＣＴ－４被认为是多能干细胞自我更新和多项分化潜能的基因。进行定向诱导并检测是文献报道常用的鉴定干细胞的方法 …，一般对细胞进行成骨成脂诱导，经成骨
将其作为替代细胞移植治疗各种疾病，并且取得了较好的临床效果。本文就ｈＡＭＳＣｓ的分离培养、生物学特性、分化潜能、致瘤性及临床前研究等进展进行综述。
［关键词］人羊膜间充质干细胞；生物学特性；临床前研究；干细胞
口腔生物医学２０１３年６月（第４卷第２期）ＯｒａｌＢｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏ１．４，Ｎｏ．２，Ｊｕｎ．２０１３
・
９５・

万能热点——间充质干细胞的研究套路

万能热点——间充质⼲细胞的研究套路在间充质⼲细胞这么⽕，申请基⾦有套路吗？⼀⽂中，我们总结了间充质⼲细胞研究最常见的间充质⼲细胞结合外泌体（外泌体（exosome）和⾮编码RNA，⽽且间充质⼲细胞可以⽤于各模式：间充质⼲细胞个系统疾病的损伤修复，包括：H0605（⾻、关节、软组织损伤与修复），H0203（⼼肌细胞/⾎管细胞损伤、修复、重构和再⽣），H1511（急重症医学/创伤/烧伤/整形其他科学问题），H0910（脑、脊髓、周围神经损伤及修复），H1505（烧伤）和H2902（中西医结合临床基础）。

我们看⼀下间充质⼲细胞⽤于治疗各种疾病的临床试验研究（数据来源于）的情况：以间充质⼲细胞（mesenchymal stem cell）为关键词，我们共检索到616项研究：其中关节炎48项，移植物抗宿主病26项，糖尿病25项，脊髓损伤22项，多发性硬化21项，肝硬化17项，肌萎缩性脊髓侧索硬化症15项，克罗恩病14项，严重肢体缺⾎11项，肝衰竭10项，中风10项⽬。

下⾯我们就承接前⾯的⽂章继续挑选⼏篇⽂章介绍套路：1.MicroRNA cluster miR-17-92 Cluster in Exosomes Enhance Neuroplasticity and Functional Recovery After Stroke in Rats.Stroke（IF 6.0）. 2017 Mar;48(3):747-753.间充质⼲细胞治疗中风的功能和机制研究：间充质⼲细胞通过外泌体中miR-17-92调控PTEN 间充质⼲细胞治疗中风的功能和机制研究表达从⽽激活PI3K/Akt/mTOR 通路调控神经元可塑性，并促进中风后功能恢复。

2. Exosomes derived from miR-122-modified adipose tissue-derived MSCs increase chemosensitivity of hepatocellular carcinoma.J Hematol Oncol（IF 6.3）. 2015 Oct 29;8:122.肝癌化疗敏感性的功能和机制研miR-122修饰的脂肪组织来源的间充质⼲细胞（AMSC）增加肝癌化疗敏感性究：AMSC通过外泌体将miR-122传递给肝癌细胞，通过调控肝癌细胞靶基因IGF1R，ADAM10和CCNG1表达增加肝癌细胞对化疗药5-FU的敏感性，同样的肿瘤注射miR-122也可增加肝癌细胞的5-FU化疗敏感性。

山奈酚联合骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效及机制

山奈酚联合骨髓间充质干细胞治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效及机制陈卓1，刘胜楠2，陈光侠1，吴倩倩1，陈新孚1，韩新臣11 徐州市第一人民医院消化内科，江苏徐州221116；2 徐州医科大学附属医院消化内科摘要：目的　观察山奈酚联合骨髓间充质干细胞（BMSCs ）治疗溃疡性结肠炎小鼠的疗效并探讨其机制。

方法　3周龄雄性C57BL /6J 小鼠处死后提取BMSCs ，12只6周龄C57BL /6J 小鼠随机分为对照组、造模组、造模与山奈酚治疗组以及造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组，每组3只。

对照组小鼠自由饮用正常灭菌双蒸水，其余3组小鼠自由饮用含3% 葡聚糖硫酸钠的灭菌双蒸水建立溃疡性结肠炎模型，造模与山奈酚治疗组、造模与山奈酚联合BM‐SCs 治疗组小鼠同时给予每日山奈酚灌胃，造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组在造模第1天、第4天和第7天尾静脉注射提取的BMSCs ，其余组小鼠灌注同样量的溶解剂。

造模结束后10 d ，每天测量小鼠体质量，10 d 后取出小鼠结肠，测量小鼠结肠长度。

采用流式细胞术检测小鼠结肠组织辅助性T 淋巴细胞（Th17）、调节性T 淋巴细胞（Treg ）比例，ELISA 法检测小鼠血浆白细胞介素17A （IL -17A ）、IL -10，RT -qPCR 法检测小鼠结肠组织IL -17A 、IL -10 mRNA 。

采用HE 染色观察小鼠结肠黏膜组织病理学改变，免疫组织化学染色观察小鼠结肠组织肠上皮紧密连接蛋白occludin 及ZO -1表达情况。

结果　结肠长度对照组>造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组>造模与山奈酚治疗组>造模组（P 均<0.05）；造模结束后1～10 d ，对照组体质量逐渐上升，造模组体质量逐渐下降，造模与山奈酚治疗组、造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组体质量自第6天开始逐渐上升，且造模与山奈酚联合BMSCs 治疗组体质量高于造模与山奈酚治疗组。

干细胞与胃肠动力研究进展

其在胃肠动力的基础和临床研究ｑＫ４了一定作用。此文简述了干细胞与Ｃｊｌ＂－￣ａ间质细胞（Ｃ）ａＩＣ的关系，并
对干细胞移植对胃排空和胃肌电活动的影响和其治疗某些胃肠动力障碍性疾病的尝试作一综述。关键词：细胞；干胃肠动力；植移
的胃肠动力障碍性疾病可能与ｋｔｉ的功能缺失性突
变、ＣＳＦ分泌的减少或缺失有关口。动物实验表］明，ｋｔ号被阻断后，Ｃ并非死亡，是重新当ｉ信ＩＣ而
分化为平滑肌样的表型。这可能为此类疾病的治
疗提供新的方法。２建立胃肠动力研究的器官离体模型
空和胃肌电活动的影响和治疗某些胃肠动力障碍胞与Ｃｊｌ质细胞ａａ间
由于ＩＣ和肠神经元的减少或缺失在各种胃Ｃ肠动力性疾病病理生理学机制中的重要作用，得使人们对于ＩＣ和肠神经元与胃肠动力的认识逐步Ｃ加深，以往关于胃肠道发育及运动的研究缺乏体但外重建胃肠道器官的模型，大程度依赖体外细胞很和组织的原代培养；Ｙａｄｍａａ等－利用小鼠胚胎干４细胞（Ｓ）ＥＣ在体外培养成为三个胚层发育成的胃肠道样的单位（ｕ－ｋｎｔ，验利用悬滴ＥＣ形ｇｔｌｅｕｉ）实ｉＳ成拟胚体（Ｂ，～７ｄ可见每个拟胚体内形成多个Ｅ）５

间充质干细胞及其外泌体治疗自身免疫性肝炎的研究进展

·综述·DOI： 10.3969/j.issn.1001-5256.2023.12.025间充质干细胞及其外泌体治疗自身免疫性肝炎的研究进展罗龙龙1，2，王丽菲1，2，郑英2，李斌2，卢利霞2，李初谊2，于晓辉2，张久聪21 甘肃中医药大学第一临床医学院，兰州 730000；2 中国人民解放军联勤保障部队第九四〇医院消化内科，兰州 730050通信作者：张久聪，********************（ORCID： 0000-0003-4006-3033）；李斌，*****************（ORCID： 0000-0002-8626-7624）摘要：自身免疫性肝炎（AIH）是由自身免疫系统攻击肝细胞所致的慢性肝炎，其慢性进展可能会导致肝硬化甚至肝细胞癌的发生。

目前，针对AIH的治疗主要包括药物治疗和肝移植，但均存在着各自的局限性，这使得患者的临床获益有限。

因此，寻找新的治疗药物和方法成为了当前亟待解决的关键问题。

近年来研究表明，间充质干细胞及其外泌体可通过抑制炎症反应、增强肝细胞的再生、调节免疫系统等方式改善AIH患者的症状，在AIH治疗中具有广阔的应用前景。

本文通过回顾已有文献，对间充质干细胞及其外泌体治疗AIH的机制和应用进展进行综述，以期为AIH的临床治疗提供新的思路。

关键词：肝炎，自身免疫性；间质干细胞；外泌体；治疗学基金项目：甘肃省非感染性肝病临床医学研究中心（21JR7RA017）；联勤保障部队第九四〇医院基金临床医学肝病诊治中心（2021yxky079）；甘肃省科技计划项目任务书（22YF7FA105）；甘肃省卫生健康行业科研计划项目合同书（GSWSKY2021-054）Research advances in mesenchymal stem cells and their exosomes in treatment of autoimmune hepatitisLUO Longlong1，2， WANG Lifei1，2， ZHENG Ying2， LI Bin2， LU Lixia2， LI Chuyi2，YU Xiaohui2， ZHANG Jiucong2.（1. The First Clinical Medical School，Gansu University of Chinese Medicine，Lanzhou 730000，China；2. Department of Gastroenterology， The 940 Hospital of Joint Logistic Support Force of PLA， Lanzhou 730050， China）Corresponding authors： ZHANG Jiucong，********************（ORCID： 0000-0003-4006-3033）； LI Bin， 2312115338@qq. com （ORCID： 0000-0002-8626-7624）Abstract：Autoimmune hepatitis （AIH）is a type of chronic hepatitis caused by the autoimmune system attacking hepatocytes，and its chronic progression may lead to liver cirrhosis and even hepatocellular carcinoma. Currently，pharmacotherapy and liver transplantation are the main treatment methods for AIH，but both methods have their own limitations， which limits the clinical benefits of patients. Therefore， it is a critical issue to search for new therapeutic agents and methods. Recent studies have shown that mesenchymal stem cells （MSC） and their exosomes can improve the symptoms of patients with AIH by suppressing inflammatory response，enhancing the regeneration of hepatocytes，and regulating the immune system and thus have wide application prospects in the treatment of AIH. By summarizing related articles， this article reviews the possible mechanisms and application of MSC and their exosomes in the treatment of AIH， in order to provide new ideas for the clinical treatment of AIH.Key words：Hepatitis， Autoimmune； Mesenchymal Stem Cells； Exosomes； TherapeuticsResearch funding：Gansu Clinical Medical Research Center for Non-infectious Liver Diseases （21JR7RA017）；Liver Disease Diagnosis and Treatment Center， 940th Hospital Foundation， Joint Logistics Support Force （2021yxky079）； Gansu Province Science and Technology Plan Project Assignment （22YF7FA105）；Gansu Province Health Industry Scientific Research Plan Project Contract （GSWSKY2021-054）自身免疫性肝炎（AIH）主要表现为高球蛋白血症、自身抗体阳性和组织学上界面性肝炎及汇管区浆细胞浸润等［1］。

尼可地尔的临床应用及研究进展

尼可地尔的临床应用及研究进展或不稳定性心绞痛和冠状动脉成形术或溶栓后再灌注损伤。

尼可地尔能通过开放三磷酸腺苷敏感钾（K+ ATP）通道和增加内皮一氧化氮（NO），在多种疾病中发挥了不同的保护作用。

这些机制的关键取决于尼可地尔使用的剂量、病变部位以及该机制是否能在该部位发挥作用。

研究证实，尼可地尔对心肌纤维化、肺纤维化、肾损伤和肾小球肾炎具有保护作用，主要机制为是K+ATP通道开放，而在肝纤维化和炎症性肠病的保护机制中，内皮系统NO的增加占主导地位。

因此，探讨在不同的疾病下，明确不同机制在尼可地尔的保护作用中起主要作用有助于正确使用所选药物及其针对特定疾病的选用推荐剂量。

关键词：尼可地尔；内皮一氧化氮；钾通道开放引言尼可地尔是一种安全、有效的抗心绞痛药物，在日本和欧洲已被列入指南，作为慢性稳定型心绞痛的长期治疗药物[1]。

在多个国家使用尼可地尔治疗冠心病（CAD）心绞痛研究中显示，它能降低冠心病的发病率及死亡率[2，3]。

有赖于上述研究结果的发现，尼可地尔被欧洲心脏病学会推荐为治疗慢性稳定型心绞痛的二线疗法之一，与β受体阻滞剂和钙拮抗剂相比，尼可地尔在改善劳力型心绞痛和缺血性症状方面的疗效相当，且血流动力学障碍最小[5]。

此外，尼可地尔与钙拮抗剂或β受体阻滞剂相比，尼可地尔在有使用β受体阻滞剂禁忌症的患者中是一种有效的抗缺血药物[7]。

根据其药代动力学特征，尼可地尔对正在使用抗凝治疗的患者，以及存在肝损伤、肾功能下降以及肺疾病是安全的[8]。

此外，它的副作用很小，除了常见的副作用如头晕、胃肠不适、面色潮红外，头痛也是常见的副作用，但尼可地尔禁用于低血压或与其他血管扩张剂同时使用。

尼可地尔已被广泛用于各种心血管疾病，诸如变异性心绞痛（冠状动脉痉挛）、不稳定心绞痛和冠状动脉成形术或溶栓后引起的再灌注损伤[6,10]。

由于其在临床研究中已被证明是治疗难治性心绞痛的有效药物，使用该药后可大大减少了心绞痛发作的频率或持续时间[11]。

干细胞治疗结肠炎

干细胞移植在炎症性肠病中的治疗摘要炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是一组病因未明的慢性肠道炎症性疾病, 包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn's disease, CD). IBD的病因仍不明确, 传统治疗主要是控制活动性炎症和调节免疫紊乱, 常用药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素和免疫抑制剂等, 部分病例最终需手术治疗. 目前治疗IBD应针对多种发病机制, 采取综合性措施. 随着治疗研究的进一步发展出现了生物制剂、转基因方法、抗凝治疗、干细胞移植, 使治愈IBD成为可能. 其中干细胞移植是一种新兴的IBD治疗方法, 近年来成为治疗研究领域的热点之一, 本文就干细胞移植治疗IBD的研究现状及作用机制进行概述.0 引言炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)病因未明, 发病机制复杂, 患者数量呈逐年增加趋势, 发达国家发病率高于发展中国家. 据调查, 10%-20%的患者中其家庭成员至少有1人患IBD[1,2], 患病时间超过10年者具有发生结肠癌的高风险率. 2003-2005年在一些发达国家(例如丹麦, 瑞典)的调查研究发现, 克罗恩病(Crohn's disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)每年发病率分别为8.6/10万、13.4/10万[3], 发病高峰年龄为10-40岁人群, 年轻患者较普遍; 同时, IBD首次发作也可见于任何年龄段, 15%的患者在确诊时年龄已超过60岁[1,2,4,5]. IBD病程迁延、反复发作, 多数患者因疼痛生活质量受到严重影响[6]. 近年来随着人们生活水平的不断提高IBD在我国的发病率也渐呈上升趋势, Lok等[2]对我国UC患者人口流行病学及临床学特征进行调查研究后发现, UC患者在我国正逐年增加并对年轻患者影响较大, 其中一部分呈严重暴发起病, 虽多数患者病情可为内科药物治疗所缓解, 但少数病例仍需手术治疗或者死亡. 由于IBD病因未明, 迄今为止还没有彻底治愈IBD的方法, 这使得广大学者寻求一种新的治疗途径, 其中干细胞移植给IBD的临床治疗带来了全新的思路, 干细胞移植可调节或重建患者免疫系统, 修复受损肠道黏膜并可恢复肠道黏膜正常功能, 拥有其他治疗方法无法替代的作用. 干细胞移植将有望成治愈IBD的重要方法, 本文就干细胞移植在IBD的治疗研究进展及作用机制方面作一综述.1 IBD的治疗研究现状目前, IBD的治疗主要着眼于控制活动性炎症和调节免疫紊乱, 传统药物包括5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等. 上述药物对CD与UC的缓解率分别为70%和80%, 但临床疗效欠佳, 长期应用不良反应多, 难以维持长期缓解, 不能有效缩短IBD的自然病程, 对危重病例疗效有限, 存在停药后复发等问题. 与过去30年相比, 免疫抑制剂在IBD的治疗中使用更加频繁, 但并未有效降低CD的肠道并发症[7], 对患者长期的生活质量并没有明显改善. Lix等[8]研究发现, 随着时间的推移CD患者较UC患者具有较高的心理压力、焦虑情绪及病痛灾难感, 这些负面情绪可加重IBD的自然病程, 进一步降低患者的生活质量. 在手术治疗方面, 该疗法主要用于内科治疗无效、合并严重并发症及结肠炎癌变患者, 最终目的是挽救生命、改善患者健康状况, 但术后存在不同程度复发, 其中CD复发率很高. 随之, 在传统药物治疗的基础上出现了生物制剂、转基因方法、抗凝治疗及干细胞移植等新的治疗方法. 在生物治疗方面, 最常使用新型生物制剂Infliximab作为IBD的治疗药物, 该药较多数传统药物起效迅速, 不良反应小, 研究表明Infliximab可有效治疗CD, 愈合瘘管提高患者生活质量[9-11], 对IBD的治疗具有积极作用, 但其临床效果明显时间仅持续2-4 mo, 部分治疗有效的患者可能出现急性肠梗阻, 对可产生Infliximab抗体的患者疗效较差, 在长期用药过程中部分患者可能会产生严重的不良反应[12-14]. 传统IBD的治疗目标主要是控制发作、维持缓解、预防复发、防治并发症及保证生活质量. 近年出现的新型治疗目标主要是早期控制发作、长期维持缓解、改变自然病程、使肠黏膜愈合并试图最终恢复肠道黏膜正常功能、甚至治愈疾病.2 干细胞移植与IBD的关系在诸多治疗IBD的研究中, 干细胞移植作为治疗IBD的新方法主要起源于对造血系统恶性肿瘤合并IBD患者进行干细胞移植后, 观察发现IBD病情在临床及内镜下得到了长期维持缓解, 再次启发了人们研究治疗IBD的新思路, 当前干细胞移植治疗IBD在实验动物研究和临床观察方面均取得了一定的进展.2.1 干细胞与肠黏膜损伤修复干细胞根据发育阶段不同分为胚胎干细胞和成体干细胞. 成体干细胞包括造血干细胞、间充质干细胞、肠道干细胞等. 肠道干细胞即肠道上皮干细胞, 位于肠道隐窝内, 越靠近肠隐窝基底部其增殖能力越强, 越近肠腔增殖能力越弱. 肠道上皮干细胞具有持续更新与分裂增殖能力, 能修复受损肠道黏膜并恢复正常功能, 对维持肠道黏膜的更新及内环境稳定发挥着重要作用, 近两年研究报道, 肠道上皮干细胞移植后可持续生长并稳定表达基因产物[15,16]. 在结合基因技术的基础上, 肠道干细胞可望作为基因载体细胞治疗肠道疾病. 采用干细胞移植治疗IBD造成的肠道黏膜损伤中, 最佳干细胞来源为肠道上皮干细胞, 但由于其数量来源有限, 在体外不能长期培养扩增, 因此可采用造血干细胞作为移植来源. 在干细胞中, 间充质干细胞是一种无造血功能的干细胞, 他有助于组织损伤的修复, 具有较高的可塑性及可移植性, 成人的任何器官组织中均存在该细胞, 在特定条件下间充质干细胞能诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞等多种非造血组织细胞. 2007年Philipe在UC大鼠动物模型中进行骨髓间充质干细胞移植实验中, 发现这类干细胞能定居于受体的肠道上皮[17,18]. 具有正常功能的肠道组织能使炎症所导致的急性肠道损伤得以修复, 间充质干细胞在控制炎症活动、修复肠道黏膜、恢复肠壁完整中起着重要作用. 研究表明, 间充质干细胞可促进放射性损伤的肠上皮的修复[19,20]. 间充质干细胞在修复肠道损伤过程中, UC患者通常能恢复正常的肠道组织结构, 但CD患者则由于过度纤维化常导致肠腔狭窄和梗阻, 这与间充质干细胞持久增生、组织破坏和胶原纤维沉积有关. 目前, 间充质干细胞已成功应用于循环系统、骨关节病等自身免疫性疾病的治疗.2.2 干细胞移植的理论基础干细胞移植的实践与概念始于造血干细胞, 并被几十年的动物实验所支持, 在对患有血液系统疾病或恶性肿瘤的患者进行干细胞移植后发现他们原来患有的IBD得到了意想不到的缓解[21,22]. 目前, 干细胞移植在造血系统疾病方面应用较成熟, 在治疗自身免疫性疾病方面也得到了进一步发展. 自身免疫性疾病的治疗以提高宿主的免疫耐受性为重点, 而IBD患者对肠道共生菌的免疫耐受发生障碍, 这促使我们考虑从促进免疫细胞耐受性治疗入手, 改变IBD的自然病程. IBD是多基因病, 易感点位于第3、7、12、16号染色体上. 研究表明, 突变是IBD的易感因素, Hugot等[23]和Inohara等[24]在2001年报道了IBD的第1个易感基因NOD2/CARD15, 该基因主要存在于单核细胞、巨噬细胞、潘氏细胞、树突状细胞、肠道上皮细胞以及T、B淋巴细胞内[25-27], NOD2/CARD15编码的蛋白质仅在外周血单核细胞中表达, 其作用是介导细胞凋亡以及诱导核因子κB(nuclear factor-κB, NF-κB)的激活. NOD2/CARD15存在3个突变位点, 突变在IBD肠黏膜的严重损伤中具有重要作用, 使患者体内合成大量蛋白, 其蛋白表达可能在造血干细胞内. 因此, 通过造血干细胞移植可重建患者免疫系统从而达到治疗目的.在骨髓源性干细胞中含有多种干细胞组分, 具有多向分化能力, 可直接定居于肠道或与肠道干细胞融合并促进受损微循环的重建等多种机制修复黏膜、恢复正常的肠上皮功能, 也可能其中还参与了肠道的免疫调节, 研究证明骨髓干细胞移植能使IBD模型小鼠受损的肠黏膜组织微循环得以重建, 最终加速受损组织的修复[28], 骨髓干细胞可能成为肠上皮再生的可替代来源.3 干细胞移植治疗IBD的机制及临床试验研究3.1 造血干细胞移植在干细胞移植中造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)应用的较为普遍, HSCT指通过大剂量放、化疗或其他免疫抑制剂的预处理方法清除受体异常的造血和免疫系统, 阻断其发病机制, 然后将供者的造血干细胞移植入受体内, 以替代原有的病理性造血干细胞, 使受体质量建造血及免疫功能, 最终达到治疗目的. HSCT按造血干细胞的来源分为骨髓移植、外周血造血干细胞移植、脐带血干细胞移植和纯化CD34+细胞移植等. 据造血干细胞供者和受者关系及遗传背景分为自体移植、同基因移植和异基因移植. 在进行异基因HSCT时首先要经过移植前预处理, 要求受者和供者具有相匹配的人类白细胞抗原(human leucocyte antigen, HLA)系统, 并有一定数量的造血干细胞作为前提. IBD肠道炎症的发生、发展和转归过程与肠道黏膜免疫系统密切相关. 在人体免疫调节中, T淋巴细胞是重要的免疫细胞, 分为辅助性T淋巴细胞(helper T cells,Th)、细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)和调节性T淋巴细胞, 其中调节性T淋巴细胞对自身免疫调节起着重要作用[29], 主要使机体的自身免疫耐受与自身免疫反应维持平衡[6]; T淋巴细胞功能异常可导致多种疾病[30-32], 同时也是IBD发病的重要因素; IBD患者受累肠段能产生大量抗体, 当T淋巴细胞产生免疫应答时: Th1为主的免疫应答发展为CD, 此时促炎介质IL-2、INF-γ、TNF释放增加, 引起炎症反应或迟发型超敏反应; Th2为主的免疫应答发展为UC, 此时抗炎介质IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-13释放增加, 从而增强体液免疫应答. 正常情况下, 肠道成纤维细胞可产生基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMPs), 其作用可降解细胞外基质阻止其大量沉积, 而活化的具有正常功能的T淋巴细胞可激活成纤维细胞产生MMPs[33], 研究表明, IBD病变肠黏膜中MMPs的表达均明显高于正常的肠黏膜, MMPs在IBD的发病机制中起着重要作用[34]. IBD肠道成纤维细胞与正常肠道成纤维细胞相比具有显著的增殖和胶原分泌能力, 这表明IBD患者肠道产生免疫反应时功能异常的T淋巴细胞激活成纤维细胞,使MMPs产生异常, 从而导致病程的进一步发展. 因此, 造血干细胞移植治疗IBD的可能机制为: (1)移植后的干细胞能参与IBD患者受损肠黏膜的修复, 取代肠黏膜中受损的细胞成分, 还可参与调节肠道内的免疫反应; (2)调节T淋巴细胞功能使肠道正常表达MMPs; (3)移植的前提是摧毁机体病态免疫, 在此基础上进行自体或异体HSCT, 可恢复正常免疫, 阻止了机体对自身组织的免疫攻击, 使IBD的免疫发病机制根除; 与此同时, 在干细胞动员及预处理时应用的超常剂量免疫抑制剂对IBD的治疗具协同作用. 针对IBD的发病机制采用HSCT, 当IBD患者接受HSCT治疗后全身免疫系统得以恢复正常、异常的T淋巴细胞会消失, 通过免疫系统重建可恢复全身正常的免疫反应, 从而治愈IBD.3.2 骨髓间充质干细胞移植骨髓间充质干细胞 (bone marrow mesenchymal stem cells, BMSCs) 是骨髓基质细胞的前体细胞, 是由中胚层分化而来的一种具有多向分化潜能的非造血成体干细胞, 主要存在于骨髓, 可塑性很强, 在不同诱导条件下可分化为多种细胞[35-37], 诸如心肌细胞、肝细胞、神经细胞、血管内皮细胞等. BMSCs移植治疗IBD的可能机制为: 首先, 受损肠道对BMSCs可能有特异性趋化作用, 可释放趋化性细胞因子使BMSCs归巢, 对UC大鼠模型进行BMSCs 移植后发现, 迁移至受损结肠的BMSCs高于正常结肠[38]. 在修复消化系损伤过程中, BMSCs随损伤的加重迁移率增加, 恢复期则明显下降[39]. 研究还证实, 移植后的BMSCs能在大鼠UC模型的肠道中定位[40], 从而分化成具有一定功能的肠道上皮细胞, 可参与消化系损伤修复和功能重建[41], 与此同时BMSCs可抑制T、B淋巴细胞增殖, 降低树突状细胞抗原呈递作用以及改变自然杀伤(natural killer, NK)细胞的功能[42,43], 从而抑制肠道的异常免疫反应, 还可调节细胞因子IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8和 TNF-α[44]等的分泌, 进一步调节受损肠道的炎症反应; 其次, BMSCs还可参与受损肠道微环境的重建, 促进新生血管形成[45], 从而有利于肠道黏膜的修复过程; 最终达到治愈IBD的目的, 移植后重建的免疫系统功能替代了原有的导致肠道慢性炎症的异常的免疫系统功能. BMSCs移植后并发症少、骨髓采集安全方便、对机体损伤小, 易于分离、纯化和体外扩增, 不涉及伦理道德问题, 因此是干细胞移植治疗IBD的理想细胞.3.3 HSCT治疗IBD的临床试验研究 1993年, Drakos报道了第1例淋巴瘤合并CD患者在接受同种异体HSCT后其CD病情得到了改善. 随后, 至少有22例癌症合并CD患者在接受自体造血干细胞移植(autologous hematopoietic stem cell transplantation, AHSCT)后病情得到缓解, 其中19例移植后中位随访时间7年达长期缓解, 18例在中位随访时间超过20 mo后仍达到临床缓解, 18例中有2例同时服用传统药物[46]. 这表明在不服用任何药物的情况下AHSCT也能带来长期的临床缓解疗效, 这引起了人们极大的关注, 使IBD临床治疗方法出现了全新的思路. 2003年报道, 对2例Infliximab疗效较差的CD患者进行HSCT发现CD活动指数(Crohn's disease activity index, CDAI)完全正常[47]; 同时, Burt等[48]也作了报道; 在IBD的治疗中, 有两例关于AHSCT作为CD主要治疗方法的报道, 第1例来自于芝加哥的Ⅰ期临床试验, 包括12例活动性中重度CD患者, 在使用传统治疗和抗TNF-α单克隆抗体治疗无效情况下, 用环磷酰胺联合粒细胞集落刺激因子动员后采集外周血干细胞, 经CD34+纯化处理, 在移植前用环磷酰胺和抗胸腺球蛋白进行预处理, 结果发现出院时CDAI和CD症状均得到改善, 在随访7-37(中位时间为18.5) mo后发现影像学及内镜异常均逐渐改善, 其中11例获得维持缓解(CDAI≤150)[49]; 另1例报道来自米兰的Ⅰ-Ⅱ临床试验, Cassinotti等[50]对4例难治性CD患者进行自体造血干细胞移植后, 撤出所有传统治疗药物, 4例患者有3例经中位随访时间16.5 mo后临床和内镜评估达到了维持缓解; 在这2例报道中进行HSCT后均无患者死亡. 目前欧洲正进行Ⅲ期临床试验, 旨在调查大剂量免疫抑制剂加用AHSCT所带来的潜在临床疗效. 国外报道了1例出生后10 mo患有IBD合并CD3γ缺陷的患儿, 出生后2 mo时经常发生顽固性腹泻、反复肺部感染、口腔念珠菌病, 在进行严格的移植前准备后为该患儿进行第1次异基因HSCT, 并在5 mo后进行第2次移植, 在第2次移植后的第19天患儿由IBD导致的严重腹泻、肛周病变、直肠瘘得到了显著改善[51]. 国内报道, 2004年对5例复发性CD患者进行自体AHSCT治疗, 有4例缓解, 1例术后6 mo复发[52]. 所有这些相关报道在HSCT治疗IBD的进一步研究中给人们产生了巨大鼓舞.4 结论干细胞移植治疗IBD具有广阔的应用前景, 他可从遗传和免疫方面对IBD起到治疗作用, 能够改变IBD的自然病程、达到长期维持缓解、愈合受损肠道黏膜、恢复肠道正常功能并显著提高患者生活质量. 当前干细胞移植对IBD的治疗还处于试验性阶段, 主要用于对难治性CD试验性治疗的研究, 尚缺乏大量的临床资料, 有待于更多病例研究和长期随访. 随着干细胞移植技术的迅速发展, 成纤维细胞、骨髓细胞诱导成多能干细胞相继报道, 给干细胞移植治疗IBD的研究和应用打开了新的前景. 此外, 干细胞移植在基础和临床研究方向上仍存在着有待解决的问题, 如干细胞移植治疗最佳时机的选择; 移植适应证的选择; 合理的预处理方案; 自体移植物去除T淋巴细胞的利弊; 如何进行个体化治疗; 并发症的防治; 移植后激素减量的方法; 移植后免疫重建的研究; 干细胞移植后在体内的转化过程及机制; 如何进一步提高移植成功率等都是未来研究的方向, 随着基础研究的深入和临床实践经验的不断积累, IBD患者有望得到彻底的治愈. 我们期待着干细胞移植能在IBD的治疗中得到广泛和有效的应用. 在未来的一段时间内, 随着技术的不断创新, 治疗经验的不断丰富, 会有越来越多的患者得到更好的救治, 重获健康. 干细胞移植治疗在IBD中的应用将仍是消化系疾病的研究热点, 相信不远的将来应用干细胞移植治疗IBD将会成为必然趋势.背景资料 IBD病因未明, 迄今为止还没有彻底治愈IBD的方法, 药物及手术治疗均不能获得满意疗效.同行评议者郁卫东, 副研究员, 北京大学人民医院临床分子生物学研究所/中心实验室研发前沿目前, 干细胞移植治疗IBD的研究主要集中于造血干细胞和骨髓间充质干细胞移植, 在基础和临床研究方面均取得了一定的进展, 但移植后免疫重建的研究、干细胞在体内的转化过程及机制、移植适应证的选择、个体化治疗方案、如何进一步提高移植成功率等都是未来研究的关键.相关报道研究表明干细胞移植后可迁移至受损肠道参与损伤组织修复和功能重建, 并可恢复肠道正常的免疫功能, 国内外仍在进行临床研究探索.创新盘点本文就干细胞移植治疗IBD的研究进展进行综述, 并对其治疗的可能机制进行了概括总结.同行评价本文科学性较好, 综述全面, 为读者了解干细胞移植治疗炎症性肠病的研究进展奠定基础.。

克罗恩病治疗的新进展干细胞治疗的研究现状

克罗恩病治疗的新进展干细胞治疗的研究现状克罗恩病治疗的新进展——干细胞治疗的研究现状克罗恩病是一种慢性炎症性肠道疾病，严重影响患者的生活质量。

目前，虽然已有一些治疗方法，但效果有限，无法完全治愈患者。

干细胞治疗作为一种新兴的治疗方法，正在受到越来越多的研究关注。

本文将介绍克罗恩病治疗的新进展，聚焦于干细胞治疗的研究现状。

1. 干细胞治疗的原理干细胞具有自我更新和分化为多种细胞类型的能力，因此被认为有望在医学领域发挥重要作用。

对于克罗恩病的治疗，干细胞可以修复受损组织，调节免疫系统，减少炎症反应，从而改善患者的病情。

2. 干细胞治疗的研究进展近年来，干细胞治疗在克罗恩病领域取得了一些突破性进展。

其中，胎盘间充质干细胞（Wharton's Jelly-derived mesenchymal stem cells, WJ-MSCs）是一种常用的干细胞来源，被广泛应用于临床研究。

研究表明，WJ-MSCs可以减轻克罗恩病患者的肠道炎症，提高肠道黏膜的完整性，促进炎症反应的下降。

此外，造血干细胞移植（hematopoietic stem cell transplantation, HSCT）也被一些研究用于克罗恩病的治疗。

HSCT通过重建患者的免疫系统，改善炎症反应，取得了一定的疗效。

然而，HSCT的风险较大，并不适用于所有患者。

3. 干细胞治疗的前景与挑战干细胞治疗作为一种新兴的疗法，为克罗恩病患者带来了新的希望。

然而，目前的研究还存在一些挑战。

首先，干细胞治疗的机制尚不完全明确。

虽然研究表明干细胞可以促进组织修复和免疫调节，但具体的作用机制仍需进一步深入研究。

其次，干细胞治疗的安全性需要进一步验证。

虽然干细胞具有较低的免疫原性和肿瘤形成风险，但长期的安全性评估仍然是一个重要的问题。

另外，干细胞治疗的标准化和规范化也是当前亟需解决的问题。

不同研究中使用的干细胞来源、治疗方案和评估指标存在差异，影响了研究结果的可比性和临床应用的推广。

间充质干细胞产品及其外泌体在炎症性肠病治疗中的研究进展

间充质干细胞产品及其外泌体在炎症性肠病治疗中的研究进展杨婧雯1，陈　芊1，单云龙1，刘嘉莉1，尉　宁1,2，王　婧2，王广基1*，周　芳1**（1中国药科大学药物代谢动力学重点实验室, 南京 210009；2江苏睿源生物技术有限公司, 南京211103）摘　要　炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD ）发病机制不明，特征为进行性和终身复发性消化道炎症反应。

尽管现阶段新的治疗药物和策略不断涌现，但治疗作用局限于单一的抗炎功能，在复杂黏膜免疫环境下易出现耐药导致治疗失败。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs ）能定向归巢到结肠炎症部位，具有强大的免疫调节能力，可重塑肠道免疫环境和修复上皮屏障，为药物难治性患者的治疗提供了极具潜力的替代方案。

本文对MSCs 产品及其衍生的外泌体在临床上的应用、作用机制和工程化进行综述，以期为MSCs 及其外泌体产品用于IBD 的治疗提供参考。

关键词　炎症性肠病；间充质干细胞；外泌体；工程化中图分类号 R574 文献标志码　A文章编号　1000−5048(2024)01−0103−12doi ：10.11665/j.issn.1000−5048.2023113001引用本文杨婧雯，陈芊，单云龙，等. 间充质干细胞产品及其外泌体在炎症性肠病治疗中的研究进展[J]. 中国药科大学学报，2024，55（1）：103 − 114.Cite this article as: YANG Jingwen, CHEN Qian, SHAN Yunlong, et al . Research progress on mesenchymal stem cell products and their exosomes in the treatment of inflammatory bowel disease[J]. J China Pharm Univ , 2024, 55(1): 103 − 114.Research progress on mesenchymal stem cell products and their exosomes in the treatment of inflammatory bowel diseaseYANG Jingwen 1, CHEN Qian 1, SHAN Yunlong 1, LIU Jiali 1, WEI Ning 1,2, WANG Jing 2, WANG Guangji 1*,ZHOU Fang 1**1Key Laboratory of Drug Metabolism and Pharmacokinetics, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009;2Renocell Biotechnology Co., Ltd., Nanjing 211103, ChinaAbstract Inflammatory bowel disease (IBD), whose pathogenesis remains elusive, is a group of autoimmune diseases characterized by chronic, progressive, and lifelong inflammation of the digestive tract. The pathogenesis of IBD remains elusive. Although a number of drugs have been developed to treat IBD, their effects are merely anti-inflammatory. In addition, current treatments for IBD are easily susceptible to resistance in clinical practice.Mesenchymal stem cells (MSCs) have been reported to have the ability to migrate to the site of inflammation,with potent immunoregulatory effects, and to rebalance the immune microenvironment and restore the integrity of the epithelial barrier with significant value of application, particularly for patients who are refractory to classic medicines. In this paper, we reviewed the clinical applications, mechanisms and engineerable properties of MSC products and their exosomes to provide some reference for the use of MSCs and their exosomes in the treatment of IBD.Key words inflammatory bowel disease; mesenchymal stem cells; exosomes; engineering收稿日期　2023-11-30 通信作者 *Tel ：************　E-mail ：*************************Tel ：************　E-mail ：**************基金项目国家自然科学基金项目（No. 82073928）；南京市生命健康科技专项（No.202110006）；细胞生态海河实验室创新基金项目（22HHXBSS00005）；江苏省南京市联合资助项目（SBK2023070039）学报　2024, 55(1): 103 − 114103This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 82073928); the Nanjing Life and Health Science and Technology Program (No.202110006); the Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00005); and the Co-funded Programs in Nanjing, Jiangsu Province (SBK2023070039)炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和克罗恩病（Crohn's disease, CD），是由环境、免疫系统、肠道微生物组和个体遗传等因素的复杂互作引起的一类自身免疫性疾病，其一线治疗药物包括糖皮质激素、免疫抑制剂、抗生素和抗肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor, TNF-α）疗法。

干细胞移植治疗放射性肠炎的研究进展

干细胞移植治疗放射性肠炎的研究进展彭亚楠;王海洲;张萌;方诗琳;施先艳;赵秋;刘静【摘要】放射性肠炎(radiation enteritis,RE)是经放射治疗引起的肠道放射性损伤,可累及肠道各节段,导致肠道消化、吸收及分泌功能障碍,严重时可危及患者生命,是当今临床治疗的难题.目前,放射性肠损伤机制仍不明确,尚缺乏有效的预防和治疗方法.干细胞移植是一种新兴的治疗策略,已成为RE治疗领域的研究热点.鉴于此,本文主要对干细胞移植治疗RE的研究现状及其损伤修复机制作一综述.【期刊名称】《临床误诊误治》【年(卷),期】2018(031)001【总页数】5页(P108-112)【关键词】干细胞移植;肠炎;间质干细胞;干细胞研究【作者】彭亚楠;王海洲;张萌;方诗琳;施先艳;赵秋;刘静【作者单位】430071 武汉,武汉大学中南医院消化内科(湖北省肠病医学临床研究中心肠病湖北省重点实验室);430071 武汉,武汉大学中南医院消化内科(湖北省肠病医学临床研究中心肠病湖北省重点实验室);430071 武汉,武汉大学中南医院消化内科(湖北省肠病医学临床研究中心肠病湖北省重点实验室);430071 武汉,武汉大学中南医院消化内科(湖北省肠病医学临床研究中心肠病湖北省重点实验室);430071 武汉,武汉大学中南医院消化内科(湖北省肠病医学临床研究中心肠病湖北省重点实验室);430071 武汉,武汉大学中南医院消化内科(湖北省肠病医学临床研究中心肠病湖北省重点实验室);430071 武汉,武汉大学中南医院消化内科(湖北省肠病医学临床研究中心肠病湖北省重点实验室)【正文语种】中文【中图分类】R617;R516.1放射治疗(放疗)是恶性肿瘤的常用治疗方法，大约70%的癌症患者接受放疗[1]。

肠组织对辐射高度敏感，是临床放射性损伤的常见部位之一[2]。

据估计，全世界每年有3万～5万例患者在接受放疗后发生严重的放射性肠炎(radiation enteritis，RE)[3]。

骨髓间充质干细胞治疗肠道疾病的研究进展

环境因素作用于遗传易感患者，肠道菌群的参与在
人们的生活质量。传统方法是通过手术及药物治
下，致机体的免疫和炎症反应，而引起肠道黏导从膜的慢性损伤。肠道黏膜免疫系统在１Ｄ的发生发Ｂ展中起着重要的作用，免疫反应过程中释放大量的
张静综述。红丽审校宋
（津市第一中心医院器官移植中心，津３０９）天天０１２
关键词骨髓间充质干细胞；道疾病；肠细胞移植
中图分类号
Ｒ７５４
文献标识码
Ａ
肠道疾病是一种常见病、发病，重影响着多严
创伤等领域。随着对ＢＣ的不断深入研究，将ＭＳｓ它更广泛地应用于临床上治疗各种疾病。
２ＭＳ在治疗肠道疾病中的作用ＢＣｓ２１ＢＣ在治疗炎症性肠病方面的作用炎症．ＭＳｓ性肠病（ｆｍｍｔｒｂｗｌｉａｅＩＤ）ｉｌｎａａｏｙｏｅｄｓｓ，ｅＢ是指一组病
成熟的Ｄ胞产生ＴＦ仅，Ｃ细Ｎ一而促进成熟ＤＣ细胞
道疾病的治疗方面做一综述。
１ＢＭＳｓ介Ｃ简
ＢＣ是最近几年被发现的、造血干细胞以ＭＳｓ除
分泌Ｉ一０同时能够抑制辅助性Ｔ细胞１Ｔ１细Ｌ１；（ｈ）胞分泌ＩＮ，Ｆ一而促进Ｔ２细胞分泌Ｉ一【ｈＬ４＿５。另外，

骨髓间充质干细胞与胃癌的起源

胃癌是全球发病率最高的癌症之一，每年新发病例近百万，胃癌又是世界第二大癌症致死原因，胃癌的发病和治疗一直是一个倍受关注的问题。关于胃癌的发病机制，幽门螺杆菌（ helicobaeter pylori，HP）感染一直以来被认为和胃癌的发生关系密切，HP 感染在胃癌发生中起非常重要的作用，但其确切的作用机制尚未完全阐明，人们对于胃癌的病理机制理解很不全面，对胃癌的临床治疗缺乏有效的方法手段，传统的手术治疗及放疗、化疗等方法疗效欠佳。骨髓间充质干细胞（ bone marrow-drived stem cells，BMDCs）是骨髓来源的一类具有多向分化潜能的成体干细胞，可分化为骨、软骨、心肌、脂肪和肌腱等细胞，并且被认为能跨胚层横向分化为肝、胆管上皮、肺、肠、皮肤上皮和神经元及神经胶质细胞等多种组织细胞类型［1 － 2］，并且 BMDCs 具源充足便利，被广泛用作各种成体干细胞移植的新来源，在组织工程中有非常广阔的运用前景。近年有研究［3］将 BMDCs 移植修复胃的损伤，发现 BMDCs 移植后形成胃上皮癌，对胃癌起源以及治疗有极大的启发。
关于胃癌起源历来主要有两种观点：观点一：胃癌源于胃黏膜上皮细胞的恶性转化。这是多年来广泛被
临床医学 2012 年 8 月第 32 卷第 8 期 Clinical Medicine，Aug． 2012，Vol． 32，No． 8
基金项目：云南省教育厅科学研究基金项目（ 2010C087）
1 BMDCs 移植形成胃上皮癌科学家们 Houghton 等［3］试图将 BMDCs 注射到胃
急性损伤的小鼠模型中，试图修复胃的损伤，却发现了非常令人吃惊的现象，经过一段时间后，胃黏膜中的这些细胞发生恶性转化，形成了胃的上皮癌和高级别上皮内瘤变。该研究成果由 Houghton 等发表在 2004 年的 science 杂志上，文中作者们发现损伤可以引发 BMDCs 向胃黏膜定向迁移；这些细胞不向主细胞和壁细胞分化，却发生恶性转化形成胃上皮癌和高级别上皮内瘤变，并且免疫组化标记表明，恶性转化细胞均来自 β-半乳糖苷酶标记阳性的骨髓来源 BMDCs，在原有的胃黏膜上皮中未发现恶性转化的细胞；细胞异型性随着时间和疾病进展而逐渐加重；通过 FISH 排除了 BMDCs 和组织细胞融合的可能，证实 BMDCs 分化为胃上皮细胞并形成胃上皮癌和高级别上皮内瘤变。该研究引起人们的高度关注，science 上紧接着对这个研究结果发表文章评论［4］，对 BMDCs 形成胃上皮癌，作为胃癌细胞的起源感到很吃惊，认为该结果给胃癌的研究带来极大的启发。 2 胃癌的起源

间充质干细胞移植与胃肠上皮细胞再生

等一系列自身免疫性疾病的治疗提供了新的思路。【关键词】间充质干细胞移植；免疫；胃肠道
中图分类号：３８Ｑ８３Ｒ１；１文献标识码：Ａ文章编号：６３４３（０８１－０３０１７ — １０２０）１１１ —２
究表明，高剂量ＭＳｓ能抑制Ｔ细胞活化，Ｃ而低剂量共培养
时，时是抑制效应，时是促进效应。有有
相关的黏附分子有免疫球蛋白超家族、择素家族、合素家选整
族、Ｄ４等４大类。Ｃ４ＭＳｓ化因子受体表达的报道不一。Ｗｙｎ等＿发现仅Ｃ趋ｎ９］
缺陷和严重肾小管损伤的雌性小鼠体内，现含有Ｙ染色体发
细胞定位在肾小管上皮层。ＦａｃｉＩ发现ＭＳｓ移植入ｒｎｏｓ等８Ｃ无放射损伤的动物后，很少分布于肺、仅骨髓、肉组织中。全肌身放射后，多ＭＳｓ出现在脑、、髓和肌肉；用腹部照较Ｃ心骨加射后，Ｃ还出现在消化道、、。ＭＳｓ肝脾
国际检验医学杂志２０年ｌ月第２０８１９卷第ｌ１期ＩＪＬｂＭｅ，ｏｅｅ０８Ｖ１２，ｏ１ｍａｄＮｖｍｂｒ２０，ｏ９Ｎ．１．
・
１３・０１
・
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
综述
・
间充质干细胞移植与胃肠上皮细胞再生

间充质干细胞治疗炎症性肠病机制

分ꎮ 免疫因素对ＩＢＤ的发生、发展、转归起重要作
的肿瘤坏死因子 α 刺激基因－６( ＴＳＧ－６) 可通过诱
的遗传倾向ꎮ 然而ꎬ遗传因素只占ＩＢＤ病因的一部
用ꎬ 结肠浸润性免疫细胞如巨噬细胞 ( ｍａｃｒｏｐｈａ￣
ｇｅｓ) 、树突细胞( ｄｅｎｄｒｉｔｉｃｃｅｌｌꎬＤＣ) 在ＩＢＤ的发病中
巨噬细胞可分泌抗炎细胞因子ＩＬ－１０ꎬ在免疫调节
中起重要的作用ꎮ ＩＢＤ免疫稳态失衡ꎬ肠道中Ｍ１
表型巨噬细胞占优势ꎮ 固有层单核细胞和Ｍ１巨噬
细胞侵入肠组织可致紧密连接蛋白的失调ꎬ诱导上
的ＩＢＤ和成人发病的ＩＢＤ的重叠基因显示了相似
皮细胞凋亡ꎬ破坏上皮屏障ꎬ促进ＩＢＤ的发展 [１２] ꎮ
但是否对炎症性肠病中巨噬细胞有影响还需要进一
现代中西医结合杂志ＭｏｄｅｒｎＪｏｕｒｎａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ２０２０Ｊｕｌꎬ ２９(１９)
步研究证实ꎮ
２１５５
为增强ＭＳＣｓ的免疫调节效力带来新的亮点ꎮ
以从大多数机体组织中分离出来ꎮ 除了参与造血和
强大的免疫调节作用ꎮ 已有临床试验证实ＭＳＣ可
产生可溶性介质ꎬ改变免疫细胞的功能ꎮ
的巨噬细胞库ꎬ这些巨噬细胞对于维持黏膜稳态和
以有效治疗ＩＢＤ [２－５] ꎬ但治疗机制尚有争议ꎮ 本文
上皮更新必不可少ꎬ同时也是保护性免疫的重要组
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
１ＩＢＤ的病因及发病机制
过去二十年中ꎬ东欧和亚洲各地的发病率也在不断
上升
[１]

肠道菌群调节剂与间充质干细胞的组合物及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010212014.5(22)申请日 2020.03.24(71)申请人北京大学口腔医学院地址 100089 北京市海淀区中关村南大街22号北京大学口腔医院科研楼5003(72)发明人张益　肖锷　吕婉琪　(74)专利代理机构北京市万慧达律师事务所11111代理人黄玉东　张一帆(51)Int.Cl.A61K 35/28(2015.01)A61K 45/06(2006.01)A61P 3/10(2006.01)A61P 37/02(2006.01)A61K 35/741(2015.01)A61K 35/51(2015.01)A61K 35/50(2015.01)A61K 35/745(2015.01)(54)发明名称肠道菌群调节剂与间充质干细胞的组合物及其应用(57)摘要本发明属于生物医药领域，涉及肠道菌群调节剂与间充质干细胞的组合物及其应用。

本发明的组合物能够适用于治疗糖尿病，有效增强间充质干细胞治疗糖尿病的治疗效果，尤其是自身免疫性的I型糖尿病，减轻胰岛炎症，使更多的胰岛β细胞得以保存，为间充质干细胞的临床转化和应用提供支持，具有良好的应用前景。

权利要求书2页说明书10页附图11页CN 111317747 A 2020.06.23C N 111317747A1.一种组合物，其特征在于，包括：包括由间充质干细胞组成的第一剂；和，由肠道菌群调节剂组成的第二剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述肠道菌群调节剂为肠道益生菌和/或广谱抗生素；优选地，所述肠道益生菌选自双歧杆菌、乳酸菌、链球菌、芽孢杆菌中的一种或几种；优选地：所述双歧杆菌选自长双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、齿双歧杆菌、动物双歧杆菌等、乳双歧杆菌、青春双歧杆菌、比菲德氏B菌中的一种或几种；优选地：所述乳酸菌选自嗜酸杆菌、罗伊乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、约氏乳酸杆菌、凝结芽孢杆菌、保加利亚乳杆菌中的一种或几种；优选地：所述链球菌为粪链球菌；优选地：所述芽孢杆菌选自克劳氏芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草杆菌中的一种或几种；优选地，所述广谱抗生素为多肽类广谱抗生素、大环内酯类广谱抗生素、8含磷多糖类广谱抗生素、聚醚类广谱抗生素、氨基苷类广谱抗生素、化学合成类广谱抗生素中的一种或几种；优选地，所述广谱抗生素选自氨苄西林溶液、甲硝唑溶液、新霉素溶液、万古霉素溶液组成的混合剂；优选地，所述间充质干细胞选自脂肪间充质干细胞、骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、牙髓间充质干细胞、皮肤间充质干细胞、尿液间充质干细胞、骨膜间充质干细胞中的一种或多种，优选脂肪间充质干细胞。

1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。

信在以后的研究中，这些问题将会迎刃而解，干细
胞疗法将会应用于更广阔的领域，从而更好的服务
于临床。同时，干细胞在细胞和基因工程方面也具
有广泛的应用前景，值得进一步探索。
参考文献：［1］ Jones E, McGonagle D. Human bone marrow mesenchymal stem
cells in vivo [J]. Rheumatology (Oxford),2008,47(2):126 ［2］ Dominici M, Marino R, Rasini V, et al. Donor cell-derived os-
化成为某种成体干细胞或者横向分化为多种组织
细胞，因而备受人们关注，成为细胞移植治疗的新热点。大量动物实验研究己证明 BMSCs 在治疗多系统疾病方面具有显著效果。本文就 BMSCs 应用于肠道疾病的治疗方面做一综述。 1 BMSCs 简介
BMSCs 是最近几年被发现的、除造血干细胞以外的一种成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜
研究热点。 2.3 BMSCs 在治疗肝移植相关性肠病方面的作用目前，各种原因引起的终末期肝衰竭的患者越来越多，肝移植已经成为治疗各种终末期肝病患者
的最有效治疗手段，但是肝移植术后并发的胃肠功
能紊乱成为威胁手术成功与否的关键。肝移植术后
胃肠功能紊乱的原因包括：手术本身的创伤、缺血
再灌注损伤、移植物抗宿主病等。 BMSCs 本身具有低免疫源性，初始 T 细胞对抗
定植并横向分化，但其定植率比较低，难以进行有
效的肠黏膜修复。因此只有提高 BMSCs 在肠道的定
[13]
植率才能更充分的发挥其黏膜修复功能。张坚等
通过实验研究发现在放射性肠道中 SDF-1因子表达增加，通过 mCXCR4 基因（SDF-1 的受体）修饰可明显提高 BMSCs 向肠道定植分化的能力，促进放射性肠损伤的修复。是否还有其他方法提高 BMSCs 在
明间充质干细胞能够成功植入受者体内，具有明显的可移植性。因此,BMSCs 已经成为细胞移植中极具潜力的细胞来源，广泛应用于心血管、呼吸、消化、创伤等领域。随着对 BMSCs 的不断深入研究，它将更广泛地应用于临床上治疗各种疾病。 2 BMSCs 在治疗肠道疾病中的作用 2.1 BMSCs 在治疗炎症性肠病方面的作用炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是指一组病因未明的肠道疾病，包括溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UD）和克罗恩病(Crohn’s disease,CD)。是由于
关键词骨髓间充质干细胞；肠道疾病；细胞移植
中图分类号 R574
文献标识码Ａ
肠道疾病是一种常见病、多发病，严重影响着
人们的生活质量。传统方法是通过手术及药物治
疗，但多产生明显的副作用以及并发症。骨髓间充质干细胞（ bone marrow mesenchymal stem cells,BM－ SCs）具有强大的增殖能力，多向分化潜能以及向损伤组织定位修复的功能，在一定条件下可以定向分
血管化，促进局部血液灌注。同时
VEGF
还可以阻
止白细胞的粘附和慢性炎症反应，减轻由于炎症造
[21]
成的缺血反应。分泌的
HGF
可以通过促进血管内
皮细胞增殖，增加血管生成，减少细胞凋亡[22]；FGF
促进内皮细胞增殖以及血管化，同时还可以使 BM－
SCs
[23]
在低氧条件下存活率更高。以上可以看出间
障功能的完整性方面发挥着巨大的作用。已经证实 BMSCs 释放的多种细胞因子在保护肠黏膜屏障方
面同样发挥着重要的作用，例如：它释放的肝细胞
[9]
生长因子可以减少细胞凋亡，促进细胞生长；血管
572
天津医科大学学报
第１7 卷
内皮细胞生长因子可以促进肠黏膜的血管化，增加
肠道的血运，使受损肠黏膜获得丰富的营养物质，加快溃疡的愈合[10]。由此可见，BMSCs 强大的旁分泌功能在治疗胃肠道疾病方面起着重要作用。BMSCs
样能够减轻大量自由基造成的肠道损伤。在阻断门静脉血流造成的缺血缺氧条件下,
第4期
张静，等.骨髓间充质干细胞治疗肠道疾病的研究进展
573
BMSCs 可以通过分泌多种细胞因子提高肠道上皮
[19]
细胞的生存以及增殖能力，参与组织的修复。它分
泌的 VEGF 及其他血管发生蛋白，参与损伤区域的
[20]
充质干细胞通过旁分泌功能可以促进细胞再生、抑
制功能细胞的凋亡，改善损伤区域的血管微环境。 BMSCs 所显示的低免疫原性、免疫调节特性及强大
的旁分泌特性在肝移植术后肠病的治疗上发挥着巨大作用，相信随着对 BMSCs 研究的不断深入， BMSCs 将更广泛应用于移植治疗中，为控制肝移植
相关性肠功能紊乱的发生带来新的希望。 3 展望
原发生免疫应答反应依靠主要组织相容性复合体 (MHC)分子与抗原肽的复合物、T 细胞受体(TCR)作为第一信号，同时需要 CD28、B7、细胞间黏附分子 1 (ICAM-1)、细胞间黏附分子 2(ICAM-2)等共刺激分子的作用作为第二信号。BMSCs 不表达 MHC II 类分子和 FasL，不表达共刺激分子 B7-1、B7-2，也不表达或低水平表达 MHC I 类分子、CD40 和 CD40L[17]，因而使 T 细胞无法对抗原产生免疫应答，发挥其免疫抑制功能。研究发现在患有自身免疫源性肠病的大鼠模型中注入 BMSCs 可以在疾病的活动期减少肠系膜淋巴结的数量，并可以抑制活动性 T 细胞在肠系膜淋巴结的聚集。急性的移植物抗宿主病机制是供体成熟的 T 细胞遇到宿主抗原递呈细胞(APC) 时，发生激活、增殖等反应，BMSCs 能抑制 T 细胞的活化与增殖，改变细胞因子的水平与成分，抑制免疫应答。此外 BMSCs 还可以通过影响 T 细胞及 DC 的迁移，诱导 Treg 细胞的扩增，抑制 B 淋巴细胞分泌抗体及调节 NO、DO 等可溶性因子的分泌，通过这些免疫调控机制来抑制干细胞移植后出现的移植物抗宿主病，因此临床上可以将 BMSCs 应用于移植术后抗排斥反应，减少移植术后由于排斥原因造
免疫因子和炎症介质，这些因子和介质激起肠道的
炎症反应，导致肠道疾病的发生。有研究发现将
BMSCs 通过静脉注入 IBD 患者的机体内可以发挥
免疫调节作用，抑制免疫炎症的发生,加快肠黏膜的
修复进程[3]。BMSCs 发挥这一作用是通过抑制 T 细
胞、B 细胞的活化，降低树突状细胞（DC）的抗原呈
递作用而实现的[4]。研究表明，BMSCs 体外能够抑制
能，在适宜的外环境下可以分化为中胚层的间质组
织细胞，还可以分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细
[1]
胞、心肌细胞、神经元细胞及星形胶质细胞等。已有研究证实 BMSCs 具有明显的抗炎、促血管再生、免疫抑制等功能，而且其在体外易于分离、纯化、培养和扩增。Dominici 等[2]将转染绿色荧光蛋白(GFP) 的间充质干细胞用于治疗小鼠成骨不全症，结果表
移植修复胃肠道损伤，对于治疗胃肠道疾病有着重要的意义，它在治疗 IBD 方面还有哪些机制，发挥哪些作用，有待进一步探索发现，相信对 BMSCs 临
床和基础的不断深入研究，将为日后的胃肠道疾病
的治疗开辟一条新的思路。 2.2 BMSCs 在治疗放射损伤性肠病方面的作用临
床上放射治疗是腹部和盆腔等恶性肿瘤围手术期
于肠道营养物质的吸收，加强肠道的屏障功能，抵
御外源微生物的入侵，早期恢复放射性肠道损伤。
放射性胃肠道损伤一直是小肠放射生物学领域的
研究热点，深入研究其发生机制和救治方法，对于
腹部肿瘤局部放疗以及核事故引起的消化道损伤的理论与实践有着积极的意义，基于 BMSCs 本身的多种功能，它将成为治疗放射性肠损伤的主要
肠道的定植率，有待进一步研究。放射治疗导致肠
道干细胞衰竭，肠黏膜细胞萎缩变性，肠黏膜分泌的各种消化液及消化酶减少，植入外源性 BMSCs
可以加快肠道上皮细胞的自我更新，同时有助于肠
道分泌功能的恢复。Semont
[14]
等发现在放射性肠损
伤的大鼠体内注入 BMSCs 后，小肠绒毛长度增加，
从而进一步证实了 BMSCs 在肠道损伤中的修复作
的一项主要治疗手段，但是由于肠道上皮对于辐射
高度敏感，放射线极易造成肠黏膜上皮的损伤，导
致黏膜屏障破坏，肠的通透性增加，引起肠道功能
紊乱，造成放射性肠道损伤。因此如何提高放射损
伤后肠黏膜的修复功能，减轻放射治疗的副作用，
成为了临床上研究的热点问题。BMSCs 具有强大的旁分泌功能，它分泌的组织因子包括：IGF-1、EGF、 SDF-1[11]等。IGF-1 可以通过 PI3K/AKT/P53 轴抑制 PUMA，从而阻止由于放射损伤导致的肠道干细胞的凋亡[12]。SDF-1 是一种骨髓干细胞的趋化因子，已有研究发现 BMSCs 可以向放射性损伤的小肠归巢、
成熟的 DC1 细胞产生 TNF-α，而促进成熟 DC2 细胞
分泌 IL-10；同时能够抑制辅助性 T 细胞 1(Th1)细
胞分泌 IFN-γ，而促进 Th2 细胞分泌 IL-4[5]。另外，
间充质干细胞体外还能够将 B 淋巴细胞阻滞于 Go/
G 期，抑制 B 细胞分泌 IgM、IgG、IgA，并下调 B 细胞
成的肠功能紊乱。
在肝移植手术中阻断门静脉的血流，肝脏缺血
造成肠功能受损，当肝脏再通后肠道恢复血流，此
时细胞的功能代谢及结构破坏更为严重，肠道组织
释放大量的氧自由基，造成缺血再灌注损伤。研究
显示间充质干细胞能够降低缺血再灌注肝损伤的
大鼠丙二醛水平，减少由于脂质过氧化造成的大量