无菌检查法及其验证培训课件
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无菌检查法试验具体操作方法PPT课件
四、具体检测方法
❖ 薄膜过滤法:
❖ 采用全封闭式薄膜过滤器，薄膜孔径不大于0.45um， 膜直径约47mm.
❖ 取规定抽验供试品数，（如供试品少于10ml，则先加 入100ml0.9%,无菌氯化钠溶液或适宜的无菌溶剂）， 立即在无菌条件下导入无菌薄膜过滤器内，加压或减 压过滤。
❖ 含汞类等防腐剂的供试品，在供试品过滤后，用0.9% 无菌氯化钠溶液或其他适宜的无菌溶剂冲洗滤膜3次， 每次100ml，过滤后，两个滤器中加硫乙醇盐流体培 养基各100ml，另一个滤器加改良马丁培养基100ml。
支
移种前剩余培养基及移种后的培养基 分别培养21天，（36℃±1）。每隔3天观察一次
四、具体检测方法
❖ 一旦支原体污染：
㈠一律废弃重新培养。 ㈡对于具有重要价值的细胞株，
有必要清除支原体的，常用方法有： ①抗生素处理 ②抗血清处理： ③抗生素加抗血清和补体联合处理
四、具体检测方法
❖ 支原体最突出的结构特征是没有细胞壁， ①对作用于细胞壁生物合成的抗生素：如 -内酰胺类、
三、无菌操作要求及注意事项
4.吸取过营养液后的吸管不能再用火焰烧灼，因残留 在吸管头中营养液能烧焦形成炭膜，再用时会把有 害物带入培养基中。 开启、关闭供试品时，火焰灭菌时间要短，防止因 温度过高灭活供试品。 另外胶塞过火焰时也不能时间长，以免烧焦产生有 毒气体，危害供试品。
5.进行试验时，吸管抽取供试品后，要与培养基试管 平行且垂直，动作要准确敏捷，但又不必太快，以 防空气流动，增加污染机会。
二、试验物品准备：
❖ 2、灭菌物品的确认： 高压根据试验要求，准备所需器材和物品。需在灭菌 物品盒标注名称，并填写灭菌日期，清点无误后将 其送至灭菌前间。 灭菌是无菌物品生产的重要环节，根据物品的性能选 择合适的灭菌方式，是确保试验质量的关键。 我们通常把玻璃器皿包括吸管瓶子选择180℃2小时干 热灭菌，胶栓121℃60分钟灭菌，取回灭菌物品时， 一定要在有效期内使用，试验前确认指示剂是否合 格及包装的完整性，干燥性，合格后方可使用。
无菌检查法培训-PPT课件
无 菌 检 查 法
无 菌 检 查 法
Βιβλιοθήκη 菌悬液在室温下放置应在 2小时内使用，若保 存在2～8℃可在 24小时内使用。黑曲霉孢子 悬液可保存在 2～8℃，在验证过的贮存期内 使用。 培养基接种 取每管装量为 12ml的硫乙醇酸 盐流体培养基 9支，分别接种小于100 cfu的金 黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆 菌、生孢梭菌各 2支，另 1支不接种作为空白 对照，培养3天；取每管装量为9ml的改良马 丁培养基5支,分别接种小于 100 cfu的白色念 珠菌、黑曲霉各 2支，另 1支不接种作为空白 对照，培养5天。逐日观察结果。 结果判定 空白对照管应无菌生长，若加菌的 培养基管均生长良好，判该培养基的灵敏度 检查符合规定。
薄膜过滤法，应增加 1/2的最小检验数量作阳性对 照用；若采用直接接种法，应增加供试品 1支（或 瓶）作阳性对照用。）
表 1 批出厂产品最少检验数量
无 菌 检 查 法
表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽 验样品的最少检验数量
无 菌 检 查 法
表3. 固体制剂最少检验量及上市抽 检样品的最少检验数
金黄色葡萄球菌( Staphylococcus aureus)〔CMCC(B) 26 003〕 铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) 〔CMCC(B) 10 104〕 枯草芽孢杆菌（ Bacillus subtilis）〔CMCC（B）63 501〕 生孢梭菌( Clostridium sporogenes)〔CMCC(B) 64 941〕 白色念珠菌( Candida albicans)〔CMCC(F) 98 001〕 黑曲霉( Aspergillus niger) 〔CMCC(F) 98 003〕
《无菌检验方法验证》课件
无菌检验方法验证的目的
在本节中，我们将阐明无菌检验方法验证的目的和重要性，以及验证结果对 无菌产品质量的影响。
方法证的无菌检验方法。
2
步骤二
制定验证计划和实施方案，包括验证样品的选择和实验室条件的准备。
3
步骤三
进行实际的验证实验，收集和记录数据。
《无菌检验方法验证》 PPT课件
欢迎大家参加今天的课程！在这个课件中，我们将深入探讨无菌检验方法验 证的重要性和步骤，帮助您更好地理解这一关键概念。
概述
本节将介绍无菌检验方法验证的基本概念和背景，以及其在医疗和制药领域 中的重要性。
无菌检验的定义和意义
这一部分将详细说明无菌检验的定义和意义，以及无菌状态在医疗设备和药品生产中的关键作用。
4
步骤四
数据分析和结果解释，评估无菌检验方法的准确性和有效性。
验证设计和执行
验证设计
根据验证目标和要求，选择合适 的无菌检验设备和方法。
验证执行
由经过培训和资质认证的人员执 行验证实验，确保实验过程的准 确性和可靠性。
验证报告
记录并总结验证过程的结果和结 论，生成详细的验证报告。
结果分析和解释
在本节中，我们将分析和解释验证结果，评估无菌检验方法的优缺点以及改 进措施。
结论和建议
最后，我们将通过对整个无菌检验方法验证过程的总结，给出结论和建议， 以帮助您更好地应用于实际工作中。
无菌检查法培训PPT课件
无 菌 检 查 法
表 1 批出厂产品最少检验数量
无 菌 检 查 法
1
无 菌 检 查 法
2
表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量
1
无 菌 检 查 法
2
表3. 固体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验数
无 菌 检 查 法
五、实验材料的准备
培养基及稀释液 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
无 菌 检 查 法
无 菌 检 查 法
实验设备 过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子） 电子天平 压力蒸汽灭菌器 电热鼓风干燥箱 恒温培养箱 集菌仪
无 菌 检 查 法
5、供试品的准备
操作前，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。
无 菌 检 查 法
以上材料可以采用干热灭菌（只限于剪刀、镊子，灭菌时将剪刀和镊子装入专用灭菌器具内）或湿热灭菌。干热灭菌为160℃ 2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用。
无 菌 检 查 法
培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。
无 菌 检 查 法
202X
无Байду номын сангаас检查法培训
01.
无
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03.
检
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表 1 批出厂产品最少检验数量
无 菌 检 查 法
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表 2. 液体制剂最少检验量及上市抽验样品的最少检验数量
1
无 菌 检 查 法
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表3. 固体制剂最少检验量及上市抽检样品的最少检验数
无 菌 检 查 法
五、实验材料的准备
培养基及稀释液 硫乙醇酸盐流体培养基 改良马丁培养基 pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液
无 菌 检 查 法
无 菌 检 查 法
实验设备 过滤装置（无油真空泵、滤杯、滤头、滤瓶、微孔滤膜、夹子） 电子天平 压力蒸汽灭菌器 电热鼓风干燥箱 恒温培养箱 集菌仪
无 菌 检 查 法
5、供试品的准备
操作前，用适宜的消毒液对供试品容器表面进行彻底消毒，如果供试品容器内有一定的真空度，可用适宜的无菌器材（如带有除菌过滤器的针头）向容器内导入无菌空气，再按无菌操作起开容器取出内容物。
无 菌 检 查 法
以上材料可以采用干热灭菌（只限于剪刀、镊子，灭菌时将剪刀和镊子装入专用灭菌器具内）或湿热灭菌。干热灭菌为160℃ 2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用。
无 菌 检 查 法
培养基的适用性检查 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查及灵敏度检查的要求。本检查可在供试品的无菌检查前或与供试品的无菌检查同时进行。 无菌性检查：每批培养基随机取不少于 5 支（瓶），培养 14 天，应无菌生长。
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药品无菌检查方法的验证试验讲义(ppt 27页)
大豆－胰酪胨培养基
培养基灵敏度检查
与方法验证用菌株 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌；生孢梭菌；白色念珠菌、
黑曲霉
检验方法
只要供试品性状允许，
性状允许的样品均可采用薄膜过滤，
应采用薄膜过滤法
利于抗菌影响去除
稀释剂与
薄膜过滤冲洗液 0.1％蛋白胨水溶液； A、D、K
0.1％蛋白胨水溶液（ 0.1％
• 根据上述验证试验结果可知，氯化 钠注射液的无菌检查，不需冲洗，以金 黄色葡萄球菌为阳性对照菌。本方法适 合于氯化钠注射液的无菌检查，即氯化 钠注射液的无菌检查法通过验证。
六、注意事项
1. 预试验 2. 稀释液与冲洗液: 作用、种类、冲洗量 3. 菌液: 保存、加入方式、加入量 4. 具有抗菌活性的供试品 5.滤膜： 选择、种类 6.对照菌: 根据供试品的特性来选择(抗生素根
的。单倍量重试)
二．方法验证试验建立及要求
验证实际是伴随着整个试验过程， 试验过程中的每一个环节都应该有合理 的证明，以确保在实际检验条件下，该 供试品的无菌检查法的可靠性。
主要内容 怎么做: 一选方法二看性质三除
抑菌性四计菌数五定取样量
• 注意什么: 七注意
怎么做
一 选定试验方法: 可靠、稳定、简便
2005年版无菌检查法主要方面与USP、BP的比较
比较项目
ChP2005
USP29
BP2002
检验条件规定
总体10000级、局部100级
无具体规定
无具体规定
人员要求
无具体规定
正确培训和认可
细菌检查培养基 硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培养基
硫乙醇酸盐流体培
养基
无菌检查法-PPT课件
—— 明确了验证试验所需样品量是供试品的 检验量而不是供试品的检验数量。
供试品的无菌检查部分
1、阳性对照用量：
原：“若采用直接接种法，应增加供试品1支 （或瓶）作阳性对照用。”
修订为 ：若采用直接接种法，应增加供试品无菌 检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照 用。
——因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法，若是 固体制剂每管接种量可能不止1支（或瓶），应 按验证的方法确定。
备注中对供试品容器装量不够接种两种培养 基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。
感谢您的关注
供试品的无菌检查部分
培养及观察
对于培养14天后，不能从外观上判断有无 微生物生长时，删除了：“或划线接种于 斜面培养基上” 的规定。
同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判 断的规定。
结果判断部分
新增订阳性对照管和阴性对照管的实 验结果对于整体实验结果判断的作用： “ 阳性对照管应生长良好，阴性对照 管不得有菌生长。否则，试验无效。”
无菌检查法-PPT课件
方法验证试验部分
1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基 灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿假 单胞菌，增订了大肠埃希菌。
2、验证试验中样品用量
修订为： 薄膜过滤法验证试验样品量：
“ 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜 过滤法过滤。”
直接接种法验证试验样品量： “…其中1管接入每支培养基规定量的供试品量， “
供试品的的无菌检查部分
薄膜过滤法：
1、新增规定：抗生素供试品应选择低吸 附的滤器及滤膜
2、新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不 得过1000ml
3、新增规定：所用冲洗量、冲洗方法同 验证试验
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
供试品的无菌检查部分
1、阳性对照用量：
原：“若采用直接接种法，应增加供试品1支 （或瓶）作阳性对照用。”
修订为 ：若采用直接接种法，应增加供试品无菌 检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照 用。
——因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法，若是 固体制剂每管接种量可能不止1支（或瓶），应 按验证的方法确定。
备注中对供试品容器装量不够接种两种培养 基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。
感谢您的关注
供试品的无菌检查部分
培养及观察
对于培养14天后，不能从外观上判断有无 微生物生长时，删除了：“或划线接种于 斜面培养基上” 的规定。
同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判 断的规定。
结果判断部分
新增订阳性对照管和阴性对照管的实 验结果对于整体实验结果判断的作用： “ 阳性对照管应生长良好，阴性对照 管不得有菌生长。否则，试验无效。”
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方法验证试验部分
1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基 灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿假 单胞菌，增订了大肠埃希菌。
2、验证试验中样品用量
修订为： 薄膜过滤法验证试验样品量：
“ 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜 过滤法过滤。”
直接接种法验证试验样品量： “…其中1管接入每支培养基规定量的供试品量， “
供试品的的无菌检查部分
薄膜过滤法：
1、新增规定：抗生素供试品应选择低吸 附的滤器及滤膜
2、新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不 得过1000ml
3、新增规定：所用冲洗量、冲洗方法同 验证试验
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
医疗药品无菌检查法验证培训课件
医疗药品无菌检查法 验证
一、概述：
1.1 定义：系用于检查药典要求的无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方 法。
2.1验证的必要性和意义：① 确认Biblioteka 采用的方法检查供试品无菌的适合性。
② 保证检查结果的准确性、可靠性、准确性和 重现性；检查方法的完整性。
③ 与同药品无菌检查接轨。
① 确定抑菌作用（抑细菌、真菌试验验证），选择 敏感菌株对供试品抑菌活性去除效果检验（阳性 菌回收试验）。
② 消除样品抑菌性的方法验证：
医疗药品无菌检查法验证
11
a) 化学钝化中和法（化学试剂中合法）：利用化学 （生物）专属性灭活，常用钝化剂有：对氨基苯 甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。薄膜过滤法和 直接接种法也可用。对化学中和剂不敏感的样品， 用酶中和，如β -内转氨酶。
医疗药品无菌检查法验证
3
三、无菌检查的试验要求:
3.1 环境：10000级局部以下100级，布局符合无菌 操作要求；或隔离系统（生物安全柜）。
3.2 人员：必须具备微生物专业知识，并经培训。
3.3 设备、器件、材料：经处理必须符合无菌要求， 培养箱的温度指示装置要校验。
3.4 培养基：
3.4.1 按药典规定处方配制，采用经验证合格的灭菌程序 灭菌。
3.5.3 依据供试品的特性选择稀释液、冲洗液。
医疗药品无菌检查法验证
6
四、无菌检查法验证:
4.1 原理:验证的所有环境、培养基、菌株、稀释液、 冲洗液均与日常检查方法相一致、并符合相关规 定。
4.2 验证分类： ① 前验证：建立无菌检查方法时。 ② 再验证：修订检查方法时。 ③ 定期验证：供试品组合或原检查条件改变。
生长良好，培养基灵敏度符合要求。
一、概述：
1.1 定义：系用于检查药典要求的无菌的药品、医疗 器具、原料、辅料及其它品种是否无菌的一种方 法。
2.1验证的必要性和意义：① 确认Biblioteka 采用的方法检查供试品无菌的适合性。
② 保证检查结果的准确性、可靠性、准确性和 重现性；检查方法的完整性。
③ 与同药品无菌检查接轨。
① 确定抑菌作用（抑细菌、真菌试验验证），选择 敏感菌株对供试品抑菌活性去除效果检验（阳性 菌回收试验）。
② 消除样品抑菌性的方法验证：
医疗药品无菌检查法验证
11
a) 化学钝化中和法（化学试剂中合法）：利用化学 （生物）专属性灭活，常用钝化剂有：对氨基苯 甲酸、卵磷脂、聚山梨酯-80等。薄膜过滤法和 直接接种法也可用。对化学中和剂不敏感的样品， 用酶中和，如β -内转氨酶。
医疗药品无菌检查法验证
3
三、无菌检查的试验要求:
3.1 环境：10000级局部以下100级，布局符合无菌 操作要求；或隔离系统（生物安全柜）。
3.2 人员：必须具备微生物专业知识，并经培训。
3.3 设备、器件、材料：经处理必须符合无菌要求， 培养箱的温度指示装置要校验。
3.4 培养基：
3.4.1 按药典规定处方配制，采用经验证合格的灭菌程序 灭菌。
3.5.3 依据供试品的特性选择稀释液、冲洗液。
医疗药品无菌检查法验证
6
四、无菌检查法验证:
4.1 原理:验证的所有环境、培养基、菌株、稀释液、 冲洗液均与日常检查方法相一致、并符合相关规 定。
4.2 验证分类： ① 前验证：建立无菌检查方法时。 ② 再验证：修订检查方法时。 ③ 定期验证：供试品组合或原检查条件改变。
生长良好，培养基灵敏度符合要求。
4无菌检验方法验证 PPT课件
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无菌检验方法验证
无菌检验方法 验证的意义
1.符合国家药典标准，与先进国家的药典和药品 技术审评接轨 2.是分析测量科学的基本要求，是各种法规遵循 工作的基础。 3.通过验证试验，可对每种药品的具体检验方法 的可靠性和结果的准确性予以确认，从而形成标 准化的操作。 4.通过对同品种，但不同批号或不同生产厂家的 产品的微生物学验证试验比较，可以发现产品所用 原料质量或工艺流程中是否存在污染抑菌物质的 YOUR SITE HERE 问题，具有药品质量控制的意义。
2、样品的前处理方法 为达到制备成均匀的供试液及为后续采取消除抑菌活 性的方法作准备，将所采取的前处理方法应用和参加 到验证试验中，以证明所用处理方法对各试验菌的生 长无影响。 按供试品的性状选用以下适宜的方法，或几种方法联 合使用：
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无菌检验方法验证
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方法二：用实验确定是否具有抑菌性的方法 在规定量的供试液中加入实验用微生物10~100个， 如微生物生长良好，即说明供试品对该种微生物无抑 菌活性。如已用药典规定的各试验菌试验，结果均能 生长良好，说明供试品无抑菌性，可用常规方法检验 之。将这些试验记录在案——就是证明该供试品无抑 菌性的验证试验部分；如加入的微生物不生长或生长 缓慢，说明供试品有抑菌性，将这些试验记录在案— —就是证明该供试品有抑菌性的验证试验部分；如加 入的微生物中有某一种菌最不能生长或生长最缓慢， 这一种菌就是该样品的敏感菌。
4.four
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无菌检验方法验证
验证的重点环节
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无菌检验法验证
验证报告的重点
无菌检查法课件
微生物的检测方法
01
02
03
04
培养法
通过培养基培养微生物，观察 其生长情况，进行检测。
显微镜检查
通过显微镜观察微生物的形态 、大小、染色等情况，进行检
测。
生物发光检测法
利用生物发光原理，检测微生 物的存在。
免疫学方法
利用抗原抗体反应，检测微生 物的存在。
03
无菌检查法的操作流程
样品采集
采样前准备
霉菌
常见的无菌检查对象，包 括酵母菌、霉菌等。
病毒
体积较小的微生物，需要 特殊的方法进行检测。
微生物的生长条件
营养物质
微生物生长需要各种营养 物质，如碳源、氮源、水 、无机盐等。
温度
不同微生物需要在不同的 温度下生长，一般温度范 围在20℃-45℃之间。
pH值
微生物生长的酸碱度条件 ，不同微生物适应的pH值 范围不同。
操作规范
严格遵守无菌操作规程，避免交叉污染。
样本处理
对样本进行适当的处理，以去除杂菌并保留所需检测的微生物。
培养条件
确保培养基处于适宜的温度和湿度条件下，以促进微生物的生长。
观察记录
对实验过程进行详细记录，包括操作步骤、观察结果等。
实验后的处理
器具清洗
实验结束后，对使用过的器具进行彻底清洗 和消毒。
防止污染
在接种和培养过程中，应采取措施防 止培养基和培养物受到污染。
结果观察与判定
观察微生物生长情况
定期观察培养物的生长情况，记录生 长特征和菌落形态等信息。
菌落计数
结果判定
根据检验目的和标准要求，对观察到 的微生物生长情况进行判定，如是否 符合无菌要求或特定微生物的存在与 否。
《无菌检查培训》课件
2
无菌材料准备
解释如何准备无菌材料，包括消毒和标识。
3
取样方法
指导如何正确进行取样，以获取具有代表性的样品。
4
样品处理
说明处理样品的步骤，以确保无菌性的保持。
5
检测结果判断
介绍无菌检查结果的判断标准，如合格和不合格。
5. 无菌检查的注意事项
1 安全注意事项
2 操作注意事项
3 结果判断注意事项
强调进行无菌检查时需要遵 守的安全措施，如穿戴合适 的防护装备。
7. 参考文献
相关文献推荐
列举一些与无菌检查相关的重 要文献，供学习者进一步深入 研究。
无菌检查相关标准
介绍一些关于无菌检查的相关 标准，如ISO标准。
培训资源推荐
推荐一些有关无菌检查培训的 资源，如培训课程和在线资料。
提供执行无菌检查时的操作 建议，如正确使用无菌操作 技术。
解释无菌检查结果判断时需 要注意的事项，如避免主观 判断和错误解读。
6. 总结
无菌检查的重要性
总结无菌检查对保证产品和样品无菌性的重要作用。
无菌检查的必要性
强调无菌检查在医疗和实验室环境中的必要性，保护人员和患者的安全。
无菌检查的实践意义
讨论无菌检查对提高产品质量和保持实验结果准确性的实践意义。
无菌检查的分类
说明常见的无菌检查分类，如 物理检查、化学检查和微生物 检查。
2. 准备工作
1 检查前的准备
2 无菌材料的准备
3 无菌环境的准备
描述进行无菌检查之前需要 做的准备工作，如清洁工作 区和消毒工具。
解释无菌材料的选择和准备 过程，确保使用符合无菌要 求的物品。
介绍无菌环境的建立和维持， 包括空气过滤和无菌工作台 操作。
无菌微生物限度检查及方法验证.ppt
• 非必要品禁止带入实验室，必要资料和记录应消毒后进入并应远离操作 台。
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
• 实验人员进入洁净室（无菌室）不得化妆、戴手表、戒指等首饰；不得 吃东西。应严格按更衣程序更衣。
• 记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微 生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将 报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌 室前，至少开启机房运转1小时以上。
菌种的传代和保藏
菌种的保藏方法
• 使菌种的代谢处于最不活跃或相对静止的状态，从而在一定时间内 不发生变异并保持生命活力。
• 一般来说，低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的三个 重要因素
• 无论使用那种菌种保藏方法，都应进行验证，以确保在相应保存条 件下的菌种不会变异并且性能稳定。
• 菌种的传代次数（自原始菌种冻干粉起）不得超过5代（GMP，药 典）
微生物实验室应制定菌种的保藏管理规程来规范菌种的来源、申购、保 管、转种传代、存储和领用等方面的要求，确保菌种的溯源性和稳定性； 防止试验用菌种因多次传代而失去典型生物学特征发生变异或死亡，保 证菌种长期正确、稳定，从而确保实验的灵敏度和重现性。
微生物实验室的质量管理
•菌种保存应有专人负责，加锁保存于冰箱中。 •实验室的标准菌株应来自CMCC（中国药品生物制品检定所医学菌种保 藏中心或ATCC（美国菌种保藏中心）等国际法定菌种保藏机构。有接 收、确认记录。 •菌种的转种等均应在超净工作台进行，以防污染。 •各种菌种应按规定时间接种，所有保藏的菌种均应贴有相应的标签，有 菌种清单。
• 培养箱、冰箱需在设备的每个腔室内放置经校准过的玻璃温度计，每天 检查设备腔室内的温度状况并且在日志上做好相应的记录。定期回顾每 个设备的温度记录数据，以考察设备的运行状态。
无菌检查法及其验证课件
• 供试液经薄膜过滤后，若需要用冲洗液冲洗滤膜，每 张滤膜每次冲洗量为100ml，且冲洗量不超过 1000ml，以避免滤膜上的微生物受损伤。
• 过滤器应优先选择封闭式薄膜过滤），也可使用一般
薄膜过滤器。滤膜孔径不大于0.45μm，直径约为
50mm。
无菌检查法及其验证课件
19
供试品的无菌检查法
• 检验数量 指一次检验所用供试品最小包装容器的数 量
• 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的菌种保藏方法 保存，以保证菌种的生物学特性。
• 加菌量:＜100cfu。
无菌检查法及其验证课件
12
培养基的适用性检查
③ 菌液制备
试验菌
培养基
培养温度
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
营养肉汤
生孢梭菌
硫乙醇酸盐流体
白色念珠球菌 改良马丁培养基
黑曲霉
改良马丁琼脂斜面
无菌检查法概念
• 无菌检查是通过目检微生物在培养基中 的生长来判断结果。
• 无菌检验只能给出该批产品受污染的程 度。
• 无菌检验合格只能说明被测样品无菌， 不能证明整批样品无菌。
无菌检查法及其验证课件
1
无菌检查的设施、环境、人员
• 检查环境应在洁净度10000级下的局部 洁净度100级的单项流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守 无菌操作。
• 采用薄膜过滤法应增加1/2的最小检验数量作为阳性对 照；采用直接接种法应增加供试品无菌检查时每个培 养基容器接种的样品量作为阳性对照。
• 检验量 指一次试验所用供试品总量（g或ml），若 每支（瓶）供试品装量按规定足够接种两份培养基， 则应分别接种硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养 基。采用薄膜过滤法时，检验量不应少于直接接种法 的供试品总量，只要供试品的特性允许，应将所有容 器内的全部内容物过滤.
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• 无菌检查人员必须具备微生物专业知识 ，并经过无菌技术的培训。
无菌检查法及其验证
5
无菌隔离系统
• 无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独 立环境系统。
• 使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间,保 护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的 污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现 假阳性结果,保证无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要 求；保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染；放置 隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点 。
• 无菌检验培养基所能支持生长的微生物 是有限的。
• 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的 生长要求，如：营养、温度和氧等。
• 无菌检验培养基不可能支持所有微生物 的生长，选择了支持那些最有可能污染 药品和在药品中生长的微生物的营养的 培养基。
无菌检查法及其验证
17
•谢谢
无菌检查法及其验证
18
供试品的无菌检查法
30-35 23-28
培养时间 18-24
24-48 5-7天
无菌检查法及其验证
14
培养基的适用性检查
④培养基接种
试验菌
培养基 每管装量 接种管数 接种量 培养时间
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
硫乙醇酸盐 12 ml
白色念珠球菌 改良马丁培养基 9 ml 黑曲霉
2 支 1 ml 3天
金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
• 改良马丁培养基 白色念珠菌 黑曲霉
无菌检查法及其验证
12
培养基的适用性检查
②菌种选择的原则
• 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株( 或该药品中常见的污染菌)。
• 金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单 胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药 品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧 菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉 菌）。
• 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只 要供试品性状允许，应优先采用薄膜过滤法。
• 进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和 检验条件应与验证的方法相同。
• 薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别 是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消 除供试品的抑菌性，提高检出率。
无菌检查法及其验证
19
2支
1 ml 5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
无菌检查法及其验证
15
培养基的适用性检查
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌的培 养基管均生长良好，判该培养基的 灵敏度检查符合规定。
• 试验同时应做空白对照
无菌检查法及其验证
16
培养基说明
• 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的菌种保藏方法 保存，以保证菌种的生物学特性。
• 加菌量:＜100cfu。
无菌检查法及其验证
13
培养基的适用性检查
③ 菌液制备
试验菌
培养基
培养温度
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
营养肉汤
生孢梭菌
硫乙醇酸盐流体
白色念珠球菌 改良马丁培养基
黑曲霉
改良马丁琼脂斜面
供试品的无菌检查法--直接接种法
• 样品直接移入无菌培养基中。 • 每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品
体积不得大于培养基体积的10%。 • 同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于
15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml 。培养基的用量和高度同方法验证试验。 • 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。
• 无菌性检查
①重要性：培养基无菌不合格将导致实验 的假阳性结果。
②检查：每批培养基随机抽取不少于5支 或5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置3035℃培养，改良马丁培养基置23-28℃ 培养，培养14天，应无菌生长。
无菌检查法及其验证
11
培养基的适用性检查
• 灵敏度检查 ①菌种 • 硫乙醇酸盐流体培养基
无菌检查法及其验证
8
培养基的制备及装量
• 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产 的符合规定的脱水培养基。
• 硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比 例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色） 不超过培养基深度1/2。供试品接种前，培养 基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否 则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。
无菌检查法及其验证
6
HTY无菌隔离系统
无菌检查法及其验证
7
无菌检查用培养基的种类及用途
• 硫乙醇酸盐流体培养基--培养好氧菌、 厌氧菌
• 改良马丁培养基--培养真菌及好氧细菌
• 选择性培养基--按硫乙醇酸盐流体培养 基或改良马丁培养基的处方及制法，在 培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂 或表面活性剂。
• 隔离系统按相关的要求进行验证，其内 部环境的洁净度须符合无菌检查的要求 。
无菌检查法及其验证
3
无菌检查的设施、环境、人员
• 规定应定期按《医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法 》的现行国家标准进行洁净度的验证。
• 日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查法及其验证
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无菌检查的设施、环境、人员
无菌检查法及其验证
无菌检查法概念
• 无菌检查是通过目检微生物在培养基中 的生长来判断结果。
• 无菌检验只能给出该批产品受污染的程 度。
• 无菌检验合格只能说明被测样品无菌， 不能证明整批样品无菌。
无菌检查法及其验证
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无菌检查的设施、环境、人员
Байду номын сангаас
• 检查环境应在洁净度10000级下的局部 洁净度100级的单项流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守 无菌操作。
无菌检查法及其验证
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供试品的无菌检查法--薄膜过滤法
• 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留 于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗 滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长） ，然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。
无菌检查法及其验证
9
培养基的储存
• 制备好的培养基应该保存在2-25℃、避光 的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在 1年内使用。
※应结合实际情况进行验证，以确定培养基 有效期。
无菌检查法及其验证
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培养基的适用性检查
本检查可在供试品的无菌检查前或与供试 品的无菌检查同时进行。
无菌检查法及其验证
5
无菌隔离系统
• 无菌隔离系统是一个不受外界环境影响的、可进行无菌操作的独 立环境系统。
• 使用隔离系统的优点：它能创造一个持续高效的高度无菌空间,保 护产品免受外源性污染，包括操作人员、操作环境及外包装等的 污染，确保操作环境及实验物品表面能达到无菌要求，防止出现 假阳性结果,保证无菌实验结果的可靠性，从而实现一次检出的要 求；保护操作人员免受实验过程中的有害物质带来的污染；放置 隔离器的环境洁净度不需要特殊要求，移动方便等优点 。
• 无菌检验培养基所能支持生长的微生物 是有限的。
• 微生物种类繁多，这些微生物有广泛的 生长要求，如：营养、温度和氧等。
• 无菌检验培养基不可能支持所有微生物 的生长，选择了支持那些最有可能污染 药品和在药品中生长的微生物的营养的 培养基。
无菌检查法及其验证
17
•谢谢
无菌检查法及其验证
18
供试品的无菌检查法
30-35 23-28
培养时间 18-24
24-48 5-7天
无菌检查法及其验证
14
培养基的适用性检查
④培养基接种
试验菌
培养基 每管装量 接种管数 接种量 培养时间
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌 生孢梭菌
硫乙醇酸盐 12 ml
白色念珠球菌 改良马丁培养基 9 ml 黑曲霉
2 支 1 ml 3天
金黄色葡萄球菌 生孢梭菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
• 改良马丁培养基 白色念珠菌 黑曲霉
无菌检查法及其验证
12
培养基的适用性检查
②菌种选择的原则
• 代表性、普遍性、易存活、低或非致病性、标准菌株( 或该药品中常见的污染菌)。
• 金黄色葡萄球菌（代表革兰氏阳性菌）、铜绿色假单 胞菌（代表革兰氏阴性菌）、枯草芽孢杆菌（代表药 品中最常见或最易污染的菌）、生孢梭菌（代表厌氧 菌）、白色念珠菌（代表酵母菌）、黑曲霉（代表霉 菌）。
• 无菌检查法包括直接接种法和薄膜过滤法。只 要供试品性状允许，应优先采用薄膜过滤法。
• 进行供试品无菌检查时，所采用的检查方法和 检验条件应与验证的方法相同。
• 薄膜过滤法可以提高无菌检验的检出率，特别 是抑菌性供试品，采用薄膜过滤法可以有效消 除供试品的抑菌性，提高检出率。
无菌检查法及其验证
19
2支
1 ml 5天
※其中硫乙醇酸盐及改良马丁培养基均有 1支不接种作为空白 ※接种量 ＜100cfu（不能多）
无菌检查法及其验证
15
培养基的适用性检查
⑤结果判断
• 空白对照应无菌生长，若加菌的培 养基管均生长良好，判该培养基的 灵敏度检查符合规定。
• 试验同时应做空白对照
无菌检查法及其验证
16
培养基说明
• 菌种的要求：不得超过5代。采用适宜的菌种保藏方法 保存，以保证菌种的生物学特性。
• 加菌量:＜100cfu。
无菌检查法及其验证
13
培养基的适用性检查
③ 菌液制备
试验菌
培养基
培养温度
金黄色葡萄球菌 铜绿假单胞菌 枯草芽孢杆菌
营养肉汤
生孢梭菌
硫乙醇酸盐流体
白色念珠球菌 改良马丁培养基
黑曲霉
改良马丁琼脂斜面
供试品的无菌检查法--直接接种法
• 样品直接移入无菌培养基中。 • 每个容器中培养基的用量应符合接种的供试品
体积不得大于培养基体积的10%。 • 同时硫乙醇酸盐流体培养基每管装量不少于
15ml，改良马丁培养基每管装量不少于10ml 。培养基的用量和高度同方法验证试验。 • 每种培养基接种的管数同供试品的检验数量。
• 无菌性检查
①重要性：培养基无菌不合格将导致实验 的假阳性结果。
②检查：每批培养基随机抽取不少于5支 或5瓶，硫乙醇酸盐流体培养基置3035℃培养，改良马丁培养基置23-28℃ 培养，培养14天，应无菌生长。
无菌检查法及其验证
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培养基的适用性检查
• 灵敏度检查 ①菌种 • 硫乙醇酸盐流体培养基
无菌检查法及其验证
8
培养基的制备及装量
• 培养基可按处方制备，亦可使用按该处方生产 的符合规定的脱水培养基。
• 硫乙醇酸盐流体培养基的装量与容器高度的比 例应符合培养结束后培养基氧化层（粉红色） 不超过培养基深度1/2。供试品接种前，培养 基氧化层颜色不得超过培养基深度的1/5，否 则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超 过20分钟），迅速冷却，只限加热一次。
无菌检查法及其验证
6
HTY无菌隔离系统
无菌检查法及其验证
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无菌检查用培养基的种类及用途
• 硫乙醇酸盐流体培养基--培养好氧菌、 厌氧菌
• 改良马丁培养基--培养真菌及好氧细菌
• 选择性培养基--按硫乙醇酸盐流体培养 基或改良马丁培养基的处方及制法，在 培养基灭菌或使用前加入适量的中和剂 或表面活性剂。
• 隔离系统按相关的要求进行验证，其内 部环境的洁净度须符合无菌检查的要求 。
无菌检查法及其验证
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无菌检查的设施、环境、人员
• 规定应定期按《医药工业洁净室（区） 悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法 》的现行国家标准进行洁净度的验证。
• 日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查法及其验证
4
无菌检查的设施、环境、人员
无菌检查法及其验证
无菌检查法概念
• 无菌检查是通过目检微生物在培养基中 的生长来判断结果。
• 无菌检验只能给出该批产品受污染的程 度。
• 无菌检验合格只能说明被测样品无菌， 不能证明整批样品无菌。
无菌检查法及其验证
2
无菌检查的设施、环境、人员
Байду номын сангаас
• 检查环境应在洁净度10000级下的局部 洁净度100级的单项流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守 无菌操作。
无菌检查法及其验证
20
供试品的无菌检查法--薄膜过滤法
• 原理：薄膜过滤法是将供试品通过滤膜，微生物截留 于滤膜上，若有抑菌作用的药品同时使用冲洗液冲洗 滤膜上残留的供试品（如有残留会抑制微生物生长） ，然后，培养滤膜看其是否有微生物生长。
无菌检查法及其验证
9
培养基的储存
• 制备好的培养基应该保存在2-25℃、避光 的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3 周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在 1年内使用。
※应结合实际情况进行验证，以确定培养基 有效期。
无菌检查法及其验证
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培养基的适用性检查
本检查可在供试品的无菌检查前或与供试 品的无菌检查同时进行。