细菌外膜蛋白提取方法

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细菌外膜囊泡载体及其制备方法与应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202110129743.9(22)申请日 2021.01.29(71)申请人国家纳米科学中心地址 100190 北京市海淀区中关村北一条11号(72)发明人聂广军　赵潇　赵宇亮　梁洁　(74)专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司 11002代理人黄爽(51)Int.Cl.A61K 47/46(2006.01)A61K 9/127(2006.01)A61K 47/68(2017.01)A61K 47/69(2017.01)A61K 39/00(2006.01)A61P 35/00(2006.01)A61P 35/04(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 15/62(2006.01)C12N 1/21(2006.01)C12R 1/19(2006.01) (54)发明名称细菌外膜囊泡载体及其制备方法与应用(57)摘要本发明提供一种细菌外膜囊泡载体及其制备方法与应用。

本发明提供了基于金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域SPAb构建的，以细菌外膜囊泡为基础的可以靶向树突状细胞的疫苗通用载体OMV ‑SpyC ‑SPAb，金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域SPAb展示于细菌外膜囊泡上，可与靶向树突状细胞的抗体(如Anti ‑DEC205抗体)快速结合，并通过SpyCatcher/SpyTag分子胶水将抗原展示在细菌外膜囊泡表面，制备出可以靶向树突状细胞，明显增强抗原摄入的新型OMV ‑OVA ‑DEC疫苗，能够促进树突状细胞对抗原的交叉提呈，诱导特异性免疫应答，从而达到抗肿瘤的目的，具有广阔的应用前景。

权利要求书1页说明书7页序列表7页附图3页CN 112773901 A 2021.05.11C N 112773901A1.细菌外膜囊泡载体，其特征在于，所述细菌外膜囊泡载体为携带有金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域和SpyCatcher蛋白的细菌外膜囊泡；其中，金黄色葡萄球菌蛋白A的B结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，SpyCatcher 蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。

细菌外膜囊泡研究进展

细菌外膜囊泡研究进展一、本文概述细菌外膜囊泡（Bacterial Outer Membrane Vesicles，简称OMVs）是近年来微生物学领域的研究热点之一，它们是由革兰氏阴性细菌外膜衍生出的纳米级囊泡结构。

OMVs在细菌生物学、感染机制、疫苗开发以及药物传递等多个方面都具有重要的应用价值。

本文旨在综述细菌外膜囊泡的研究进展，包括其结构特性、生成机制、功能与应用等方面的最新研究成果。

通过深入了解OMVs的生物学特性及其潜在应用，有望为未来的抗感染治疗、疫苗研发以及药物传递等领域提供新的思路和方法。

二、细菌外膜囊泡的结构与功能细菌外膜囊泡（Outer Membrane Vesicles, OMVs）是革兰氏阴性菌释放的一种纳米级膜囊泡，具有独特的双层膜结构，外层由细菌的外膜组成，内层则为周质空间。

这种结构使得OMVs能够携带并传递多种生物活性分子，如毒素、酶、DNA和RNA等。

在功能上，OMVs扮演着多重角色。

它们是细菌与宿主细胞间交流的重要媒介。

细菌通过OMVs向宿主细胞传递信号分子，进而调控宿主细胞的生理活动。

OMVs在细菌致病过程中发挥关键作用。

它们能够保护并传递毒素和酶至宿主细胞内，导致细胞损伤和疾病发生。

OMVs还参与细菌生物被膜的形成和维持，增强了细菌对环境的适应能力。

近年来，随着对OMVs研究的深入，人们发现它们在疫苗开发、药物传递和生物传感器等领域具有广阔的应用前景。

例如，利用OMVs 作为疫苗载体，可以高效地递送抗原至宿主细胞，诱导产生强烈的免疫应答。

OMVs也可作为药物传递系统，将药物精确地运送至病变部位，提高治疗效果。

然而，目前对OMVs的研究仍处于起步阶段，许多关键问题亟待解决。

例如，OMVs的精确释放机制、与宿主细胞的相互作用方式以及其在不同生理环境下的功能变化等。

未来，随着研究的深入和技术的发展，我们有望更加全面地了解OMVs的结构与功能，进而为疾病治疗和生物技术的发展提供新的思路和方法。

大肠杆菌表达外膜蛋白的分子机理探究

大肠杆菌表达外膜蛋白的分子机理探究大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的肠道细菌，在肠道内起着重要的生物学作用。

而外膜蛋白是大肠杆菌外部的结构蛋白质，不仅是细菌再生产和存活过程中不可或缺的组成部分，还能直接参与到病原菌对宿主的感染过程。

因此，对大肠杆菌表达外膜蛋白的分子机理的研究具有重要的科学价值和应用前景。

I. 外膜蛋白的结构及特征外膜蛋白是大肠杆菌细胞壁的主要成分之一，其结构特点也决定了其在菌体功能中的重要性。

大肠杆菌的细胞壁大致分为内膜、外膜和周质三部分，外膜主要含有外膜蛋白、脂肪膜和脂多糖。

外膜蛋白通常被分类为β－桶型蛋白和α－螺旋类蛋白，其中β－桶型蛋白是外膜蛋白中最主要的类型。

β－桶型蛋白由若干折叠后的β－片段环绕而成，在大肠杆菌中外膜蛋白的长度约为500-1000个氨基酸残基。

β－桶型蛋白比较稳定，能够有效地匹配并保持在细胞外极端恶劣的环境中不分解。

此外，β－桶型蛋白在外表面上密集的分布着各种蛋白质，如菌毒素、糖蛋白等。

它们通过外膜蛋白的通道结构传递进入到大肠杆菌的细胞内，对细胞功能产生巨大影响。

II. 外膜蛋白的表达大肠杆菌细胞表达外膜蛋白的过程主要包含五个环节：转录、翻译、折叠、定位和组装。

其中，折叠和定位过程是外膜蛋白表达的瓶颈之一。

（一）翻译外膜蛋白的翻译过程与一般蛋白的翻译不同。

在一般翻译过程中，新合成的蛋白在核糖体上翻译完成后即被释放到细胞质内。

而在外膜蛋白翻译中，外膜蛋白中的N-端带有靶向信号，可以被一个叫做信号识别粒子（signal recognition particle,SRP）的嵌合物所捕获。

SRP与膜上受体切换复合物（translocon）结合后，把这个嵌合物复合体转移到细胞内膜并将其定向输送到以“落后”的方式解铅的玻璃门。

（二）折叠外膜蛋白在整个折叠和定向过程中，需要受到一定的帮助才能达到正确的构象。

在外膜蛋白表达过程中，折叠帮助系统对于外膜蛋白的安全折叠和组装非常重要。

外膜蛋白结构及分类

吞噬细胞吞噬。淋病奈瑟氏菌外膜蛋白111刺激机体产生
阻抑抗体,与特异性抗原结合而抑制杀菌抗体的活性。
( 一 ) OMP A主要作用是维持外膜的完整 , 同时它也是噬菌体和大肠菌素的受体,参与F菌毛介导的接合过程。布鲁氏菌 OMP19 的主要作用也是维持外膜结构（二）微孔蛋白具有转运和通透作用,即允许营养物质的流入,而在有害物质进入时则形成渗透障碍。 OMP C则构成了1.08 nm的孔,此种孔能把胆汁盐排斥在细胞外,并能减慢营养物质透过膜的速度。（三）脂蛋白促使肽聚糖与细菌外膜层的连接更加牢固，其作用主要是维持细菌外膜结构的稳定性，但并非是细菌生长所必需的。还参与营养物质及矿物质的转运，且大肠杆菌的脂蛋白还可作为噬菌体的受体。
2.按其存在位置与分离难易度不同分为膜内在蛋白和膜周边蛋白
膜内在蛋白约占外膜蛋白的70~80%,因其部分
或全部镶嵌于脂质双层中,需使用剧烈条件才能把它们分离开来一般讲只有用去垢剂(detergent) 使膜解后才可分离出来。
膜周边蛋白是分布于膜外表面的水溶性蛋白, 约占外膜蛋白的20~30%,是通过离子键或其它非共价键与膜蛋白分子或脂分子相连,结合力较弱, 因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。
蛋白分子间交联形成寡聚体,并通过3个脂肪酸与
外膜疏水结合,因此它不具有作为噬菌体受体和大肠菌素受体的功能
次要外膜蛋白有20多种,其在细胞内的拷贝数为
1x103~1x104。
但Omp的数量及种类随着不同菌株及不同培养条件而有
所变化,如E.coli在富含麦芽糖培养基中培养时,lamB蛋白为主要蛋白,而当细菌在无铁条件下培养时,FepA蛋白则成为主要蛋白。

大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT的克隆及表达

中国农业科技导报，2011，13(2):53－58Journal of Agricultural Science and Technology收稿日期:2010-11-29;接受日期:2011-01-26基金项目:国际科技合作项目(2008DFA32080)资助。

作者简介:董世雷，硕士研究生，主要从事微生物与分子生物学的研究。

E-mail :dsl166@126．com 。

通讯作者:王欣，研究员，博士，主要从事微生物生态与免疫方面的研究。

Tel :0571-86415126;E-mail :xxww101@sina．com 大肠杆菌外膜蛋白酶基因OmpT 的克隆及表达董世雷1，2，刘伟2，朱立颖2，王学琴3，于宏伟4，王欣2(1．浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华321004;2．浙江省农业科学院植物保护与微生物研究所，杭州310021;3．内蒙古工业大学化工学院，呼和浩特010051;4．马歇尔大学微生物学与免疫学院，亨廷顿25755，美国)摘要:OmpT (Outer-membrane proteases T )是革兰氏阴性细菌分泌到细胞表面具有丝氨酸蛋白酶活性的一种重要蛋白。

利用大肠杆菌OmpT 降解抗菌肽特性来筛选和改造新型抗菌肽，可以为开发抗OmpT 蛋白酶水解新抗菌肽序列提供新的思路和创造条件。

根据大肠杆菌外膜蛋白酶OmpT 的基因序列设计一对引物，应用聚合酶链式反应(PCR )方法，从大肠杆菌K12基因组中扩增获得一段为954bp 的序列，测序结果显示此序列与已公布序列同源性达99．99%。

将其序列定向克隆到原核表达载体pET28a 上构建重组表达质粒pET28a-OmpT 。

经IPTG 诱导后，在表达宿主菌中特异性的表达出分子量约为36kDa 且具有生物活性的OmpT 蛋白。

生长曲线试验显示，抗菌肽LL37对带重组表达质粒pET28a-OmpT 的大肠杆菌生长没有影响，而对照组的生长明显受到抗菌肽的抑制作用。

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH原核表达载体的构建与表达罗晓庆;孙济宇;王慧;王晓波;王琪;蒋瑞雪【摘要】目的：克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprH基因，构建其原核表达载体并鉴定其表达。

方法从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA进行PCR扩增OprH基因；采用T-A克隆技术构建pMD19T-OprH重组质粒，并经酶切和序列测定后，获得OprH片段插入到原核表达载体pET28b中，以构建pET28b-OprH重组表达质粒，并在表达宿主菌E�Coli BL21中经IPTG诱导表达及通过SDS-PAGE电泳鉴定。

结果 pET28b-OprH原核表达载体构建成功；重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprH。

结论成功克隆了OprH基因并获得原核表达物，为进一步研究快速检测该菌的方法奠定了基础。

%Objective To clone the gene of outer membrane protein OprH of Pseudomonas aeruginosa ( PA) , construct a prokaryotic expression vector and identify its expression. Method The DNA genome was extracted from PA, the OprH gene was amplified by primersof PCR. The recombinant plasmid pMD19T-OprH was constructed by using T-A cloning. After enzyme digestion and sequence analysis, the OprH gene was inserted into prokaryotic expression vector pET28b to construct recombinant expression plasmid pET28b-oprH, which was expressed in E. coli BL21 (DE3) cells with induction by IPTG. Then the expressed protein was analyzed by SDS-PAGE. Result Construction of the prokaryotic ex-pression vector pET28b-oprH was successful. Then the recombinant expression plasmid expressed a corresponding protein OprH after being induced by IPTG. Conclusion OprH gene was successfully cloned and theprokaryotic expression product was obtained. It provides the basis for investigating a method of rapid detection of PA.【期刊名称】《中国烧伤创疡杂志》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】4页(P195-198)【关键词】铜绿假单胞菌;外膜蛋白;原核表达载体;重组质粒【作者】罗晓庆;孙济宇;王慧;王晓波;王琪;蒋瑞雪【作者单位】161006 黑龙江齐齐哈尔，齐齐哈尔医学院免疫教研室;161000 黑龙江齐齐哈尔，齐齐哈尔医学院附属第三医院烧伤科;161006 黑龙江齐齐哈尔，齐齐哈尔医学院免疫教研室;161000 黑龙江齐齐哈尔，齐齐哈尔医学院附属第三医院烧伤科;161006 黑龙江齐齐哈尔，齐齐哈尔医学院免疫教研室;161006 黑龙江齐齐哈尔，齐齐哈尔医学院免疫教研室【正文语种】中文铜绿假单胞菌为条件致病菌，是医源性感染的主要病原菌之一，广泛分布于自然界的土壤、水、空气及人体皮肤、肠道、呼吸道内。

蛋白质膜分离

蛋白质膜分离是一种实验技术，用于将细胞膜中的蛋白质与其他细胞组分分离开来，以便对其进行进一步的研究和分析。

这种技术常用于生物学和生物化学研究中，特别是在研究细胞膜蛋白的结构、功能和相互作用方面。

常见的蛋白质膜分离方法包括：
1. 亲和纯化：利用蛋白质与某些特定配体（例如抗体、配体分子等）之间的特异性相互作用，将目标蛋白质从混合物中纯化出来。

例如，可以使用标记有特定抗体的磁珠或琼脂糖柱进行亲和纯化。

2. 凝胶电泳：利用凝胶电泳技术，根据蛋白质的大小、电荷等特性将蛋白质从混合物中分离出来。

常用的凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和原位凝胶电泳（Native PAGE）。

3. 离心分离：利用离心技术，将细胞裂解液或组织匀浆在不同离心速度下离心，从而分离出不同密度或大小的细胞组分。

通过不同离心速度的选择，可以将膜蛋白从其他细胞组分中分离出来。

4. 超声波破碎：利用超声波对细胞进行破碎，将细胞膜破碎释放出的膜蛋白与其他细胞组分分离开来。

5. 亲水性与疏水性分离：利用膜蛋白通常具有的疏水性和亲水性特点，采用相应的溶剂或条件将其从其他细胞组分中分离出来。

例如，可以利用疏水性相互作用将膜蛋白从细胞溶液中提取到有机溶剂中。

这些方法通常会根据具体的研究目的和实验条件进行选择和优化，以达到最佳的分离效果。

在实际操作中，常常需要结合多种方法进行蛋白质膜的分离和纯化。

铜绿假单胞菌外膜亚蛋白质组图谱的建立

桂酰基氨酸钠，再次超速离心，淀溶于样品裂解液（沉７
ｍｏ／ｌＬ尿素，ｌＬ硫尿，％Ｃ２ｍｏ／４ＨＡＰ１ＤＳ，ＴＴ）室，
温裂解２ｈ上清用Ｂａｆｒ法测定蛋白浓度，，ｒｄｏｄ分装后
关键词：绿假单胞菌；铜外膜蛋白；白质组学；蛋免疫学
中图分类号：８Ｑ７４
文献标识码：Ａ
文章编号：４８４９２０）１１１５０３— ７（０８０— １— ０００
铜绿假单胞菌是人类机会致病菌，为革兰氏阴性
ｎｓ厦大生物学系胡志钰老师惠赠，ｏａ为大肠杆菌工程菌株为大肠杆菌Ｄａ和Ｂ２（３，实验室保Ｈ５Ｌ１ＤＥ）本
得到应用Ｊ．
１２方法．
１２１外膜蛋白的提取．．
按参考文献Ｅ３行．Ｌ培养基中接种Ｐ．８进在Ｂ
ａｒｇｎｓ，ｅｕｉｏａ培养至Ｏｏ１０离心后， ℃ 超声破碎Ｄ６．，ｏ４细菌，去除菌体碎片后，超速离心，淀购自大连宝（ａａａ生物工程公司，Ｔｋｒ）所用引物均为上海生工生物工程技术服务有限公司合成；它试其
剂均为国产分析纯试剂．
硫菌）Ｌｐｏｐｒ（端螺旋体）Ｍｅｈｌｃｃｕａ — ，ｅｔｓｉ钩ａ，ｔｙｏｏｃｓｐｃｓｌｔｓ荚膜甲基球菌）ｕａｕ（等多种革兰氏阴性菌的研究中

TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白

TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白摘要】目的：建立一种快速方便提取大肠杆菌膜蛋白的方法。

方法：收集临床分离的大肠杆菌，利用TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，运用表面增强激光解析电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）进行质谱分析，采用CiphergenProteinchip软件采集数据。

重复测定20次大肠杆菌的混合标本，评价TritonX-114去污剂法提取大肠杆菌膜蛋白的重复性。

结果：TritonX-114去污剂法成功提取出了大肠杆菌膜蛋白。

重复测定20次大肠杆菌的混合标本，蛋白峰的分子量变异系数均小于0.05%。

结论：TritonX-114去污剂法可以快速方便的提取大肠杆菌膜蛋白，并具有很好的重复性，这不仅对大肠杆菌耐药机制和治疗方法的研究起着重要作用，也为膜蛋白的快速提取提供了新的思路。

【关键词】大肠杆菌；膜蛋白；TritonX-114；表面增强激光解析电离飞行时间质谱【中图分类号】R446 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）12-0059-03MEMBRANE PROTEINS OF ESCHERICHIA COLI WERE EXTRACTED BY USING TRITON- X-114 Wang Qin, Xu Jian, LIiu Chenggui.Clinical Laboratory of Chengdu Women and Children Center Hospital, Chengdu, Sichuan, 610091, China【Abstract】Objective To establish a rapid and convenient extracted method of membrane proteins from Escherichia coli. Methods The clinical isolates of E. coli were collected, membrane proteins of E. coli were extracted by using Triton X-114 detergent, and protein concentrations were detected by Bradford method. The membrane proteins of E. coli were analyzed by surface enhanced laser desorption /ionizationtime-of-flight mass spectrometry (SELDI-TOF- MS), and the data was collected by Ciphergen Proteinchip software. The mixed proteins of E. coli were measured for twenty times to evaluate the repeatability. Results The membrane proteins of E. coli were successfully extracted by using Triton X-114 detergent. The mixed samples of E. coli were measured for twenty times, and the results showed that the CV of protein in molecular weight was less than 0.05%. Conclusion The membrane protein of E. coli can be extracted quickly and easily by using Triton X-114 detergent. This method has good repeatability, which provides a new idea for the extraction of membrane protein, this study not only make an important role in the research of E. coli resistance mechanisms and treatment, but also is beneficial to the further study of membrane proteomics.【Key words】Escherichia coli; Membrane protein; Triton X-114; SELDI-TOF- MS 大肠杆菌(E.coli)是引起临床感染最常见的革兰阴性杆菌，该菌易产生超广谱B-内酰胺酶（ESBL），从而导致对第三代头孢菌素耐药，甚至引起严重的院内感染暴发[1]。

人工促使细菌分泌外膜囊泡及细菌外膜囊泡对植物体效用的研究

人工促使细菌分泌外膜囊泡及细菌外膜囊泡对植物体效用的研究1.1摘要：细菌外囊泡在药物靶向中有巨大研究价值，但目前还没有将其应用在植物体上的研究。

本实验通过逆境威胁的方式促使细菌分泌囊泡，再用离心的方法从细菌中分离出细菌外囊泡，再将其作用于植物根部，并观察其在根部的富集程度已确定其靶向性。

本实验具有创新性的特点，也许会为植物疾病防治提供新的思路。

实验后得出结论，研究的细菌外囊泡在根部会有一定的富集作用，具有一定的靶向性，且细菌外囊泡会被植物吸收。

不同细菌的外囊泡也许对同种植物根部的靶向能力不同，不同植物对一种细菌外囊泡也许会有不同的反应。

这是这项研究的一片蓝海。

1.2关键词：细菌外囊泡纳米粒子靶向荧光探针标记1概述1.1目的：本选题的目的在于对细菌外囊泡纳米粒子的标准化制备以及探索细菌外囊泡纳米粒子对植物根部靶向能力的强弱。

1.2背景和意义：对于核果类果树来说，根瘤（根癌）是一大顽疾，发病率高，治疗困难，危害也大，轻则树势衰弱，重则死树。

首先，需要明确的是，根癌病是一种细菌性病害，病原是一种根癌土壤杆菌，属于农杆菌属。

病原菌主要危害果树根颈部以及组织连接处（主侧根连接处、砧穗接合处等）根癌病原菌通过根系、颈部等伤口侵入树体，诱导细胞进行无序分裂、生长，最终造成组织增生肥大，形成“瘤”。

对于根癌病，目前以防为主的观念，一旦发病，治疗相对困难。

因此非常有必要开发一种能够对根癌病有治疗效果的药剂。

纳米农药载体在药学应用中占据极为重要的地位[1]，这类纳米微粒，由天然高分子或合成类高分子化合物制成，能够将药物包封在其中，形成纳米载药传递系统。

纳米载药技术在药物传送方面具有许多自身特有的优势[2]，但是同时也一直都存在着一个问题，就是所有表面无修饰的外源性纳米药物均不能较好到达靶向部位[3]。

近年来，纳米科技发展迅速，因纳米材料具备许多新的理化特性，如小尺寸效应、大比表面积、量子效应等。

这些特性使得纳米材料越来越多地应用于电子、医学等多个领域[4]。

微生物检验技术专业实践能力-2-1

微生物检验技术专业实践能力-2-1(总分：68.00，做题时间：90分钟)一、单项选择题(总题数：68，分数：68.00)1.细胞的长期保存，一般采用∙A．肉汤—20℃冻存∙B．甘油—70℃保存∙C．DMSO液氮保存∙D．MSO—70℃保存∙E．冻干保存（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：细胞低温冷冻保存是常用的细胞保存方法，细胞加入冻存液二甲亚砜(DMSO)，保存在液氮中，温度达-196℃，可长期保存。

2.实验室常用盐析法分离和纯化蛋白，常用的盐是∙A．硫酸钙∙B．硫酸锰∙C．硫酸铵∙D．硫酸汞∙E．硫酸镁（分数：1.00）A.B.C. √D.E.解析：实验室常用盐析法分离和纯化蛋白，蛋白质在低盐浓度下的溶解度随着盐液浓度升高而增加，当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度又以不同程度下降并先后析出。

蛋白质盐析法应用最广的是硫酸铵，因其具有盐析的有效性好、pH范围广、溶解度高等优良特性。

3.抗酸染色的脱色剂是∙A．75%乙醇∙B．95%乙醇∙C．甲醇∙D．盐酸乙醇∙E．异丙醇（分数：1.00）A.B.C.D. √E.解析：抗酸性细菌，一般染色不易着色，需用抗酸染色法。

抗酸性细菌一旦着色，能抵抗3%盐酸乙醇的脱色作用而保持红色，为抗酸染色阳性。

非抗酸性细菌则被3%盐酸乙醇脱色而复染成蓝色，为抗酸染色阴性。

4.病毒培养应选用合适的∙A．液体培养基∙B．活细胞培养基∙C．特殊培养基∙D．厌氧培养基∙E．选择培养基（分数：1.00）A.B. √C.D.E.解析：病毒缺乏完整的酶系统，无细胞器，不能独立进行代谢活动，故不能在无生命的培养基内生长繁殖，而只能寄生于活细胞内，依靠宿主细胞提供原料和酶系统进行病毒增殖。

病毒的分离可用细胞培养或动物接种和传代。

5.药敏试验中，纸片琼脂扩散法简称∙A．M—H法∙B．E试验∙C．纸碟法∙D．MIC法∙E．Kirbv—Bauer法（分数：1.00）A.B.C.D.E. √解析：目前常用的药敏试验方法是Kirby—Bauer-建立的纸片琼脂扩散法，简称K—B法。

膜蛋白的提取与分离资料

膜蛋白的提取与分离膜蛋白的分离一、简介：1细胞质膜资料1895年,Overton从研究细胞透性得出"细胞膜由连续的脂类物质组成"。

1925年Gorter&Grendel:用脂单分子膜技术测定细胞膜中脂分子的总面积，提出："细胞膜是由双层脂分子组成"。

1935年Danielli&Davson：从测定膜的表面张力得出细胞膜的"三明治结构模型"，即蛋白质－脂-蛋白质。

1959年Robertson:用电镜观察生物膜提出"单位膜模型"，将膜的分子结构与超微机构统一起来厚度：2(暗)+3.5(亮)+2（暗）=7.5细胞质膜的主要功能概括如下：(1)为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境;(2)选择性的物质运输，包括代谢底物的输入与代谢产物的排除，其中伴随着能量的传递；(3)提供细胞识别位点，并完成细胞内外信息跨膜传递；(4)为多种酶提供结合位点，使酶促反应高效而有序地进行；(5)介导细胞与细胞、细胞与基质之间的连接;质膜参与形成具有不同功能的细胞表面特化结构。

2膜蛋白虽动物细胞主要有9种膜脂，而膜蛋白的种类繁多，多数膜蛋白分子数目较少，但却赋予细胞膜非常重要的生物学功能。

根据膜蛋白分离的难易及其与脂分子的结合方式，膜蛋白可分为两大类型：外在膜蛋白、内在膜蛋白。

(1)外在膜蛋白为水溶性蛋白，靠离子键或其它较弱的键与膜表面的蛋白质分子或脂分子结合，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以从膜上分离下来，膜结构并不被破坏。

(2)内在膜蛋白与膜结合非常紧密，一般讲只有用去垢剂(detergent)使膜解后才可分离出来。

获得大量有生物学活性的质膜蛋白对我们显得非常的重要。

附注：使用分级抽提方法获得的“膜蛋白”中只有很少一部分是具备多跨膜区的整和膜蛋白，膜蛋白，到目前为止，仍然是蛋白组学的一个瓶颈，不管采用２－Ｄ技术也好，ＩＣＡＴ乃至proein microarray都还不能有效解决这一问题。

利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制

利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制一、引言大肠杆菌是常见的肠道细菌，其周质蛋白在生物学研究中具有重要作用。

然而，提取大肠杆菌周质蛋白是一项困难而复杂的任务。

渗透休克法是一种有效的提取大肠杆菌周质蛋白的方法，本文将详细介绍该方法的机制。

二、渗透休克法概述1. 渗透休克法简介渗透休克法是一种用于提取细胞外蛋白质的方法。

该方法通过改变环境渗透压和离子浓度来破坏细胞壁和膜，使蛋白质从细胞内部释放出来。

2. 渗透休克法原理渗透休克法主要基于以下两个原理：（1）离子浓度变化原理：当外部离子浓度高于内部时，会导致水分子从内向外扩散，使细胞壁和膜破裂。

（2）渗透压变化原理：当外部溶液浓度高于内部时，会导致水分子从内向外扩散，使细胞壁和膜破裂。

3. 渗透休克法步骤渗透休克法主要分为以下几个步骤：（1）培养大肠杆菌至对数生长期。

（2）离心收集细胞，去除培养基。

（3）用低盐缓冲液洗涤细胞，去除表面上的杂质。

（4）将细胞悬浮于高盐缓冲液中，在室温下静置一段时间，使蛋白质从细胞内部释放出来。

（5）离心收集上清液，即为提取的周质蛋白。

三、利用渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的机制1. 大肠杆菌周质蛋白结构大肠杆菌周质蛋白是一种位于外膜和细胞壁之间的结构蛋白。

其主要成分是β-折叠结构和α-螺旋结构。

由于其结构复杂，因此难以直接提取。

2. 渗透休克法提取机制渗透休克法可以通过以下几个方面来提取大肠杆菌周质蛋白：（1）高盐浓度：高盐缓冲液中的离子浓度高于细胞内部，会导致水分子从细胞内向外扩散，使细胞壁和膜破裂，从而释放出周质蛋白。

（2）渗透压变化：高盐缓冲液中的渗透压高于细胞内部，也会导致水分子从细胞内向外扩散，使细胞壁和膜破裂。

（3）蛋白质结构：大肠杆菌周质蛋白的β-折叠结构和α-螺旋结构在高盐缓冲液中容易发生变性，从而释放出来。

3. 渗透休克法提取大肠杆菌周质蛋白的优点渗透休克法具有以下几个优点：（1）简单易行：该方法操作简单、快速、易行。

细菌外囊泡omv制备

细菌外囊泡omv制备
细菌外囊泡（OMV）是一种细菌释放的囊泡，它们包含有细菌外膜的脂质双层以及一些与细菌生长和代谢相关的蛋白质和生物活性物质。

OMV的制备过程通常涉及以下步骤：
1. 培养细菌，首先，需要培养所需的细菌菌株。

通常会选择一种产生OMV的细菌，如大肠杆菌、沙门氏菌等。

培养条件需要根据具体的菌株而定，包括温度、培养基成分等。

2. 收获细菌，当细菌达到适当的生长密度时，可以通过离心等方法将细菌从培养基中收获出来。

3. 处理细菌，收获的细菌需要经过一系列的处理步骤，包括洗涤、裂解等，以去除细菌本体的部分，并释放OMV。

4. 分离OMV，经过处理后的细菌悬液需要进行离心等操作，以分离出含有OMV的上清液。

5. 纯化OMV，分离得到的含有OMV的上清液需要进行进一步的纯化步骤，以去除杂质和未包裹的蛋白质等。

6. 表征OMV，最后，需要对纯化得到的OMV进行表征，包括测定其粒径分布、蛋白质组成、内含物质等，以确保其质量和特性符合要求。

在细菌外囊泡的制备过程中，需要严格控制各个步骤的条件和操作，以确保最终得到的OMV具有稳定的质量和活性。

此外，不同的细菌菌株和制备方法可能会导致最终OMV的性质有所差异，因此在制备过程中需要根据具体情况进行调整和优化。

同时，制备OMV 的过程也需要遵守相关的生物安全和实验规范，以确保实验操作的安全性和合规性。

外膜蛋白的结构_功能及应用研究进展_张丽芳

外膜蛋白的结构、功能及应用研究进展张丽芳，罗薇（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都　６１００４１）摘要：外膜蛋白是原核生物细胞膜的重要组成成分之一，在维持细菌正常形态结构及细菌在机体内的生存和繁殖中发挥着不可替代的作用。

作者将对其结构、功能及临床应用等方面的研究成果进行综述，以期为今后基础研究、疾病诊断和临床治疗方面提供有力的理论及研究基础。

关键词：外膜蛋白；形态结构；功能；临床应用中图分类号：Ｑ５１文献标识码：Ａ文章编号：１６７１－７２３６（２０１４）１０－００５５－０７外膜蛋白（ｏｕｔｅｒ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ，ＯＭＰ）是一种特殊的蛋白质，仅存在于革兰氏阴性菌中，在细胞膜表面或镶嵌其中，除有常规蛋白功能外还有抗原性等多种功能，有很强的免疫原性，同时与其他物质发生协同作用增强细菌的致病性。

随着对外膜蛋白分子免疫学和基因的分析，它在临床诊断和疾病预防方面具有一定的潜力。

近些年来越来越多研究人员对其产生兴趣并进行研究。

现将外膜蛋白的结构、功能及临床应用等方面的研究成果进行综述，以期为今后基础研究、疾病诊断和临床治疗提供有力的理论及研究基础。

１　外膜蛋白的结构和功能早期，人们对外膜蛋白的认识仅局限于其是镶收稿日期：２０１４－０４－１４作者简介：张丽芳（１９９０－），女，青海人，硕士生，研究方向：动物传染病防治。

通信作者：罗薇（１９６２－），女，四川人，硕士生导师，从事动物传染病诊断和防治研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：１３６７８００６６６０＠１６３．ｃｏｍ基金项目：四川省科技厅应用基础研究“丙型副伤寒沙门氏菌感染动物模型的建立及其致病机理的研究”（２０１３ＪＹ００４５）。

嵌于脂质双分子层结构中的多种蛋白，分为微孔蛋白、脂蛋白、外膜Ａ蛋白（ＯｍｐＡ）等主要蛋白和微量蛋白等几种常见类型。

微孔蛋白由３个序列不同但分子质量相同的亚单位组成，在细胞膜上形成一条管道通道，通常以非共价键形式紧密的连接肽聚糖和脂多糖，一些革兰氏阴性菌的外膜孔道蛋白在脂质体膨胀过程中发挥渗透作用（Ｔｏｋｕｎａｇａ等，２０１２），因此此蛋白具有渗透特性。