全自动DNA测序仪和蛋白质自动测序仪

四、荧光标记底物法测序法
DNA模板
A
延伸/终止
变性 引物
退火
测序酶 dNTPs
AG TC
荧光标记的ddNTP
确定一条染色体片断上的碱基顺序，是金标准。
Sanger法：
在PCR时加入荧光标记的复制终止剂，比如ddA,ddT,ddC,ddG（相 应于4种碱基）
ddX的两个作用：
可以当作正常碱基参与复制
▪ 测序反应的延伸阶段，ddNTP在不同位置掺入产生一系列不同长度的 新的DNA片段
二、第一代测序技术检测方法
电泳法
1
放射自显影
2
荧光标记法
3
三、荧光标记测序法
三、荧光标记测序法
荧光染料 标记法
荧光标记引物法 单色荧光标记法
荧光标记终止底物法
多色荧光标记法 荧光标记引物法 荧光标记终止底物法
DNA/蛋白质测序仪
• 45岁，女性，乳腺癌，双侧 • ER,PR阴性 • HER-2阴性
如何确定BRCA基因上的碱基排列？
• 确诊为HOBC • 对亲属进行相关的风险评估
C目录 ONTENTS
01 背景 02 DNA测序仪及其应用 03 蛋白质测序及其应用
static
dynamic
C目录 ONTENTS
T C G A
T
5’
Sequencing
123456 789
TGCTACGAT…
Image acquisition
Base calling
A
C
G
T
ASCII Character Q-score
Sequence
PF (0,1)
Read # Index # Y-coord X-coord
Tile Lane Run ID Instrument
01 DNA测序仪及其应用 02 蛋白质测序及其应用
DNA测序的发展历程
DNA测序用于确定目标DNA上片断上的碱基排列顺序； DNA测序是分子生物学过程一项非常重要的内容，在疾病 诊断、基础研究的过程中起着非常重要的作用； 人类基因组计划(Human Genome Project,HGP)完成后， 测序技术已经成为现代医学的基础。
❖ 电泳缓冲液配制不正确 ❖ 电极导线未接好或损坏 ❖ 正极或负极铂金丝断裂 ❖ 正极或负极的胶面未浸入缓冲液中
传热板粘住胶板
❖ 主要原因为上方的缓冲液室漏液
第二代测序之半导体测序法
Single Gene
Whole Genome
Whole Exome
Multi-Gene
Complexity
Sanger Sequencing
高压电源
激光激发所有通道
七、自动测序仪的结果
八、毛细管电泳型DNA测序仪的常见故障及维护
电泳时仪器显示无电流
❖电泳缓冲液蒸发使液面降低，而未能接触到毛细管 ❖电极弯曲而无法浸入缓冲液中 ❖毛细管未浸入缓冲液中 ❖毛细管内有气泡等 电极弯曲
❖安装、调整或清洗电极后未进行电极定标操作就直接执行电泳命令， 电极不能准确插入各管中
1
Library Preparation 制备文库
2
Cluster Generation 生成DNA簇
3 Sequencing 测序
4 Data Analysis 数据分析
第三代测序-pacbio
https://www.cnbwk.baidu.comogs.com/huangshujia/p/3233693.html
❖运行前未将样品盘归位、或虽然执行了归位操作，但X/Y轴归位尚未 结束就运行Z轴归位等
电泳时产生电弧
❖ 主要原因是电极、加热板或自动进样器上有灰尘沉积
其他
❖ 测序结束后应将毛细管负极端浸在蒸馏水中，避免凝 胶干燥而阻塞毛细管
❖ 定期清洗泵块 ❖ 定期更换电极缓冲液、洗涤液和废液管
电泳时仪器显示无电流
感染性疾病的分子诊断和研究 遗传性疾病的分子诊断和研究 恶性肿瘤的分子诊断和研究 在分子生物学其他领域的应用
NGS
NGS
NGS
一、半导体测序法(Ion Torrent测序)
芯片上千万个DNA 片段同时 读取序列信息
检测流程
复杂的生物信息学分析
第二代测序之边合成边终止法
边合成边测序
3’ 5’
A
C G
T
C
A
T
G A
T
G
C
T G C T A C G A T A C C C G A T C G A T
第三代测序 以纳米孔单分子测序技术为 代表，无需要PCR
第一代测序 以化学降解法和末端终止法， 具有片段长，准确性高的优 点，代表公司ABI，贝克曼
第二代测序 目前应用广泛，通量高，代 表公司Illumina以及 Thermo Fisher
第一代测序
一、第一代测序技术
❖ 测序
Sanger双脱氧链末端终止法 Maxam-Gilber化学降解法 优点：操作简单、安全、快速、准确
主流
六、自动测序仪的结构
310 3130 3130xl 3500 3500xl 3730 3730xl
计算
主机
机
分1 析
4
16 8 24
48 96
软件
耗材
检测区
凝胶区块
Anode
Buffer(+)
自动进
(-)
样器
Pump assembly
计算机分析测序数据
CCD 相机记录所有通道信号
毛细管
电泳方向
一旦链入DNA中，其后就不能再继续连接
毛细管电泳 谁终止，碱基就是谁
PCR后产物的检测仪器 一种PCR技术
全自动DNA测序仪
五、荧光标记底物自动测序仪
❖ 平板型电泳的凝胶灌制在两块玻璃板中间，聚合后厚 度一般小于0.4mm或更少，因此又称为超薄片层凝胶 电泳
❖ 毛细管电泳技术将凝胶高分子聚合物灌制于毛细管中 （内径50m～100m），在高压及较低浓度胶的条 件下实现DNA片段的快速分离
NH2
酯键 N
N
O
5'
N
9 N
HO P O CH2 OHH
O 2'H1'H
OH OH
腺苷酸
糖苷键
5’ O O O 3’ H
无3’ OH的ddNTP阻止下一个dNTP的掺入
5’
O 3’ OH
DNA模板
A 延伸/终止
变性 引物
退火
测序酶 dNTPs
AG TC
ddNTP
▪ ddNTP 被加到正在合成的链上，由于它的3’-OH已被氧化，下一个 dNTP的5’-磷酸基团不能与之形成磷酸二酯键，使合成终止
5’
Cycle 1: 第一个碱基结合 检测光信息 切掉终止子和染料
Cycle 2-n: 循环 (Repeat)
3’ 5’
DNA (0.1-1.0 ug)
Library preparation
Cluster generation
AG C
A T
C G
A T CG
T
T G C
T A C G A
T A C C C G A