生化实验课-琥珀酸脱氢酶 ppt课件
最新实验5琥珀酸脱氢酶ALTPPT课件
分光光度计的使用
样品池
波长
毛面
读数
光面
拉杆，1-4档
1. 打开电源，调节旋钮至需要的波长，预热20~30min 2. 1档（空白管），T模式调100%，显示“Blank”、“100” 3. 拉杆拉至1.5档，T模式下调0%，显示“0.00” 4. 换到A模式，拉至2、3、4档，读取各个样品的吸光度
结束语
谢谢大家聆听！！！
19
实验结果
方法一：以空白管调0，测A测定、A标准、A对照
谷丙转氨酶活性单位/mL鼠肝匀浆 = ? U/ml
测定管中生成丙酮酸的质量
=
—A—测定— A标准
×
m标准
对照管中生成丙酮酸的质量
=
—A—对照— A标准
×
m标准
30min中生成丙酮酸的质量 = m测定 – m对照
=
—A测—定—-A—对照— A标准
血清谷-丙转氨酶活性单位
在pH 7.4、37℃条件下， 每毫升肝匀浆与底物保温30min后， 每生成2.5 g的丙酮酸作为 1个谷-丙转氨酶的活性单位， 血清中GPT正常值为2-40 U/mL。
实验步骤
标准管法测定酶活性： 1、取干燥试管4支，标号
测定管 对照管 标准管 空白管 2、依次加入试剂，混匀，37℃保温 3、呈色反应后，520nm比色测OD值
实验目的
了解琥珀酸脱氢酶的作用及 酶促反应中的竞争性抑制作用
注意事项
注意区分肌肉与筋膜； 家兔肌肉必须充分剪碎碾磨，海砂不可加太多； 12 ml缓冲液要分次加入，不可一次性加入； 碾磨器械、纱布要及时清洗，纱布要洗干净晾干； 滴加试剂时，一定要看清试剂的名称和浓度； 滴加液体石蜡时沿着管壁倾斜加入，盖住液面即可； 观察结果时不能振摇试管，避免甲烯白重新氧化变蓝； 实验完成后试管要用皂粉清洗。
《生物化学》实验课件：实验三 组织匀浆的制备方法和琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制的观察
血液化学分析干扰少。
• 肝素抗凝血不宜作血细胞培养，不宜作纤维蛋白原测定，作 DC时，染色性较差。作血液量元素分析时慎用。
• 一般配成1%水溶液，取0.5ml于试管，37～50℃烘干，可抗 凝5ml血液。
• 2．血液样品的区别 • ①血浆与血清的区别 • 血浆：抗凝采血后立即分离，含有纤维蛋原和前凝血酶 • 血清：血液凝固，血清析出后分离，不含纤维蛋原和前
凝血酶。 • ②全血一般用于血细胞分析，不宜作系列化分析。
生化分析一般用血清或血浆。
• 3．常用抗凝剂
• ①EDTA—Na2 ：能较好地保存血细胞成分，可得较纯的细胞 悬液。对血细胞形态影响很小，适于血细胞分析。
剪碎，
3-4ml 1/15mol/L Na2HPO4 1 g 猪心
匀浆
6-7ml, 1/15mol/L Na2HPO4
放置20min
2000r / min 上 清 液 离心10min （酶液）
细胞破碎
抽提
分离
2ห้องสมุดไป่ตู้ 琥珀酸脱氢酶的作用及酶竞争抑制作用的观察
试管号
1 2 3 4
心脏提取 琥珀酸钠 丙二酸钠 蒸馏水
实验器材与试剂:
（一）试剂 pH=7.4 磷酸缓冲液 1.5% 琥珀酸钠溶液 1% 丙二酸钠溶液 0.02% 甲烯蓝溶液 生理盐水 液体石蜡
实验器材与试剂：
（二）器材
研钵、手术剪、手术镊子 2 mL 移液管 1000 uL微量可调仪器 10 mL 离心管 低速离心机等
实验操作：
1. 琥珀酸脱氢酶酶液的制备
本实验设计在无氧的条件下使底物脱下来的氢交给氧化型的受氢体甲烯 蓝（蓝色）使之成为还原型受氢体甲烯白（无色），通过观察蓝色到无色的 变化从而了解脱氢酶的活性。
琥珀酸脱氢酶15生物化学实验--琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用
琥珀酸脱氢酶 15生物化学实验--琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用琥珀酸脱氢酶的作用及丙二酸的抑制作用【目的】1 ．掌握琥珀酸脱氢酶作用及丙二酸抑制作用的实验技术与原理。
2 ．深化理解酶的竞争性抑制作用的特点。
【原理】肌肉组织含有的琥珀酸脱氢酶是一种结合蛋白酶，以FAD 为辅基。
它能催化琥珀酸脱氢生成延胡索酸，FAD 接受氢生成FAD2H 。
体外实验以美蓝( 甲烯蓝) 为受氢体，使美蓝还原生成美白( 甲烯白) 。
其反应如下：琥珀酸脱氢酶活性越高，美蓝脱色所需的时间越短，由于美白易被空气中的氧氧化成美蓝。
故实验需在无氧条件下进行，可加一层液体石蜡以隔绝空气。
丙二酸与琥珀酸的化学结构很相似，能和琥珀酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合，从而抑制琥珀酸的脱氢作用。
其抑制程度与抑制剂和底物二者的浓度有关。
本实验通过不同浓度的琥珀酸和丙二酸来观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制作用。
【器材】 1 ．研钵与剪刀 2 ．漏斗 3 ．纱布 4 ．恒温水浴【试剂】1 ．0.2mol/L 琥珀酸溶液2 ．0.02mol/L 琥珀酸溶液3 ．0.2mol/L 丙二酸溶液4 ．0.02mol/L 丙二酸溶液以上四种溶液均先用5mol/L NaOH 溶液调至pH7.0 ，再用0.01mol/L NaOH 溶液调至pH7.4 。
直接用琥珀酸钠或丙二酸钠配制亦可。
5 ．1/15mol/L 磷酸盐缓冲液（pH7.4 ）1/15mol/L Na 2 HPO 4 80.8ml 与1/15mol/L KH 2 PO 4 19.2ml 混匀即可。
6 ．0.02% 美蓝溶液7 ．液体石蜡【操作】1 ．肌肉提取液的制备取用蒸馏水清洗过的新鲜动物肌肉组织约10g ，置于研钵（或匀浆器）中，研磨成糜状，然后每克肌肉组织加 4 倍体积的冰冷的pH7.4 1/15mol/L 磷酸盐缓冲液，混匀，用双层纱布过滤，取滤液备用。
2 ．酶促反应取试管 5 支，编号，按下表操作。
琥珀酸脱氢酶活性的测定
COOH
CH2
+ MB
CH2
COOH 琥珀酸
COOH HC CH + MB·2H HOOC 反丁烯二酸
在无氧环境下 ，琥珀酸脱氢酶的活性与甲烯兰脱 色的速度成正比，使定量甲烯兰脱色所需时间的倒数， 可以用来表示酶的活性。本实验用液态石蜡制造无氧环 境，这样可以不用真空设备或氮气。
二、实验用品
1、材料 新鲜肌肉糜
四、实验结果
37℃水浴中保温随时观察并记录甲烯兰脱色过程和时 间，酶活力=1/时间
五、思考题
1.琥珀酸脱氢酶活性的测定的原理是什么? 2.实验过程中要注意哪些问题? 3.酶活性测定的方法有哪些?
实验十五 琥珀酸脱氢酶活性的测定
Exp.15 Activity Determinatase
一、实验原理
以脱氢方式使物质氧化的酶，称脱氢酶。琥珀酸脱 氢酶(succinate dehydrogenase)是三羧酸循环中的一个 酶，能促使琥珀酸脱氢成为反丁烯二酸，并将脱下的氢 传递给受氢体。用甲烯兰作受氢体，结果甲烯兰被氢还 原生成无色的甲烯白。
2、试剂 （1）0.01%甲烯兰溶液； （2）0.02M琥珀酸溶液 （3）液态石蜡；
3、仪器设备 试管及试管架、恒温水浴锅、1毫升及2毫升的吸量
管、烧杯。
三、方法和步骤
取2支试管，各加0.02M琥珀酸溶液0.5毫升，0.01% 甲烯兰溶液1毫升和液态石蜡溶液2毫升。再分别加入 0.5克肌肉糜和煮过的肌肉糜分别混匀后，将试管放入 37℃水浴中保温，随时观察并记录甲烯兰脱色过程和时 间，酶活力=1/时间。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸脱氢酶的种类
通用名：琥珀酸脱氢酶 英文：Succinatedehydrogenase 催化反应：琥珀酸+泛醌=富马酸+泛醇(具 备双向催化的功能) 系统名称：琥珀酸:泛醌氧化还原酶 注释：是含铁-硫中心的黄素蛋白。存在于 线粒体中。
琥珀酸脱氢酶的作用
琥珀酸脱氢酶是连接氧化磷酸化与电子传 递的枢纽之一，可为真核细胞线粒体和多 种原核细胞需氧和产能的呼吸链提供电子， 其活性一般可作为评价三羧酸循环运行程 度的指标。 该酶以FAD作为其脱下电子的 受 体 ， 而 不 是 NAD+ 。 琥 珀 酸 脱 氢 酶 与 FAD 的关系是以共价键相互连接，因此它 是酶和辅基的关系 。很特别，因为一般 FAD与酶以非共价键形式结合。
但是为什么把这种化学物质叫做琥珀酸脱氢酶呢？ 琥珀酸（IUPAC中文名称为丁二酸；传统认为它是琥珀的精髓）是 一种二羧酸，化学式为 HOOC– CH2 –CH2 –COOH。在常温的情况 下，纯琥珀酸是固体，呈无色无味的晶体。有二种晶形，相对密度 1.572(25/4℃)。它的熔点及沸点分别是185°C及235°C。溶解特 性：1g溶于13 ml冷水、1 ml沸水、18.5 ml乙醇、6.3 ml甲醇、36 ml丙酮、20 ml甘油和11 ml乙醚，几乎不溶于苯、二硫化碳、四氯 化碳和石油醚。它形成的阴离子称为琥珀酸根离子，是三羧酸循环 其中的一分子，且是能够在以下化学反应中放出电子予电子传递链： 琥珀酸盐 + 黄素腺嘌呤二核苷酸→延胡索索酸盐 + FADH2这个过程 由琥珀酸脱氢酶（或是由粒线体电子传递链中的复合物II）所催化。 该复合物是4亚单位膜结合脂蛋白，配合琥珀酸的氧化作用及泛醌的 还原作用。中介电子载体为黄素腺嘌呤二核苷酸及 3 个 B 亚单位 Fe2S2群集部份。
琥珀酸脱氢酶
肝脏
组织匀浆法
匀浆的方式 –手工匀浆
–机器匀浆：组织捣碎匀浆器
–超声匀浆：超声粉碎机
–反复冻融
实验步骤
1、肝糜液的制备： 取小白鼠一只，颈椎脱臼法处死，立即剖腹将肝脏 全部取出（为何选肝脏？），臵于研钵中，用生理 盐水洗净肝脏中血液。 用剪刀剪碎肝脏，充分研碎至糊状，然后分批加入 少量磷酸缓冲液，边加边磨，总共加入7ml。 （分几 次加入，每次加入后均需充分研磨。） 注意：此步一定要研磨充分（酶位于线粒体内膜 上）。 研至匀浆后倒入离心管中，离心4分钟(3000转/分)。 将上清液转入另一试管中备用。此即为含有琥珀酸 脱氢酶的肝糜液。
问题3：如何检测琥珀酸脱氢酶的活性状况？
• 在体内,琥珀酸脱下的2H经电子传递链传递，最后 与氧结合生成水，并释放出能量。
• 在体外可利用甲烯兰(蓝色)作为人工受氢体，接受 琥珀酸脱下的2H而被还原为甲烯白(无色)。
•蓝色消褪的快慢可显示琥珀酸脱氢酶的活性。
问题4：何为竞争性抑制？
问题5：本次实验中的抑制剂是什么？为何 选择该物质作为抑制剂？
离心机转子从静止状态加速旋转
– 如果颗粒密度＞周围介质的密度，则颗粒离开轴心方向
移动即发生沉降；
– 如果颗粒密度＜周围介质的密度，则颗粒朝向轴心方向
移动，即发生漂浮。
在离心场中，作用于颗粒上的力主要有离心力Fc、 浮力FB和摩擦阻力Ff。
离心力
转速（revolutions per minute ，rpm）
相对离心力（relative centrifugal force, RCF）：是指在离心力场中，作用于颗粒的离心 力相当于地球引力的倍数， ×g RCF＝1.118×10-5RN2
生化试验课件实验三：琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
实验三 琥珀酸脱氢酶的作用及其竞争性抑制
刘向华
南京医科大学
Nanjing medical university
生化与分子生物学系
Department of biochemistry and molecular biology
浓 度
4、本实验以甲烯蓝为受氢体，在隔离空气条件下，
以甲烯蓝褪色程度来观察、判断丙二酸对琥珀酸脱氢
酶活性的抑制作用。
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸
延胡索酸
FAD
FADH2
三、操作步骤：
1、酶提取液的制备 1 g 兔肌肉、剪碎＋海沙（研磨成糜状）
＋12 ml 1/15M磷酸盐缓冲液 (区别于0.1mol/L) （两次，研成糊状）；纱布过滤
２、酶促反应及竞争抑制作用
试剂（滴） １ ２ ３ ４ ５
酶提取液
20 20 20 20 -
0.2 mol/L琥珀酸 4
4
4
-
4
0.02mol/L琥珀酸 -
-
- 4-
0.2 mol/L丙二酸 -
4
-
4
-
0.02mol/L丙二酸 -
-4
-
-
蒸馏水
4
-
-
- 24
0.02%甲烯蓝
2 2 2 22
3、 各管混匀，加石蜡5滴隔绝空气， 37℃水浴
一、目的与要求：
了解琥珀酸脱氢酶(enzyme) 的作用及酶促反应中的竞争性抑 制作用(competitive inhibition)
二、实验原理：
琥珀酸脱氢酶
琥珀酸脱氢酶简介琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase）是一种重要的酶类物质，广泛存在于各种生物体中，参与细胞的能量代谢过程。
琥珀酸脱氢酶通常结合于线粒体内膜，发挥着电子传递链中的关键作用。
它能够催化琥珀酸（succinate）向富马酸（fumarate）脱氢的反应，同时还能将这个反应与细胞的呼吸过程连接起来，有效地产生细胞所需的能量。
结构琥珀酸脱氢酶是一种复杂的多聚酶，其结构既受到基因编码的蛋白质的影响，也受到线粒体内膜的特殊环境所限制。
根据研究，琥珀酸脱氢酶可分为两个亚基，分别是粒线体亚基和膜亚基。
粒线体亚基主要含有琥珀酸脱氢酶的催化活性位点，并能与催化反应所需的辅酶FAD（葡萄糖黄酶辅酶）结合。
而膜亚基则负责嵌入线粒体内膜，并提供电子传递链所需的电子通道。
这两个亚基通过相互作用紧密连接起来，形成完整的琥珀酸脱氢酶分子。
功能琥珀酸脱氢酶的催化反应是细胞内能量代谢过程的重要环节之一。
其主要作用是将琥珀酸还原为富马酸，同时释放出2个氢原子和2个电子。
这些电子随后会通过电子传递链传递到线粒体内膜上的各种酶类，最终用于产生细胞所需的三磷酸腺苷（ATP）。
通过这个反应，琥珀酸脱氢酶为细胞内的呼吸过程提供了必备的电子供应。
同时，这个反应还能将细胞内的无机物质重新转化为有机物质，从而维持细胞的生命活动。
调控琥珀酸脱氢酶的活性受到多种因素的调控。
例如，细胞内的能量水平对琥珀酸脱氢酶的活性有着直接影响。
当细胞内能量充足时，琥珀酸脱氢酶的活性会受到抑制，从而减小细胞内的能量消耗。
而当细胞内能量不足时，琥珀酸脱氢酶的活性会被激活，以增加细胞内能量产生的速度。
此外，细胞内的其他代谢产物也可通过反馈调控的方式影响琥珀酸脱氢酶的活性。
这种调控机制能够帮助细胞维持内部能量的平衡，以适应不同的代谢需求。
应用琥珀酸脱氢酶的研究对于了解细胞能量代谢、呼吸过程以及许多疾病的发生机制具有重要意义。
在医学领域，琥珀酸脱氢酶的异常活性与某些疾病的发展有关，例如线粒体疾病、神经退行性病变等。
琥珀酸脱氢酶作用的实验
琥珀酸脱氢酶作用的实验1 实验目的探究生物体内琥珀酸脱氢酶的催化反应；探究不同温度对琥珀酸脱氢酶活性的影响。
2 实验原理琥珀酸脱氢酶是生物体内有氧呼吸中三羧酸循环的一个重要的脱氢酶，可催化琥珀酸脱氢，生成延胡索酸，并将脱下的氢交给氢受体（FAD）。
在无氧条件下，可以用甲烯蓝作为氢受体，氧化型的甲烯蓝（蓝色）接受了氢、被还原生成还原型甲烯蓝（无色），又叫甲烯白。
其反应如下：脱氢酶琥珀酸+ MB 延胡索酸+ MB·2H甲烯蓝（蓝色）无氧条件下甲烯白（无色）3 实验器材与试剂剪刀、研钵、试管、恒温水浴锅、冰箱、烧杯、胶头滴管、天平、鸽子。
生理盐水：0.9% NaCl。
0.1 M 琥珀酸溶液：1.8 g琥珀酸加少量蒸馏水溶解后，用0.2 N NaOH调节pH至7.4，再用蒸馏水配成100 ml溶液。
（0.2 N NaOH：4 g NaOH配成250 ml溶液。
）pH7.4磷酸缓冲液：0.2 M NaH2PO4 19 ml与0.2 M Na2HPO4 81ml混合而成。
（0.2 M NaH2PO4溶液：1.56 g NaH2PO4加蒸馏水配成50 ml溶液；0.2 M Na2HPO4溶液：14.32 g Na2HPO4·12H2O 加蒸馏水配成200ml溶液。
）0.01% 甲烯蓝溶液：0.01 g甲烯蓝加蒸馏水配成100 ml溶液。
4 实验操作4.1 处死鸽子（剪断鸽子的颈总动脉），剪开胸脯处皮肤，取胸脯处肌肉约3 g。
剪碎。
加4～5 ml生理盐水，研磨均匀，得到肌肉匀浆。
4.2 按下表操作试管 1 2 3肌肉匀浆（滴）20 20 20缓冲液（滴）20 20 20甲烯蓝（滴）10 10 10琥珀酸（滴）30 30 30摇匀混合液，各试管迅速加少量液体石蜡反应条件40℃100℃0℃3分钟后观察并记录颜色变化振荡试管，观察颜色变化；静置，观察颜色变化。
琥珀酰化 琥珀酸脱氢酶
琥珀酰化琥珀酸脱氢酶
琥珀酰化和琥珀酸脱氢酶是生物化学领域中的两个重要概念，
它们在生物体内的代谢过程中起着关键作用。
首先，我们来谈谈琥珀酰化。
琥珀酰化是一种生物合成过程，
指的是将琥珀酸（succinate）转化为琥珀酰辅酶A（succinyl-CoA）的化学反应。
这一过程在三羧酸循环（也称为Krebs循环或柠檬酸
循环）中起着重要作用，是细胞内能量代谢的关键步骤之一。
琥珀
酰化反应由琥珀酸脱氢酶催化，同时生成NADH和二氧化碳。
琥珀酰
辅酶A进一步参与三羧酸循环，产生更多的能量和代谢产物。
接下来，我们来谈谈琥珀酸脱氢酶。
琥珀酸脱氢酶是一种重要
的酶类蛋白质，它在细胞内负责催化琥珀酸向琥珀酰辅酶A的转化
过程中起着关键作用。
这一过程是细胞内氧化磷酸化过程中的重要
环节，也是三羧酸循环的一部分。
琥珀酸脱氢酶通过催化琥珀酸的
氧化反应，将其转化为琥珀酰辅酶A，同时生成NADH和二氧化碳。
这一过程不仅产生了细胞内能量，还为细胞代谢提供了重要的代谢
产物。
总的来说，琥珀酰化和琥珀酸脱氢酶在细胞内能量代谢和三羧
酸循环中起着至关重要的作用。
它们的正常功能对于维持细胞内能量平衡和代谢稳定具有重要意义。
同时，对这两个过程的深入研究也有助于我们更好地理解细胞代谢调控的机制，为相关疾病的治疗和药物研发提供理论基础。
琥珀酸生成琥珀酸脱氢酶
琥珀酸生成琥珀酸脱氢酶
琥珀酸是一种有机化合物，也被称为琥珀酸二羧酸。
它在生物
体内起着重要的代谢作用。
琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase）是一种酶，也被称为琥珀酸氧化酶。
它在三羧酸循
环和呼吸链中发挥着关键作用。
首先，让我们从化学角度来看琥珀酸生成琥珀酸脱氢酶的过程。
琥珀酸生成琥珀酸脱氢酶是一个生物化学反应，其中琥珀酸被氧化
成为富含能量的化合物。
这一过程中，琥珀酸脱氢酶促进了氧化还
原反应，将琥珀酸转化为富含能量的化合物丙酮酸。
这一反应释放
出电子，这些电子随后参与细胞内的呼吸链反应，产生三磷酸腺苷（ATP），从而为细胞提供能量。
其次，从生物学角度来看，琥珀酸脱氢酶是线粒体内的呼吸链
复合物之一。
它嵌入在线粒体内膜上，并与细胞呼吸链中的其他蛋
白质一起协同工作，将氧化的电子转移到细胞色素氧化酶复合物，
最终将氧还原为水，释放出能量。
这一过程是维持细胞内能量平衡
的重要环节。
此外，从生理学角度来看，琥珀酸脱氢酶在维持细胞正常功能
和代谢平衡中起着至关重要的作用。
它不仅参与三羧酸循环中的代谢途径，还与细胞凋亡、肿瘤发生等生理过程密切相关。
总的来说，琥珀酸生成琥珀酸脱氢酶涉及到生物化学、生物学和生理学等多个方面，其在细胞内能量代谢和生理功能中具有重要作用。
希望这些信息能够全面回答你的问题。
琥珀酸脱氢酶代谢
琥珀酸脱氢酶代谢
琥珀酸脱氢酶（Succinate dehydrogenase，缩写 SDH）是一种关键的线粒体酶，存在于细胞的线粒体内膜上，它是三羧酸循环（柠檬酸循环）中的一个组成部分。
SDH 负责催化琥珀酸氧化成延胡索酸的反应，同时产生 FADH2，后者是电子传递链的一部分。
在代谢中，琥珀酸脱氢酶的作用非常重要，以下是它在细胞代谢中的一些关键功能：
1. 三羧酸循环：
- SDH 是柠檬酸循环中的第六步酶，它将琥珀酸转化为延胡索酸，同时产生 FADH2。
- 在这一过程中，琥珀酸被氧化，释放出的电子被FAD 捕捉，之后 FADH2 将电子传递给电子传递链的复合体II。
2. 电子传递链：
- FADH2 产生的电子进入电子传递链，在那里它们被进一步传递到辅酶 Q，然后到复合体III，最终传递到细胞色素 c，导致质子从线粒体基质泵入膜间隙。
- 这一过程建立了跨线粒体内膜的质子梯度，为
ATP 合成提供了能量。
3. ATP 合成：
- 通过电子传递链积累的质子梯度，驱动 ATP 合酶合成 ATP，这是细胞能量的主要储存形式。
4. 调节细胞代谢：
- SDH 不仅参与柠檬酸循环，而且还可以作为细胞内代谢状态的感应器，参与调节细胞的能量代谢和生长。
琥珀酸脱氢酶的异常或功能障碍可能与某些疾病有关，例如线粒体疾病，这些疾病影响细胞产生能量的能力。
此外，SDH 也在肿瘤代谢中扮演一定的角色，它的活性可能与肿瘤的生长和治疗响应有关。
琥珀酸脱氢酶
2021/6/4
14
琥珀酸脱氢酶的作用
作为关键酶，琥珀酸脱氢酶是标志酶 （markerenzyme）之一，其活性可作为 评价三羧酸循环运行程度的指标，对于评 价精子线粒体功能、研究致奶牛酮缺乏症 病理过程等具有重要意义.
2021/6/4
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琥珀酸脱氢酶的提取
1950年我国著名生物化学家王应睐、邹承 鲁、汪静英等开展对膜蛋白琥珀酸脱氢酶 的研究，经过反复实验最后以正丁醇抽提 法成功地把琥珀酸脱氢酶从鼠肝组织线粒 体膜上溶解下来，得到了高纯度的水溶性 琥珀酸脱氢酶，其活力比同期国外报道者 高出1倍以上，从而奠定了我国在琥珀酸 脱氢酶研究领域的领先地位。
2021/6/4
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琥珀酸脱氢酶的提取
其 后 ， Davis 等 （ 1971 、 1977 ） 使 用 NaClO4 从 牛 心 线 粒 体 溶 解 下 此 酶 ； TsukahoHattori 和 TadashiAsahi （ 1982 ） 选用离子型去垢剂脱氧胆酸钠从番薯根线 粒体提取SDH；Suraveratum等（2000） 对恶性疟原虫的琥珀酸脱氢酶进行了纯化； 夏玉凤等（2000）以玉米黄化苗为生物材 料，通过差速离心获得线粒体，
2021/6/4
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琥珀酸脱氢酶的种类
通用名：琥珀酸脱氢酶 英文：Succinatedehydrogenase 催化反应：琥珀酸+泛醌=富马酸+泛醇(具 备双向催化的功能) 系统名称：琥珀酸:泛醌氧化还原酶 注释：是含铁-硫中心的黄素蛋白。存在于 线粒体中。
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琥珀酸脱氢酶的作用
还没讲。血槽已满，放大招。
2021/6/4
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课外知识
但是为什么把这种化学物质叫做琥珀酸脱氢酶呢？
实验3 琥珀酸脱氢酶的作用及其
HOOC—CH2—CH2—COOH FAD
丙二酸 HOOC—CH2—COOH
琥珀酸脱氢酶
甲烯白MBH2 （无色）
HOOC—CH=CH—COOH FADH2
甲烯蓝MB （蓝色）
甲烯蓝，又名亚甲蓝，美蓝
将各管置37℃恒温水浴锅中保温，
（4） 30min内观察各管颜色的变化。
比较颜色变化的速度，并试分析其原因。然后将第1支试管 用力振摇，观察有何变化，观察并解释之。 注：煮沸至心脏制备液自身沸腾5 min即可。
注意事项
1
剪下的心脏组织须 在天平上称量，研 磨应充分至糊状， 使琥珀酸脱氢酶尽 量释放到溶液中。
companylogowwwthemegallerycomcompanylogowwwthemegallerycomcompanylogowwwthemegallerycomcompanylogowwwthemegallerycomcompanylogowwwthemegallerycomhottipch2coohhccoohch2coohmbhoocchmb2h琥珀酸甲烯蓝延胡索酸甲烯白无色琥珀酸脱氢酶无氧情况companylogowwwthemegallerycom实验原理根据这种蓝色转变为无色彩变化过程就可以判断出琥珀酸脱氢酶起了催化作用
再加入1/15mol/L Na2HPO4溶液12ml （ 4g 总共加），充分混匀。
于2000rpm离心10min，取上清备用。（一
4
定要将钢套和离心管套在一起配平，全班一
起离心！）
实验步骤
取4支试管，按下表操作 。
（2）
加好试剂后混匀，然后立即在各试管中
（3） 加入一层（1 - 1.5cm高）液体石蜡油。
Diagram
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PPT课件
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四.操作步骤
1. 酶提取液的制备： 取大白鼠的肝脏、心脏、肾脏，称重?，用冷水洗3次，剪 小块。加入10X(重量)1/15mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）， 在匀浆器中进行匀浆（最大速度1-2分钟），然后用4层纱 布过滤，滤纸过滤(4000RPM10MIN)，用干净的烧杯收集过 滤液，备用。
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注意：试管6中的酶提取液先在100℃的水浴加热煮沸5min，再 加入其它溶液。各管中将溶液加入后立即混均匀。然后沿试管壁加 入液体石蜡，约0.5cm(1ml)厚。各管置于37℃的水浴中保温，切 勿摇动试管，随时观察比较各试管颜色的变化，记录褪色时间。
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七．临床意义
竞争性抑制是可逆抑制过程,不破坏酶结构,不改变酶浓度。 磺胺药与二氢叶酸结构类似，可竞争性抑制二氢叶酸合成 酶活性，进而减少菌体内四氢叶酸的合成，达到抑制细菌 生长的作用。
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八．思考题
1. 随着竞争物浓度与底物浓度的比值（ [I]/[S] ）增加， 褪色时间如何变化，为什么？ 2. 试阐述竞争性抑制作用的特点，并举例说明其临床意 义。
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五．实验结果记录
[I]/[S] 0 0.1 1 10 0 0 褪色时间（分钟）
试管1 试管2 试管3 试管4 试管5 试管6
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六．注意事项
1、酶提取液的制备应操作迅速，以防止酶活性降低。 2、加入液体石蜡的作用是隔绝空气，以避免空气中的氧 气对实验造成影响，因此加石蜡时试管壁要倾斜，注意不 要产生气泡。 3、37℃水浴保温过程中，不能摇动试管，避免空气中的 氧气接触反应溶液，使得还原型的甲烯白重新氧化成蓝 色。 4、37℃水浴保温过程中，要注意随时观察各试管的褪色 情况。 5、实验结果结束后，一定要洗干净试管内的液体石蜡。
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二、实验原理
丙二酸的化学结构与琥珀酸相似，它能与琥珀 酸竞争，而和琥珀酸脱氢酶结合。若琥珀酸脱氢酶 已与丙二酸结合，则不能再催化琥珀酸脱氢，这种 现象称为竞争性抑制。如相对地增加琥珀酸的浓度， 则可减轻丙二酸的抑制作用。
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三．器材与试剂
1. 器材 大白鼠、手术剪、镊子、磁盘、匀浆器、量筒、烧杯、纱 布、滤纸、试管及试管架、恒温水箱、电热水浴锅 2. 试剂 0.2mol/L 琥珀酸溶液、 0.02mol/L 琥珀酸溶液、 0.2mol/L 丙二酸溶液、0.02mol/L丙二酸溶液、1/15mol/L磷酸缓冲 液（pH 7.4）、0.02％甲烯蓝、液体石蜡
丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用
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一、实验目的要求
学习和掌握竞争性抑制作用的特点。 观察丙二酸对琥珀酸脱氢酶的竞争性抑制作用。
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二、实验原理
化学结构与酶作用的底物结构相似的物质，可与 底物竞争结合酶的活性中心，使酶的活性降低甚 至丧失，这种抑制作用称为竞争性抑制作用。 琥珀酸脱氢酶是位于动物细胞线粒体内膜上的一 种氧化酶，它直接与电子传递链相连，是机体内 参与三羧酸循环的一种重要的脱氢酶，也是呼吸 链的标志酶。在体内，琥珀酸脱氢酶可以使琥珀 酸脱氢生成延胡索酸。脱下的氢进入FADH2呼吸链， 通过一系列传递体，最后传递给氧而生成水。当 在缺氧的情况下，脱下之氢可将蓝色的甲烯蓝还 原成无色的甲烯白。这样，便可以显示琥珀酸脱 氢酶的作用。
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四.操作步骤
2.取试管6支，编号，再按下表步骤操作：
0.2mol/L 0.02mol/ 0.2mol/L 0.02mol/L 蒸馏水 甲烯蓝 琥珀酸溶 L琥珀酸 丙二酸溶 丙二酸溶液 （滴） （滴） 液（滴） 溶液（滴） 液（滴） （滴） 8 8 4 8 8 3
酶提 磷酸缓 取液 冲液 (ml) (ml) 试管1 2 试管2 2 -